专利名称：抗衰老番茄育种方法
所属领域本发明属于农业生物技术领域或植物基因工程领域，尤其是一种抗衰老番茄育种方法。
背景技术：
目前使用的番茄育种技术是常规的杂交育种。该方法的缺点是1、在传统育种技术中，农作物的新品种主要通过有性杂交、品种选育，以及自然界产生的突变再通过选育获得。这个过程只能在同种内进行，就是说水稻只能在水稻中进行，小麦只能在小麦中进行，不能跨越这个界限。与转基因育种技术有所不同的是，非同种的基因不能相互转化。转基因育种技术是通过一定的生物的或者物理的方法，把外源基因导入到受体作物中去，以获得新品种。所以从某种角度来讲，它不受物种的限制，可以跨越物种，转移遗传物质。不但可以跨越不同的种类，甚至属、纲、门、界等这样大的生物之间的门槛全部能跨越。就是说可以把动物的相关基因转移到植物中去，也可以把微生物的基因转移到农作物中去。所以它的有效性和它的技术的广泛性是常规育种无法比拟的。
2、传统育种过程目的性不是很强，经验和运气成分比较大。通过选择，有时候自然界也会产生自发突变，然后通过人工选择，有可能获得一个植物的新品种。而转基因技术目的性非常强，你可以有预见性地转移一个基因。之后，这个转基因植物能够获得什么性状都完全是可预见的。
3、常规育种周期相对较长，花费相对要高一些。
4、精确性差。
5、杂交育种对亲本的选择要求高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种抗衰老番茄育种方法。该方法采用番茄衰老基因沉默育种技术即反义构建乙烯基因技术，通过调控乙烯信号转导中基因产物的表达，实现番茄的抗衰老和耐储藏。
本发明的目的是这样实现的该番茄抗衰老基因育种方法，其育种方法为
(一)该基因克隆的步骤为(1)番茄的乙烯基因的RNA的提取；(2)通过该RNA的反转录基因cDNA的合成；(3)对合成的cDNA的PCR扩增；(4)乙烯基因-PCR扩增基因的分离和纯化；(5)乙烯基因-PCR扩增基因的克隆；(6)基因转化大肠杆菌；(7)克隆基因的筛选；(8)克隆基因的酶切鉴定；(9)基因序列的分析技术；(二)该基因构建的步骤为(1)带特异性粘性末端的乙烯基因的大量富积A乙烯基因/TEM-T克隆的大量培养；B大量提取乙烯基因/TEM-T质粒；C用SstI和BamHI酶切乙烯基因/TEM-T质粒；D电泳分离该酶切产物；E从胶上纯化带特异性粘端的乙烯基因；F浓缩该基因；(2)带有特异性粘性末端的质粒PCB302-3的大量富积A大量培养带有PCB302-3质粒的菌株；B大量提取PCB302-3质粒；C用SstI和BamHI酶切PCB302-3质粒；D电泳分离带有特异性粘性末端的质粒PCB302-3；E纯化；F浓缩；(3)构建A反向连接带有特异性粘性末端的反义乙烯基因和PCB304-3质粒；B转化感受态细胞EcolI.大肠杆菌；C在抗性培养基上筛选；D对抗性单克隆进行分别培养；E分别提取质粒和酶切鉴定；F测序；
G转化农杆菌和在抗性培养基上筛选；(三)反义乙烯基因转化番茄(四)转反义乙烯基因番茄植株的筛选其特征在于在对合成的cDNA的PCR扩增步骤时，根据番茄的抗衰老基因的基因序列以及PRIMER3软件设计引物，该引物包括全长的基因片段两端带有酶切位点和根据基因内部保守序列设计的一对引物，这一对引物建立如下PCR反应H2O加至25微升cDNA 1-3微升10XBuffer 2.5微升dNTP 0.2-0.8微升Tag0.1-0.3微升Mg+1-5微升引物 10.2-0.5微升引物 20.2-0.5微升上述反应的反应条件1X95度 3分钟28-40X95度 20-30秒45-70度 2-3分钟72-76度 1-2分钟1X72度 10分钟1X4度 ∞。
而且，在对转反义乙烯基因番茄植株筛选时，采用的步骤是a.卡那霉素的筛选；b.转基因再生植株的Southern-DNA检测杂交检测；c.Nouthern-RNA检测；d.转基因F1代和F2代果实发育和成熟性状观察；e.转基因F1代和F2代植株生长性状表型观察；f.转基因F1代和F2代植株抗衰老生理特性的观测；g.转基因F1代和F2代果实抗衰老和耐贮藏生理特性的观测；
h.转基因F1代和F2代植株解剖特性观察。
而且，所述的在对转反义乙烯基因番茄植株筛选时的转基因再生植株的Southern-DNA杂交检测是以35S启动子的DNA片断为模板，用随机引物标记法进行标记；提取1-4共四株再生番茄植株及对照植株(未转化番茄植株基因组DNA)叶的基因组总DNA，在点样仪中点样，然后与含α-32P放射性标记的35S启动子的DNA进行杂交。
而且，所述的在对转反义乙烯基因番茄植株筛选时发Nouthern-RNA检测是以CK1为阳性对照，CK2为阴性对照，提取番茄转基因植株及对照植株叶的基因组总RNA，用紫外分光光度计定量，取10μg点在样仪上点样，然后与含α-32P放射性标记的NR基因片段进行杂交。
而且，所述的CK1为阳性对照是指NR基因DNA，CK2为阴性对照是指未转化番茄植株基因组RNA。
本发明的优点和积极效果是(1)是使衰老基因沉默，减少和抑制衰老基因的表达，是一种相对简单的、快速和高效率的育种方法，(2)结合高效、可靠的抗衰老基因筛选技术可加速番茄抗衰老、耐贮藏育种，获得抗衰老、耐贮藏新品种。
(3)是先进的基因工程育种技术。
具体实施例方式
下面对本发明实施例做进一步详述本发明所述的抗衰老基因—反义乙烯基因或乙烯基因沉默技术，包括反义NR、反义ACS、反义ACC等基因，其育种方法包括以下几大步骤一、抗衰老乙烯基因的克隆1.RNA的提取(1)将番茄的植株根系取样、清洗并在液氮下磨成粉末形成基因样品；(2)将该基因样品放入预热的BUFFER中，采用苯酚氯仿提取2次，取上清液，加LiCl，孵化过夜；(3)用乙醇清洗沉淀三次，然后真空干燥；(4)溶解该沉淀于去离子水中，加NaAce和乙醇沉淀过夜；(5)离心去上清液，溶解该沉淀于去离子水中，形成RNA溶液。
这种RNA的提取方式可以保证所提取的RNA的高质量的和高浓度，是合成高质量的cDNA的前提。
2.cDNA的合成(1)将RNA溶液和引物OLIGODT放入离心管中，在70℃下反应5分钟，然后冰点冷却；(2)加DNTP、RT酶、BUFFER和水，在42℃下反应60分钟，冰点冷却；(3)在85℃反应5分钟，合成高质量和高浓度的cDNA。
3.进行PCR扩增根据已知物种的基因保守序列和PRIMER3软件设计引物，包括基因片段两端的酶切位点和根据基因内部保守序列设计的一对引物。建立下列反应H2O 加至25微升cDNA 1-3微升10XBuffer2.5微升dNTP 0.2-0.8微升Tag 0.1-0.3微升Mg+ 1-5微升引物 10.2-0.5微升引物 20.2-0.5微升。
上述反应的反应条件1X95度 3分钟28-40X95度 20-30秒45-70度 2-3分钟72-76度 1-2分钟1X72度 10分钟1X4度 ∞。
说明根据反应产物片段的长短改进反应条件。其中最主要的是模板浓度，即要求CDNA的浓度和质量要高。然后调整镁离子浓度和退火温度和时间。通常退火温度较引物设计的TM值高5度。产物较短时主要延长退火时间和增加镁离子浓度。无产物时，主要增加模板浓度。高背景产物较多，而无特异性带时，主要提高退火温度和时间，降低模板浓度。
4.乙烯基因-PCR扩增基因的分离和纯化用0.7％琼脂糖进行凝胶电泳，以分离扩增出的特异性PCR产物(反义乙烯基因-PCR扩增基因)。用解剖刀切下基因的特异性片段，用纯化柱回收和纯化特异性条带。
5.乙烯基因-PCR扩增基因的克隆采用PGEM-T试剂盒进行克隆。
将下列试剂加入离心管中试剂名称标准反应阳性对照背景对照2XBUFFER5微升 5微升 5微升载体1微升 1微升 1微升PCR产物 1-3微升 / /对照DNA / 2微升 /T4连接酶1微升 1微升 1微升H2O加至10微升 加至10微升 加至10微升将上述试剂充分混合，反应过夜，得乙烯基因。
6.基因转化大肠杆菌用CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞分别加感受态细胞于乙烯基因/PGEM-T质粒和水及PBLUE质粒中，冰点反应42度热击45秒，冰点冷却；转入SOC培养基中培养，37度下培养1小时；放培养物于抗性平板中培养和筛选，37度过夜培养。
7.克隆基因的筛选挑取白色单克隆，分别进行抗性平板的培养和液体培养，提取质粒。
8.克隆基因的酶切鉴定电泳分析质粒的大小选择大的质粒进行酶切鉴定，选择特异性酶酶切该质粒，跑电泳，检查带的长度。对符合条件的基因进行下一步骤。
9.基因序列的确认。
通过酶切分析筛选出4个克隆基因进行测序分析。并将该基因序列与基因银行的已知物种一番茄抗衰老基因的序列进行比较，分析其保守区，对选择保守区一致的一个克隆基因用于构建。
以上是对番茄抗衰老基因进行了克隆，并选择出了进行下一步构建的一个基因克隆。
二、进行所克隆的乙烯基因的反向构建。
构建包括如下步骤
1.带特异性粘性末端的乙烯基因的大量富积(1)将乙烯基因/TEM-T克隆基因在培养液内大量繁殖。
(2)大量提取法提取乙烯基因/TEM-T质粒。
(3)用SstI和BamHI酶切乙烯基因/TEM-T质粒，反应体积需要扩大到100微升，切1-5微升的质粒。
反应用双酶切方式如下10X BUFFER 10微升SstI酶 1微升BamHI酶 1微升乙烯基因/TEM-T质粒 5微升10X BSA 10微升H2O 加至100微升该反应于37℃下培养过夜，得到PCB302质粒。
说明带有不同酶切位点的粘端克隆是效率最高的克隆，PCB302质粒的由于设计了2对保护碱基，才保证了粘端连接和克隆、构建的正常进行。
(4).乙烯基因的分离和纯化。
采用0.7％琼脂糖进行凝胶电泳，分离出带有粘性末端的乙烯基因产物。用解剖刀切下该特异性片段的基因，用纯化柱回收和纯化该特异性条带基因。
(5)乙烯基因的浓缩。
将所分离和纯化的乙烯基因用NaAC和乙醇沉淀过夜，离心、去上清液，真空干燥沉淀、加水备用，得到高浓度的粘端乙烯基因。
2.带有特异性粘性末端的质粒PCB302-3的大量富积(1)大量培养PCB302-3质粒，方法同乙烯基因/TEM-T。
(2)大量提取PCB302-3质粒，方法同乙烯基因/TEM-T。
(3)用SstI和BamHI酶切PCB302-3质粒，方法同乙烯基因/TEM-T。
(4)电泳分离和纯化带有特异性粘性末端的PCB302-3质粒，方法同乙烯基因/TEM-T。
(5)浓缩，方法同乙烯基因/TEM-T。
3.反义乙烯基因/PCB302-3质粒的构建。
(1)用带有粘性末段的DNA产物克隆方法反向连接带有特异性粘性末端的乙烯基因和PCB304-3质粒。
(2)转化感受态细胞EcolI.大肠杆菌，方法同上。
(3)在含有卡那霉素的抗性培养基平板上培养和筛选。
(4)对抗性单克隆在含有30-100微升卡那霉素/毫升液体培养上进行分别的培养。
(5)分别提取质粒和酶切鉴定。用少量提取法提取质粒，用特异性酶进行酶切鉴定。
(6)测序。对酶切正确的克隆质粒进行测序鉴定。
(7)转化农杆菌和在抗性培养基上筛选。制备农杆菌感受态细胞，用电转化法将鉴定正确的克隆质粒转化入农杆菌感受态细胞。
(8)在抗性培养基上筛选，得到构建好的反义乙烯基因/PCB302质粒。
三、反义乙烯基因转化番茄。
该反义乙烯基因的转化方式是普通的基因转化技术，在此不再赘述；四、转反义乙烯基因番茄植株的筛选1.卡那霉素的筛选2.转基因再生植株的Southern-DNA检测杂交检测以35S启动子的DNA片断为模板，用随机引物标记法进行标记。提取1-4共四株再生番茄植株及对照植株(未转化番茄植株基因组DNA)叶的基因组总DNA，在点样仪中点样，然后与含α-32P放射性标记的35S启动子的DNA进行杂交。
3.Nouthern-RNA检测CK1为阳性对照(NR基因DNA)，CK2为阴性对照(未转化番茄植株基因组RNA)，提取番茄转基因植株及对照植株叶的基因组总RNA，用紫外分光光度计定量，取10μg点在样仪上点样，然后与含α-32P放射性标记的NR基因片段进行杂交。
4.转基因F1代和F2代果实发育和成熟性状观察将通过Kan的抗性培养基上筛选的芽及根的筛选的番茄再生植株进行幼苗锻炼后，定植于花盆中，进行园艺及转基因性状表型观察。包括开花期、结果期(座果期、果实绿熟期、粉红期、全红期、过熟期)。
5.转基因F1代和F2代植株生长性状表型观察植株生长量、株高、茎粗、分枝数、茎节数、节间长。乙烯胁迫下的幼苗叶片黄化指数、6.转基因F1代和F2代植株抗衰老生理特性的观测观测电解质外渗率％(番茄叶片细胞膜透性)、蒸腾作用mM/m2s、气孔导度mM/m2s、呼吸作用μM/m2/s、细胞间二氧化碳浓度mg/L。
7.转基因F1代和F2代果实抗衰老和耐贮藏生理特性的观测观测果实乙烯的含量变化、果实硬度变化、果柄拉力变化、果实电解质外渗率％、果实耐贮藏特性(不同时期的、不同条件下的腐烂率)、果实品质变化(总糖含量变化、维生素C含量变化、果实总酸含量变化)。
8.转基因F1代和F2代植株解剖特性观察观测花粉粒形态、萌芽率、花器官的发育等。
通过以上步骤，即可以培育出抗衰老、耐贮藏的番茄新品种。
权利要求
1.一种抗衰老番茄育种方法，其育种方法为(一)该基因克隆的步骤为(1)番茄的乙烯基因的RNA的提取；(2)通过该RNA的反转录基因cDNA的合成；(3)对合成的cDNA的PCR扩增；(4)乙烯基因-PCR扩增基因的分离和纯化；(5)乙烯基因-PCR扩增基因的克隆；(6)基因转化大肠杆菌；(7)克隆基因的筛选；(8)克隆基因的酶切鉴定；(9)基因序列的分析技术；(二)该基因反向构建的步骤为(1)带特异性粘性末端的乙烯基因的大量富积A乙烯基因/TEM-T克隆的大量培养；B大量提取乙烯基因/TEM-T质粒；C用SstI和BamHI酶切乙烯基因/TEM-T质粒；D电泳分离该酶切产物；E从胶上纯化带特异性粘端的乙烯基因；F浓缩该基因；(2)带有特异性粘性末端的质粒PCB302-3的大量富积A大量培养带有PCB302-3质粒的菌株；B大量提取PCB302-3质粒；C用SstI和BamHI酶切PCB302-3质粒；D电泳分离带有特异性粘性末端的质粒PCB302-3；E纯化；F浓缩；(3)构建A反向连接带有特异性粘性末端的乙烯基因和PCB304-3质粒；B转化感受态细胞EcolI.大肠杆菌；C在抗性培养基上筛选；D对抗性单克隆进行分别培养；E分别提取质粒和酶切鉴定；F测序；G转化农杆菌和在抗性培养基上筛选；(三)反义乙烯基因转化番茄(四)转反义乙烯基因番茄植株的筛选其特征在于在对合成的cDNA的PCR扩增步骤时，根据番茄的抗衰老基因的基因序列以及PRIMER3软件设计引物，该引物包括全长的基因片段两端带有酶切位点和根据基因内部保守序列设计的一对引物，这一对引物建立如下PCR反应H2O加至25微升cDNA 1-3微升10XBuffer 2.5微升dNTP 0.2-0.8微升Tag0.1-0.3微升Mg+1-5微升引物1 0.2-0.5微升引物2 0.2-0.5微升上述反应的反应条件1X95度3分钟28-40X95度20-30秒45-70度 2-3分钟72-76度 1-2分钟1X72度10分钟1X4度 ∞。
2.根据权利要求1所述的抗衰老番茄育种方法，其特征在于在对转反义乙烯基因番茄植株筛选时，采用的步骤是a.卡那霉素的筛选；b.转基因再生植株的Southern-DNA检测杂交检测；c.Nouthern-RNA检测；d.转基因F1代和F2代果实发育和成熟性状观察；e.转基因F1代和F2代植株生长性状表型观察；f.转基因F1代和F2代植株抗衰老生理特性的观测；g.转基因F1代和F2代果实抗衰老和耐贮藏生理特性的观测；h.转基因F1代和F2代植株解剖特性观察。
3.根据权利要求1所述的抗衰老番茄育种方法，其特征在于所述的在对转反义乙烯基因番茄植株筛选时的转基因再生植株的Southern-DNA杂交检测是以35S启动子的DNA片断为模板，用随机引物标记法进行标记；提取1-4共四株再生番茄植株及对照植株(未转化番茄植株基因组DNA)叶的基因组总DNA，在点样仪中点样，然后与含α-32P放射性标记的35S启动子的DNA进行杂交。
4.根据权利要求3所述的抗衰老番茄育种方法，其特征在于所述的在对转反义乙烯基因番茄植株筛选时Nouthern-RNA检测是以CK1为阳性对照，CK2为阴性对照，提取番茄转基因植株及对照植株叶的基因组总RNA，用紫外分光光度计定量，取10μg点在样仪上点样，然后与含α-32P放射性标记的NR基因片段进行杂交。
5.根据权利要求3所述的抗衰老番茄育种方法，其特征在于所述的CK1为阳性对照是指NR基因DNA，CK2为阴性对照是指未转化番茄植株基因组RNA。
全文摘要
本发明属于农业生物技术领域或植物基因工程领域的一种抗衰老番茄育种方法。该方法采用番茄衰老基因沉默育种技术即反义构建乙烯基因技术，通过调控乙烯信号转导中基因产物的表达，使衰老基因沉默，减少和抑制衰老基因的表达，结合高效、可靠的抗衰老基因筛选技术可加速番茄抗衰老、耐贮藏育种，从而获得抗衰老、耐贮藏新品种，是一种先进的基因工程育种技术。
文档编号A01H1/00GK1871895SQ20051001357
公开日2006年12月6日 申请日期2005年6月1日 优先权日2005年6月1日
发明者杨静慧, 刘艳军, 罗云波, 张伟玉, 杨恩芹, 刘玉冬, 柳树梧, 李建科 申请人:天津农学院