专利名称：高效番茄基因转化方法
所属领域本发明属于农业生物技术领域或植物基因工程领域，尤其是一种高效番茄基因转化方法。
背景技术：
转基因抗衰老、耐贮藏系列番茄品种的培育是由天津农学院和中国农业大学联合研究和开发的项目。从1995年开始由国家自然基金资助，通过基因沉默技术获得转反义ACS和ACC基因耐贮藏番茄新品种T95-1、T96-2、T98-3。2001年又由天津教委资助将乙烯受体蛋白基因-反义NR基因导入番茄获得抗衰老、耐贮藏新品种N2，又相继获得转反义CTR1、ENT1和EIN2基因新品种F1、F2、F3。目前我们已经获得7个品种、28个类型；已经进行了F1代和F2代的观察和筛选；我们曾获得了该转基因品种的环境释放。上述转基因番茄主要表现出抗衰老、耐贮藏、货架期可延长2个多月，抗逆性增强，并保持了品种原有的风味和品质。
我国农产品产后损失十分惊人(损失率在20％)，其主要原因就是品种不耐贮藏、贮藏量和加工量低直接导致我国农产品采后价值很低。仅我国番茄酱生产中加工前的经济损失为3774万元。减少番茄产后损失，可大大提高农民收入。
我国仅番茄的种植面积就达217千公顷，对其种子的总需求量为195吨，而种子每千克的单价为47.06美元，形成了一个充满商机与潜力的广阔市场。
世界上现有100个以上基因的50种农作物基因工程产品被正式批准投入商品化生产。全世界转基因作物推广面积已经从1996年的170万公顷猛增至4420万公顷。其中美国的转基因作物种植面积最广，达到了3030万公顷而我国仅为50万公顷，占1％。
所以，转基因耐贮藏番茄具有质量和价格方面的双重趋势。
在利用农杆菌进行转基因研究中遇到的主要问题是如何提高转化率。影响转化率的因素主要有转化所用的农杆菌的株型、Ti质粒的构建、外植体的再生率，筛选标记的可靠性以及转化过程中外部环境的控制。其中前几个因素在转化研究确立后很难有大的调整和改变，而转化的外部环境可以按照操作者根据实际情况和主观需要作出较大调整。这些调整在提高转化率上往往收效显著，其中有报道的主要有改变农杆菌侵染的浓度，预培养的时间，用化学试剂对农杆菌和外植体进行处理等。本专利通过在番茄转化过程中这些外部环境的改变，找出提高转化率的有效方法和措施，从而建立一套标准的转化体系。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的难题，提供一种高效番茄基因转化方法。该方法采用农杆菌转基因工程技术，通过克隆和反义构建乙烯受体蛋白基因并转化番茄，以此得到抗衰老、耐储藏的番茄。
本发明的目的是这样实现的该高效番茄基因转化方法的步骤为(1).将番茄种子消毒后播种在MS培养基上进行培养，至两片子叶长大；(2).取携带番茄反义乙烯基因的农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基上，在摇床上培养；(3).马铃薯伤流液与农杆菌对番茄子叶外植体进行侵染，在抗性培养基上诱导再生芽；(4).采用IAA以及IBA与农杆菌对番茄子叶外植体进行侵染，在抗性培养基上诱导再生芽；(5).在含有选择标记的分化培养基上筛选转化芽；(6).将该转化芽在伸长培养基内进行长大培养；(7).植入生根培养基进行生根培养；(8).生根移栽；(9).入土栽培。
而且，所述的番茄种子消毒采用含氯离子浓度为2.8的次氯酸钠溶液进行番茄种子消毒，消毒时间为10～20分钟，然后用无菌水冲洗三次；接种到MS培养基上培养的时间为1-3周，培养的环境条件是温度为25～28℃，光照每天12小时左右，光强2500～5000LUX。
而且，所述的在摇床上培养携带番茄反义乙烯基因的农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基上的方法是取携带番茄反义乙烯基因的农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基上，在25～28℃温度条件下，在摇床上以200转/min摇摆48小时，该液体培养基内添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的庆大霉素，待其OD值为0.6时待用。
而且，所述的马铃薯伤流液与农杆菌对番茄子叶外植体进行侵染的方法是取番茄幼嫩组织伤流液经抽滤灭菌后分别稀释1-5倍，与培养过夜地农杆菌一起侵染番茄子叶外植体，浸泡10分钟，然后放在抗性培养基上诱导再生芽。
而且，所述的采用IAA或IBA与农杆菌对番茄子叶外植体进行侵染的方法是用1-5mg/L浓度的IAA以及IBA分别与农杆菌一起侵染番茄子叶外植体，浸泡10分钟，然后放在抗性培养基上诱导再生芽。
而且，在含有选择标记的分化培养基上筛选转化芽采用的方法是将上述处理后的外植体从菌液中取出，用无菌滤纸吸干，将子叶接种到分化培养基上进行共培养，48小时后转入生芽培养基；该分化培养基由MS培养基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等构成；在该分化培养基上放一层滤纸，把该子叶放置在滤纸上，25～28℃温度下的密闭、暗条件下培养48小时取出，然后去掉滤纸，在分化培养基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧变青霉素；在此过程中，子叶的伤口要充分接触培养基，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，昼夜光照，培养2-4周后，产生再生转化芽。
而且，所述的该转化芽在伸长培养基内进行长大培养的方法是将该转化芽切下，在伸长培养基内进行长大培养，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，每天光照培养12小时；该伸长培养基由MS培养基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧变青霉素构成。
而且，所述的植入生根培养基进行生根培养的方法为待再生转化芽生长到2～3cm长度时切下，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，植入生根培养基进行培养，每天光照培养12小时；该生根培养基为MS培养基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧变青霉素构成。
而且，所述的生根移栽为取出再生芽，冲洗掉培养基，将其栽到蛭石培养基内，浇MS营养液，保持每天3～4小时太阳光直射，在25～28℃温度条件下，当生长3～4个叶片时，入土栽培。
具体实施例方式
下面对本发明实施例做进一步详述本发明所述的转化方法由以下步骤构成(1)番茄种子消毒后播种在MS培养基上进行培养，至两片子叶长大。
首先采用含氯离子浓度为2.8的次氯酸钠溶液消毒番茄种子10～20分钟，然后用无菌水冲洗三次，接种到MS培养基上进行培养，培养时间为1-3周，培养的环境条件是温度为25～28℃，光照每天12小时左右，光强2500～5000LUX。
(2)用于转化的农杆菌液的准备取携带番茄反义乙烯基因的农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基上，在25～28℃温度条件下，以200转/min摇摆48小时，该液体培养基内添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的庆大霉素，待其OD值为0.6时待用。
(3)马铃薯伤流液预处理。
取番茄幼嫩组织伤流液经抽滤灭菌后分别稀释1-5倍，与培养过夜的农杆菌一起侵染番茄子叶外植体，浸泡10分钟，放在抗性培养基上诱导再生芽。
(4)生长素预处理。
用1-5mg/L浓度的IAA，IBA分别与农杆菌一起侵染番茄子叶外植体，浸泡10分钟，放在抗性培养基上诱导再生芽。
(5)放在含有选择标记的分化培养基上进行转化芽的筛选。
将上述处理后的外植体从菌液中取出，用无菌滤纸吸干，将子叶接种到分化培养基上进行共培养，48小时后转入生芽培养基。该分化培养基由MS培养基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等构成。在该分化培养基上放一层滤纸，把该子叶放置在滤纸上，25～28℃温度下的密闭、暗条件下培养48小时取出，然后去掉滤纸，在分化培养基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧变青霉素。在此过程中，子叶的伤口要充分接触培养基，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，昼夜光照，培养2-4周后，产生再生转化芽。
(6)将该转化芽在伸长培养基内进行长大培养。
把该转化芽切下，在伸长培养基内进行长大培养，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，每天光照培养12小时。该伸长培养基由MS培养基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧变青霉素构成。
(7).植入生根培养基进行生根培养待再生转化芽生长到2～3cm长度时切下，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，植入生根培养基进行培养，每天光照培养12小时。该生根培养基为MS培养基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧变青霉素构成。
(8)生根移栽。
取出再生芽，冲洗掉培养基，将其栽到蛭石培养基内，浇MS营养液，保持每天3～4小时太阳光直射，在25～28℃温度条件下，当生长3～4个叶片时，入土栽培。
(9)入土栽培。
本发明的优点和积极效果是通过马铃薯伤流液预处理、生长素预处理、转化芽的筛选、伸长培养基等步骤，使番茄的抗衰老基因—反义乙烯基因的转化率大大提高；而且，整个转化工艺比较简单，成本较低，花费时间较少。
下面是本发明的主要实验数据
权利要求
1.一种高效番茄基因转化方法，其特征在于该转化方法的步骤为(1).将番茄种子消毒后播种在MS培养基上进行培养，至两片子叶长大；(2).取携带番茄反义乙烯基因的农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基上，在摇床上培养；(3).马铃薯伤流液与农杆菌对番茄子叶外植体进行侵染，在抗性培养基上诱导再生芽；(4).采用IAA以及IBA与农杆菌对番茄子叶外植体进行侵染，在抗性培养基上诱导再生芽；(5).在含有选择标记的分化培养基上筛选转化芽；(6).将该转化芽在伸长培养基内进行长大培养；(7).植入生根培养基进行生根培养；(8).生根移栽；(9).入土栽培。
2.根据权利要求1所述的高效番茄基因转化方法，其特征在于所述的番茄种子消毒采用含氯离子浓度为2.8的次氯酸钠溶液进行番茄种子消毒，消毒时间为10～20分钟，然后用无菌水冲洗三次；接种到MS培养基上培养的时间为1-3周，培养的环境条件是温度为25～28℃，光照每天12小时左右，光强2500～5000LUX。
3.根据权利要求1所述的高效番茄基因转化方法，其特征在于所述的在摇床上培养携带番茄反义乙烯基因的农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基上的方法是取携带番茄反义乙烯基因的农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基上，在25～28℃温度条件下，在摇床上以200转/min摇摆48小时，该液体培养基内添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的庆大霉素，待其OD值为0.6时待用。
4.根据权利要求1所述的高效番茄基因转化方法，其特征在于所述的马铃薯伤流液与农杆菌对番茄子叶外植体进行侵染的方法是取番茄幼嫩组织伤流液经抽滤灭菌后分别稀释1-5倍，与培养过夜地农杆菌一起侵染番茄子叶外植体，浸泡10分钟，然后放在抗性培养基上诱导再生芽。
5.根据权利要求1所述的高效番茄基因转化方法，其特征在于所述的采用IAA或IBA与农杆菌对番茄子叶外植体进行侵染的方法是用1-5mg/L浓度的IAA以及IBA分别与农杆菌一起侵染番茄子叶外植体，浸泡10分钟，然后放在抗性培养基上诱导再生芽。
6.根据权利要求1所述的高效番茄基因转化方法，其特征在于在含有选择标记的分化培养基上筛选转化芽采用的方法是将上述处理后的外植体从菌液中取出，用无菌滤纸吸干，将子叶接种到分化培养基上进行共培养，48小时后转入生芽培养基；该分化培养基由MS培养基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等构成；在该分化培养基上放一层滤纸，把该子叶放置在滤纸上，25～28℃温度下的密闭、暗条件下培养48小时取出，然后去掉滤纸，在分化培养基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧变青霉素；在此过程中，子叶的伤口要充分接触培养基，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，昼夜光照，培养2-4周后，产生再生转化芽。
7.根据权利要求1所述的高效番茄基因转化方法，其特征在于所述的该转化芽在伸长培养基内进行长大培养的方法是将该转化芽切下，在伸长培养基内进行长大培养，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，每天光照培养12小时；该伸长培养基由MS培养基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧变青霉素构成。
8.根据权利要求1所述的高效番茄基因转化方法，其特征在于所述的植入生根培养基进行生根培养的方法为待再生转化芽生长到2～3cm长度时切下，在25～28℃温度条件下，光强2500～5000LUX的条件下，植入生根培养基进行培养，每天光照培养12小时；该生根培养基为MS培养基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧变青霉素构成。
9.根据权利要求1所述的高效番茄基因转化方法，其特征在于所述的生根移栽为取出再生芽，冲洗掉培养基，将其栽到蛭石培养基内，浇MS营养液，保持每天3～4小时太阳光直射，在25～28℃温度条件下，当生长3～4个叶片时，入土栽培。
全文摘要
本发明属于农业生物技术领域或植物基因工程领域的一种高效番茄基因转化方法。主要技术特点是该方法采用农杆菌转基因工程技术，采用克隆和反义构建乙烯受体蛋白基因并转化番茄，通过马铃薯伤流液预处理、生长素预处理、转化芽的筛选、伸长培养基等步骤，使番茄的抗衰老基因—反义乙烯基因的转化率大大提高，以此得到抗衰老、耐储藏的番茄；而且，整个转化工艺比较简单，成本较低，花费时间较少。
文档编号A01H1/00GK1871896SQ20051001357
公开日2006年12月6日 申请日期2005年6月1日 优先权日2005年6月1日
发明者杨静慧, 刘艳军, 罗云波, 张伟玉, 杨恩芹 申请人:天津农学院