专利名称：用于花卉的花粉管导入方法
技术领域：
本发明涉及花卉育种技术，尤其是利用花粉管通道转基因技术，用于花卉的花粉管导入方法。
背景技术：
20世纪70年代末期，我国学者在远源杂交的基础上，采用授粉时混入异种作物花粉匀浆的方法，发现后代中出现与异种作物相应性状的变异，推测外源DNA可能参与了受精过程。周光宇等结合我国远源杂交的成功经验，从生物化学的角度，提出了远源杂交中存在DNA片段杂交的假设，并在这一假设的基础上，设计了自花受粉后导入外源DNA的花粉管通道转基因技术。其主要原理是受粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、花粉、合子或早期胚胎细胞(王关林，方宏筠，主编，植物基因工程原理与技术，北京科学出版社，1998，304～313；600～601)。这一方法的程序是在受体植株原位进行的，不涉及离体培养技术，主要特点是避开了组织培养再生的过程，对离体组培难度较大的植物导入外源基因具有广泛的应用价值。
自1983年世界上首次获得转基因植株以来，植物遗传转化在多方面取得了较大的突破，发展十分迅速。但迄今为止，世界上获得的转基因植物80％以上是通过采用农杆菌介导法获得的。1981年周光提出花粉管通道转基因技术来，已在水稻、棉花、小麦、玉米等蔬菜和果树等植物上实现外源DNA转化。该方法与传统的农杆菌介导法相比，具有如下几个特点和优势(陈正华，张海燕，王槐，见莽克强主编，农业生物工程，北京化学工业出版社，1998，61～66)(1)由于以具有全能性的生殖细胞直接做为受体细胞，因此具有更强的接受外源DNA的潜能，并且一旦将外源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果。
(2)方法简便，易于操作，可大大缩短育种年限。
(3)它将现代的分子育种(即定向基因改良)与常规育种紧密结合，因而具有广泛的应用价值与前途。
自1981年提出至今，应用这种转基因方法已取得了很多成功的例子。根据花粉管通道技术的不同导入方法，可以分为(1)柱头法又分柱头滴加法和柱头切除法。
柱头滴加法未授粉前，先用外源DNA导入液涂摸柱头，然后人工自花授粉，迅速套袋挂牌做标记。
柱头切除法选当日将开放的花人工自花授粉，在授粉后一段时间剪去柱头，滴上外源DNA，套袋挂牌做标记。
(2)子房注射法选当日将开放的花人工自花授粉1-3d内，用毛细针插入子房下部胚囊附近，借助微量注射器注入外源DNA溶液。
(3)花粉粒携吸入法提前去雄套袋隔离，花粉粒首先用外源DNA导入液处理，使外源DNA吸入花粉粒，然后对受体植物进行人工授粉套袋。
但到目前为止，花粉管通道法多用于作物育种，几乎很少有人用于花卉转基因育种工作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种在受体植株原位进行的缩短育种年限的用于花卉的花粉管通道转基因方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种用于花卉的花粉管导入方法，当花蕾长至2.5～3.0cm时，将花瓣连同雄蕊从花蕾基部整个摘除，只留下花萼包被的雌蕊部分，立即套袋，做为母本等待授粉，分别选取同一品种的异花花粉、不同品种的花粉或同科异属植物的花粉做为父本，在人工授粉时将外源DNA一起加入，利用植物原位的花粉管通道将外源基因导入拟改良受体品种。具体做法是用溶于1×SSC溶液的含有目的基因的质粒与数朵花的花粉混合调成糊状，涂于事先去雄的柱头上(有的处理需剪断柱头)，分别套袋，隔天授1～3次。
本发明利用生物总DNA和含有目的基因查尔酮合酶基因(控制花色的相关基因)的质粒pBI121chsA或pWM101chsA作为供体，通过巧妙的设计使得既看到了表型的改变，又能用现代的PCR技术证实花粉管通道技术在花卉(仙客来)育种上的有效性。
本发明的受体材料为仙客来纯白品种。选用的供体材料为仙客来玫红品种、纯白品种、黄色报春花、含有目的基因查尔酮合酶基因(控制花色的相关基因)的质粒pBI121chsA或pWM101chsA。
本发明的有益效果是在受体植株原位进行的，不涉及离体培养技术，避开了组织培养再生的过程，由于以具有全能性的生殖细胞直接做为受体细胞，因此具有更强的接受外源DNA的潜能，并且一旦将外源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果；该方法简便易于操作，可大大缩短育种年限；它将现代的分子育种(即定向基因改良)与常规育种紧密结合，因而具有广泛的应用价值与前途。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限在以下实施例实施例1受体材料为仙客来纯白品种，供体为仙客来纯白品种、黄色报春花、含有控制花色相关基因--查尔酮合酶基因的质粒pWM101chsA。将选做母本的植株当花蕾长至2.5～3.0cm时，将花瓣连同雄蕊从花蕾基部整个摘除，只留下花萼包被的雌蕊部分，立即套袋，等待授粉；将1×SSC溶液或溶于1×SSC溶液的质粒pWM101chsA与仙客来纯白品种的花粉和黄色报春花的花粉混合调成糊状，涂于柱头上，分别套袋，隔天授1～3次。
将导入外源DNA的植株进行细心养护，在夏季采收得到种子，当年秋季播种。从实生苗生长发育情况看，转化植株生长普遍略慢，长势偏弱，株型也不如对照。转年进入花期后，有三株开花植株的个别花瓣出现了黄斑，证明外源DNA确实存在于受体中。
实施例2受体材料为仙客来纯白品种，供体为仙客来纯白品种、黄色报春花、含有控制花色相关基因--查尔酮合酶基因的质粒pWM101chsA。将选做母本的植株当花蕾长至2.5～3.0cm时，将花瓣连同雄蕊从花蕾基部整个摘除，只留下花萼包被的雌蕊部分，立即套袋，等待授粉；第一天授纯白花粉；第二天剪断柱头，将1×SSC溶液或溶于1×SSC溶液的质粒pWM101chsA与黄色报春花的花粉混合调成糊状，涂于柱头上，分别套袋；第三重复第二天的做法。
将导入外源DNA的植株进行细心养护，在夏季采收得到种子，当年秋季播种。从实生苗生长发育情况看，转化植株生长普遍略慢，长势偏弱，株型也不如对照。转年进入花期后，5株白花植株的个别花瓣出现了黄斑或略显黄色，甚至个别花瓣变成了黄色花瓣。
因为植物自身含有CHSA基因，可通过检测选择标记基因HPT，进而知道外源CHSA基因是否整合。将改变花色的3株植株提取植物总DNA，以HPT基因引物进行PCR扩增，经PCR检测表明，3个样品均呈阳性。表现型的改变和分子检测均说明了外源基因已整合进去了。这些都证明了花粉管导入技术的可行性。
实施例3本发明的受体材料为仙客来纯白品种，供体为仙客来玫红品种、含有控制花色相关基因--查尔酮合酶基因的质粒pWM101chsA或pBI121chsA。将选做母本的植株当花蕾长至2.5～3.0cm时，将花瓣连同雄蕊从花蕾基部整个摘除，只留下花萼包被的雌蕊部分，立即套袋，等待授粉；将溶于1×SSC溶液的质粒pWM101chsA或pBI121chsA与仙客来玫红品种的花粉混合调成糊状，涂于柱头上，分别套袋，隔天授1～3次。
将导入外源DNA的植株进行细心养护，在夏季采收得到种子，当年秋季播种。从实生苗生长发育情况看，转化植株生长普遍略慢，长势偏弱，株型也不如对照。转年进入花期后，3株白花植株的个别花瓣一半变成了桃红色(二乔)，甚至整个花朵完全变成了桃红色。证明外源DNA确实存在于受体中。
综上所述，以仙客来为例，仙客来属于雌雄异熟的花卉，并且具有花多、花期长、易于结实、打子多及易于播种繁殖等特点，利用这一特点将选作母本的植株提前去雄套袋，选用外源DNA和含有目的基因的质粒混合后进行授粉，取得了很好的效果。共得到4400余粒仙客来转化种子，8株白花植株的个别花瓣出现了黄斑或略显黄色，甚至个别花瓣变成了黄色花瓣；3株白花植株的个别花瓣一半变成了桃红色(二乔)，甚至整个花朵完全变成了桃红色。转基因仙客来经PCR检测呈阳性。这些结果都证明了花粉管通道技术在花卉育种上的有效性。
权利要求
1.一种用于花卉的花粉管导入方法，包括以下步骤第一步当花卉的花蕾长至2.5～3.0cm时，将花瓣连同雄蕊从花蕾基部整个摘除，只留下花萼包被的雌蕊部分，立即套袋，做为母本等待授粉；第二步分别选取同一品种的异花花粉、不同品种的花粉或同科异属植物的花粉做为父本，在人工授粉时将外源DNA一起加入，利用植物原位的花粉管通道将外源基因导入拟改良受体品种。
2.根据权利要求1所述的用于花卉的花粉管导入方法，其特征在于所述的第二步的具体做法是用溶于1×SSC溶液的含有目的基因的质粒与数朵花的花粉混合调成糊状，涂于事先去雄的柱头上，分别套袋，隔天授1～3次。
3.根据权利要求1所述的用于花卉的花粉管导入方法，其特征在于所述花卉是仙客来。
4.根据权利要求3所述的用于花卉的花粉管导入方法，其特征在于供体外源DNA选用仙客来玫红品种、纯白品种、黄色报春花、含有目的基因查尔酮合酶基因的质粒pBI121chsA或pWM101chsA。
5.根据权利要求3所述的用于花卉的花粉管导入方法，其特征在于受体材料为纯白品种。
全文摘要
本发明公开了一种用于花卉的花粉管导入方法，当花蕾长至2.5～3.0cm时，将花瓣连同雄蕊从花蕾基部整个摘除，只留下花萼包被的雌蕊部分，立即套袋，做为母本等待授粉，分别选取同一品种的异花花粉、不同品种的花粉或同科异属植物的花粉做为父本，在人工授粉时将外源DNA一起加入，利用植物原位的花粉管通道将外源基因导入拟改良受体品种。本发明在受体植株原位进行，不涉及离体培养技术，避开了组织培养再生的过程，简便易于操作，可大大缩短育种年限，因而具有广泛的应用价值与前途。
文档编号A01H1/02GK1875689SQ20051001370
公开日2006年12月13日 申请日期2005年6月7日 优先权日2005年6月7日
发明者付新生, 赵万苓, 姜世平 申请人:天津市园林绿化研究所