专利名称：：利用分子标记累加高色素基因hp1和hp2的番茄育种方法
技术领域：
：-本发明属于农业育种。特别涉及利用分子标记累加高色素基因hpl和hp2的番茄育种方法。技术背景-最近的研究结果表明，番茄果实中的番茄红素具有特殊的生理功能。在所有的植物类胡萝卜素中，番茄红素清除单线态氧的能力最高，是目前常用的抗氧化剂维生素E的100倍。增加番茄红素的摄入量能有效地降低多种慢性疾病以及癌症的发病率，人体血清中番茄红素的浓度与胃肠道癌、前列腺癌、胰腺癌、宫颈癌等的发生率呈负相关。但人体自身不能合成番茄红素，番茄果实及其制品是人类摄取番茄红素的主要来源。遗憾的是，普通番茄品种中的番茄红素含量较低，一般每公斤鲜重的番茄只含50mg左右的番茄红素，目前最优良的加工番茄品种的番茄红素含量也只达到150mg/公斤鲜重。而根据中华人民共和国农业行业标准NY/T431-2000的规定，高浓度番茄酱中的番茄红素含量应不低于400mg/kg。因此，无论是加工企业还是消费者，都期待高番茄红素的新品种问世。经过广泛深入的研究，发现位于番茄第2和第1染色体上的隐性基因hpl和hp2具有调节光合色素信号传递的能力，在纯合状态下分别能使番茄果实的类胡萝卜素总量提高20%-40%左右。但hpl和hp2突变体的形态特征非常相似，而且容易受到显性等位基因的抑制，采用常规技术很难把它们聚合在同一个基因型中。利用分子标记技术可以有效地鉴别目标基因，实现目标基因的累加和聚合。本方法是以hpl和hp2的特异性分子标记筛选为核心，以分子标记辅助选择为基础，把hpl和hp2聚合在不同的番茄自交系中，培育出番茄红素含量大幅度提高的番茄新品种。这类品种可以有效地降低番茄酱加工过程中的能耗，提高工作效率，具有非常广阔的市场前景和巨大的经济效益。
发明内容针对传统技术难以对高色素基因hpl和hp2进行累加的问题，发明人进行了大量的研究工作，最终筛选出对hpl、hp2基因以及显性等位基因Hpl具有高度特异性的分子标记，以它们的分子标记为依据，可以准确地确定杂交后代单株中是否含有hpl和hp2以及hp基因的结合状态，从而筛选出同时含有hpl和hp2的单株，在短时间内实现这2个基因的聚合和纯化，进而选育出番茄红素含量大幅度提高的番茄新品种。本发明旨在提供一种科学高效的分子标记辅助育种方法，通过该方法加速高色素基因hpl和hp2的聚合，实现提高新品种番茄红素含量的目的。本利用分子标记累加高色素基因hpl和hp2的番茄育种方法1)以隐性突变基因hpl和hp2的分子标记为依据，从分离群体中筛选出同时含有hpl和hp2的单株，进行杂交、回交或自交，保证后代群体中有一部分植株同时含有hpl和hp2。2)以hpl和hp2的分子标记为依据，只能确定植株是否同时含有这2个基因，无法确定这2个基因的结合状态。结合显性等位基因Hpl和Hp2的分子标记，就能把杂合基因型剔除掉，剩下的单株应该是含有纯合hpl和hp2的单株。2、对入选单株的自交后代，再次以显性等位基因Hpl和Hp2的分子标记为依据进行鉴定，以确认上代入选单株的hpl和hp2处于纯合状态。本发明之目的通过如下的技术方案来实现-(1)隐性突变基因hpl和显性等位基因Hpl特异性分子标记的筛选从GenBank(http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/Genbank/)中搜索到hpi的cDNA序列编号为AY531660、DNA序列编号为AY531661，比较突变基因hpl和对应等位基因Hpl的DNA序列，发现在功能表达区的11090位点，发生了T和A的置换，隐性突变基因hpl在11090位置为T，野生型等位基因Hpl在11090位置是A。以突变位点T为目标设计上游引物，把T放在上游引物5'端的不同位置，突变位点分别位于上游引物的第一及倒数第一和第五位，并分别命名为hpl1090、11090(1)、11090(5)(表l)，利用公用的引物设计软件Primer3(http:〃www-genome,wi.mit.edu)设计下游引物，获得下游引物的序列为tcaggctggagattgagct(命名为hpll337right)。用这个下游引物和不同的上游引物配对进行聚合酶链式反应(PCR)，经过反复的试验和比较，最后成功地筛选出了对突变位点T具有高度专化性的上游引物及其配套的反应条件。表l:番茄红素hpl基因SNP的引物上游引物下游引物hpl1090fatgcttttgtcttcattggc11090(5)CCATATCATACCTAgAC;TATgC11090(1)CCATATCATACCTAgACI*hpll337righttcaggctggagattgagctt注'为突变位点。设计的三个上游引物中11090(1)11090(5)两个引物在多次试验中扩增出了目的条带，扩增产物为264bp。反应的退火温度为53.5°C，高于该温度无扩增产物，低于该温度则对突变体和野生型没有特异性(表2)。因此，上游引物突变位点位于倒数第1和第5的引物能扩增出目的条带，能有效地区分出突变体和野生型的番茄植株。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>51+++++++53+++++++53.5++++十_-54-/+-/+-/+—--—注+表示有扩增产物，-表示无扩增产物，-A表示扩增产物不稳定。Hpl特异性引物的筛选用同样的方法设计对野生型基因位点特异的引物，将发生突变的位点设计在位于上游引物的倒数第五位ccatatcatacctagactatgc并命名为hplw5。下游引物为caccaccagaaataggcaact并命名为Hp卜194。对扩增条件进行优化和筛选最终摸索出最适的退火温度为59.5度(表3)。扩增产物的大小为194bp。表3:hplw5_加1-194对引物在不同退火温度下？0^结果退火温度番茄基因突变型(hpl)_野生型(Hpl)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>注+表示有扩增产物，-表示无扩增产物。(2)隐性突变基因hp2和显性等位基因Hp2特异性分子标记的筛选Hp2基因定位在第一染色体上，是去黄化基因("￡7"的同源基因。从GenBank中搜索到hp2的DNA序列编号为AJ224356和AJ224357，比较突变基因hp2和对应等位基因Hp2的DNA序列，发现在功能表达区的8510处位点，发生了T和A的置换，隐性突变基因hp2在8510位置为T,野生型等位基因Hp2在8510位置是A。根据上述hpl突变位点标记的方法，以突变位点T为目标设计上游引物，把T放在上游引物5'端的不同位置，利用公用的引物设计软件Primer3设计下游引物，获得下游引物的序列(表4)。表4:番茄红素hp2基因SNP的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注'为突变位点。与hpl基因SNP的检测结果类似，设计的三个上游引物中hp(1)和hp(5)两个引物在多次试验中扩增出目的条带，产物大小为334bP，反应的退火温度为49°C，高于此温度无扩增产物，低于该温度则对突变体和野生型没有特异性(表5)。上游引物突变位点位于倒数第1和第5的引物匀能扩增也目的条带，能有效地区分出突变体和野生型的番莉植株。表5hp(l)lhp(5)在不同退火温度下PCR结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注+表示有扩增产物，-表示无扩增产物。采用相同原理，筛选出对Hp2具有特异性的分子标记，其分子量为390bp，退火温度为53。C。(3)把hpl和hp2聚合在同一个基因型中的技术路线A、以hpl和hp2的分子标记为依据进行回交转育用分别含有纯合hpl和纯合hp2的自交系相互杂交，获得同时含有hpl和hp2的Fl杂交种，以该杂交种为供体、以农艺性状优良的自交系P为受体杂交，后代中分离出4种基因型，即(+/+，+/+)、(+/hpl,+/+)、(+/+，+/hp2)、(+/hpl,+/hp2)。用hpl和hp2的分子标记进行检测，同时出现这2个基因分子标记的个体必然是目标基因型(+几。1，+^^2)。以该基因型为母本，用受体自交系为父本进行回交，回交后代也会出现4种基因型，其中目标基因型(+/1^1，+/^2)可以用hpl和hp2的分子标记检测出来。再以该基因型为母本进行回交和分子标记筛选，如此连续进行3-4次，即可得到农艺性状与受体自交系P基本相同、但同时含有hpl和hp2的基因型P(+/hpl,+/hP2)。B、以Hpl和Hp2的分子标记为依据，从自交后代中剔除杂合基因型根据独立分配定律，(+^^1，+/}^2)的自交后代分离出9种基因型，首先利用hpl和hp2特有的分子标记把同时含有这2个基因的4种基因型筛选出来，它们的遗传构成及其在分离后代的比例为l/4(+/hpl,+/hp2)，l/8(hpl/hpl，+/hp2)，1/8(+/hpl,hp2/hp2)，1/16(hpl/hpl,hp2/hP2)。这4种基因型在分离后代中所占的总比例为9/16，也就是利用hpl和hp2的分子标记可以有50%以上的机会筛选出目标基因型。在这4种基因型中，以Hpl的分子标记为依据，把基因型(+/}^1,+/1^2)和(+/}^1,1^2/[^2)筛选出来，再以Hp2的分子标记为依据，从剩下的群体中把基因型(+/hpl，hp2/hp2)剔除，最后留下来的个体应是目标基因型(hpl/hpl,hp2/hp2)。目标基因型含有2个纯合的高色素基因hpl和hp2，它可以作为供体自交系为其它自交系的改良提供高色素基因源。技术路线示意图(hpl/hpl)X(hp2/hp2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>注P代表番茄自交系，(hpl/hpl)代表含有纯合hpl基因的亲本，|(+/hpl,+/hP2)|代表入选的单株。本发明具有以下优点和特点1.该技术体系即等位基因特异性PCR技术具有特异性高、重复性好以及费用低廉等优点。将其应用到植物的分子育种中可以加速育种世代，节约时间和人力。由于这样的分子标记实际上就是功能基因本身局部片断的扩增结果，所以能非常可靠地直接鉴别该功能基因，分子标记与目标基因之间的交换值为零，具有很好的实际应用*效果。2.以分子标记为依据，可以准确地确定杂交后代单株中是否含有hpl和hp2以及hp基因的结合状态，从而筛选出同时含有hpl和hp2的单株，在短时间内实现这2个基因的聚合和纯化，进而选育出番茄红素含量大幅度提高的番滞新品种。具体实施例方式下面通过具体实施例，进一步详细介绍本发明。实施例1LA3004和LA3006分别为含有hpl和hp2的遗传资源，里格尔87-5为新疆大面积推广的加工番茄品种。首先让LA3004和LA3006杂交，获得同时含有hpl和hp2的杂交种Fl(hpl+hp2)，然后以里格尔87-5为母本，以杂交种F1(hpl+hp2)为父本进行杂交，获得三交种群体P/F1(hpl+hp2)。三交种群体是一个分离群体，由(+/+，+/+)、(+/hpl，+/hp2)、(+/+，+/hp2)和(+/hpl,+/+)等4种基因型组成。分单株提取DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，以hpl和hp2的分子标记为依据，把同时含有hpl和hp2的基因型(+/hpl，+/hp2)鉴别出来，移栽到温室中，开花期与里格尔87-5进行回交，获得回交群体BC1，BC1中同样包括了4种不同的基因型。再次以分子标记为依据，把同时含有hpl和hp2的单株筛选出来，移栽到温室中，开花期又与里格尔87-5回交，获得回交群体BC2。如此再回交l次，获得回交群体BC3。利用分子标从BC3中筛选出同时含有hpl和hp2的基因型，移栽到温室中让其自交，获得种子量充足的自交后代群体S1。自交后代群体S1中含有9种基因型。首先利用hpl和hp2的分子标记，把同时含有hpl和hp2的基因型鉴别出来，这类基因型占群体总数的9/16。然后以显性等位基因Hpl和Hp2的分子标记为依据，把含有Hpl和Hp2的基因型剔除，剩下的基因型应该是含有纯合hpl和hp2的目标基因型。把目标基因型(hpl/hpl，hp2/hp2)移栽到温室中进行自交，获得自交株系S2。以Hpl和Hp2的分子标记为依据，对S2株系中的单株进行检测。只要检测到Hpl或Hp2的分子标记，说明Sl代当选的单株不是目标基因型(hpl/hpl，hp2/hp2)。经过确认的S2株系既拥有与轮回亲本里格尔87-5几乎相同的遗传背景和农艺性状，又拥有2对纯合的高色素基因hpl和hp2，其番茄红素含量显著地高于轮回亲本。如果没有分子标记，通过杂交和回交，也能把hpl和hp2聚合到同一个品种中，但很难确定hpl和hp2的纯合状态，因为5种基因型(hpl/hpl，+/hp2)、(hpl/hpl，+/+)、(+/hpl，hp2/hp2)、(+/+，hp2/hp2)禾口(hpl/hpl，hp2/hp2)的表现型特征都是相同的。如果hpl或hp2处于杂合状态，它对番茄红素积累的促进作用就得不到发挥，无法利用hpl和hp2的协同作用大幅度提高番茄红素的含量。权利要求1.一种利用分子标记累加高色素基因hp1和hp2的番茄育种方法，其特征在于通过如下的技术方案来实现(1)隐性突变基因hp1和显性等位基因Hp1特异性分子标记的筛选从GenBank--http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank中搜索到hp1的cDNA序列编号为AY531660、DNA序列编号为AY531661，比较突变基因hp1和对应等位基因Hp1的DNA序列，发现在功能表达区的11090位点，发生了T和A的置换，隐性突变基因hp1在11090位置为T，野生型等位基因Hp1在11090位置是A；以突变位点T为目标设计上游引物，把T放在上游引物5`端的不同位置，突变位点分别位于上游引物的第一及倒数第一和第五位，并分别命名为hp11090、11090(1)、11090(5)，如表1所示，利用公用的引物设计软件Primer3--http://www-genome.wi.mit.edu；设计下游引物，获得下游引物的序列为tcaggctggagattgagct--命名为hp11337right；用这个下游引物和不同的上游引物配对进行聚合酶链式反应PCR，经过反复的试验和比较，最后成功地筛选出了对突变位点T具有高度专化性的上游引物及其配套的反应条件；番茄红素hp1基因SNP的引物其中*为突变位点；设计的三个上游引物中11090(1)11090(5)两个引物在多次试验中扩增出了目的条带，产物大小为264bp，反应的退火温度为53.5℃，高于此温度无扩增产物，低于该温度则对突变体和野生型没有特异性，如下所示；因此，上游引物突变位点位于倒数第1和第5的引物能扩增出目的条带，能有效地区分出突变体和野生型的番茄植株；11090(1)11090(5)两引物在不同退火温度下PCR结果其中+表示有扩增产物，-表示无扩增产物，-/+表示扩增产物不稳定；Hp1特异性引物的筛选用同样的方法设计对野生型基因位点特异的引物，将发生突变的位点设计在位于上游引物的倒数第五位ccatatcatacctagactatgc并命名为hp1w5；下游引物为caccaccagaaataggcaact并命名为Hp1-194；对扩增条件进行优化和筛选最终摸索出最适的退火温度为59.5度，如下；扩增产物的大小为194bp；hp1w5-Hp1-194对引物在不同退火温度下PCR结果其中+表示有扩增产物，-表示无扩增产物；(2)隐性突变基因hp2和显性等位基因Hp2特异性分子标记的筛选Hp2基因定位在第一染色体上，是去黄化基因(DET1)的同源基因；从GenBank中搜索到hp2的DNA序列编号为AJ224356和AJ224357，比较突变基因hp2和对应等位基因Hp2的DNA序列，发现在功能表达区的8510处位点，发生了T和A的置换，隐性突变基因hp2在8510位置为T，野生型等位基因Hp2在8510位置是A；根据上述hp1突变位点标记的方法，以突变位点T为目标设计上游引物，把T放在上游引物5`端的不同位置，利用公用的引物设计软件Primer3设计下游引物，获得下游引物的序列，如下番茄红素hp2基因SNP的引物其中*为突变位点；与hp1基因SNP的检测结果类似，设计的三个上游引物中hp(1)和hp(5)两个引物在多次试验中扩增出目的条带，产物大小为334bp，反应的退火温度为49℃，高于此温度无扩增产物，低于该温度则对突变体和野生型没有特异性，如下；上游引物突变位点位于倒数第1和第5的引物匀能扩增也目的条带，能有效地区分出突变体和野生型的番茄植株；hp(5)与共同引物扩增产物的PCR电泳图；hp(1)1hp(5)在不同退火温度下PCR结果注+表示有扩增产物，-表示无扩增产物；采用相同原理，筛选出对Hp2具有特异性的分子标记，其分子量为390bp，退火温度为53℃；(3)把hp1和hp2聚合在同一个基因型中的技术路线A、以hp1和hp2的分子标记为依据进行回交转育用分别含有纯合hp1和纯合hp2的自交系相互杂交，获得同时含有hp1和hp2的F1杂交种，以该杂交种为供体、以农艺性状优良的自交系P为受体杂交，后代中分离出4种基因型，即(+/+，+/+)、(+/hp1，+/+)、(+/+，+/hp2)、(+/hp1，+/hp2)；用hp1和hp2的分子标记进行检测，同时出现这2个基因分子标记的个体必然是目标基因型(+/hp1，+/hp2)；以该基因型为母本，用受体自交系为父本进行回交，回交后代也会出现4种基因型，其中目标基因型(+/hp1，+/hp2)可以用hp1和hp2的分子标记检测出来；再以该基因型为母本进行回交和分子标记筛选，如此连续进行3-4次，即可得到农艺性状与受体自交系P基本相同、但同时含有hp1和hp2的基因型P(+/hp1，+/hp2)；B、以Hp1和Hp2的分子标记为依据，从自交后代中剔除杂合基因型根据独立分配定律，P(+/hp1，+/hp2)的自交后代分离出9种基因型，首先利用hp1和hp2特有的分子标记把同时含有这2个基因的4种基因型筛选出来，它们的遗传构成及其在分离后代的比例为1/4(+/hp1，+/hp2)，1/8(hp1/hp1，+/hp2)，1/8(+/hp1，hp2/hp2)，1/16(hp1/hp1，hp2/hp2)；这4种基因型在分离后代中所占的总比例为9/16，也就是利用hp1和hp2的分子标记可以有50％以上的机会筛选出目标基因型；在这4种基因型中，以Hp1的分子标记为依据，把基因型(+/hp1，+/hp2)和(+/hp1，hp2/hp2)筛选出来，再以Hp2的分子标记为依据，从剩下的群体中把基因型(+/hp1，hp2/hp2)剔除，最后留下来的个体应是目标基因型(hp1/hp1，hp2/hp2)；目标基因型含有2个纯合的高色素基因hp1和hp2，它可以作为供体自交系为其它自交系的改良提供高色素基因源；其技术路线注P代表番茄自交系，(hp1/hp1)代表含有纯合hp1基因的亲本，代表入选的单株。全文摘要利用分子标记累加高色素基因hp1和hp2的番茄育种方法是通过筛选出对hp1、hp2基因以及显性等位基因Hp1和Hp2具有高度特异性的分子标记，以它们的分子标记为依据，可以准确地确定杂交后代单株中是否含有hp1和hp2以及hp基因的结合状态，从而筛选出同时含有hp1和hp2的单株，在短时间内实现这2个基因的聚合和纯化，进而选育出番茄红素含量大幅度提高的番茄新品种。该技术体系即等位基因特异性PCR技术具有特异性高、重复性好以及费用低廉等优点。应用植物的分子育种可以加速育种世代，节约时间和人力。具有很好的实际应用效果。文档编号C12N15/29GK101372696SQ20071005927公开日2009年2月25日申请日期2007年8月24日优先权日2007年8月24日发明者刘仲齐,刘红庆,张要武,俊薛,郏艳红,金风媚申请人:天津市农业生物技术中心