专利名称：雪莲体胚诱导发生的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及植物组织培养技术，具体为新疆雪莲体胚的诱导发生。
背景技术：
新疆雪莲(Saussurea Involucrata Kar.et Kir.ex Maxim)，是菊科风毛菊属(Saussurea D C)的一类具有通经活血、暖宫散瘀、散寒除湿和强筋助阳等多种功能的药用植物，主要生长于海拔2400-4100m的高山草甸、高山冰债石、流石滩石隙、悬崖峭壁石缝等处，是新疆地区名贵的植物物种之一，且具有很高的医药价值。但近年来，随着雪莲药效作用不断开发越来越受人们的关注，非法采挖现象非常严重，尤其是在雪莲开花种子未成熟前采挖造成雪莲自然资源无法繁殖，已有濒临灭绝的危险。
运用生物工程手段，通过植物组织培养方法快速繁殖新疆雪莲，有利于新疆野生雪莲的保护，同时可以解决雪莲药用制品对雪莲的大量需求。诱导发生体胚后可以直接培养成有根苗，也可以进一步制作人工种子，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种雪莲体胚诱导发生的方法，该方法是将雪莲种子萌发形成的子叶为外植体诱导形成愈伤，进而进一步诱导体胚发生，为雪莲人工种子的研制奠定基础。根据植物叶片再生原理，以幼苗子叶为外植体，经固体和液体悬浮培养诱导形成雪莲体胚。
本发明所述的一种雪莲体胚诱导发生的方法，按下列步骤进行
a、选择雪莲种子，先用75％酒精表面灭菌20-30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡3-5min，然后用无菌水冲洗3次，放入无菌培养皿或MS培养基上，8-15天萌发；b、取刚萌发幼苗的叶外植体，切割成大小0.5-1cm2，将其接入琼脂固化MS+2，4-D0.05-2.0mg/L+BA0.5-3.0mg/L的愈伤诱导培养基上，固体培养条件为日光灯2500-3500lx，光照12h/d，温度为25±1℃，湿度为65±5％，20-25天后，得到愈伤组织；c、然后在MS+2，4-D0.05-2.0mg/L+BA0.5-3.0mg/L的培养基上继代培养一次，挑选新鲜、松散、浅黄色的愈伤，以30g/L的接种量接入液体培养基MS+2，4-D0.05-2.0mg/L的三角瓶中，在25±1℃，2500-3500lx，120转/min的条件下培养15-20天，再培养12-14天，出现球状颗粒，20天后其中的愈伤表面完全被球状突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌发，形成白色的茎段。
固体培养基为三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接5-6个外植体。
固体培养基或液体培养基添加蔗糖3-5％，调节pH 5.8-5.9，灭菌时间为20-25min，温度为121℃。
参见附1是本发明在固体培养基上由叶片诱导形成的愈伤的照片图；图2是本发明在液体悬浮培养过程中形成的颗粒状愈伤组织的照片图；图3是本发明在液体悬浮培养后期取出后的愈伤照片图；图4，5是本发明从液体悬浮培养中直接萌发的体胚的照片图。
具体实施例方式
实施例1愈伤组织的诱导
a、选择新疆雪莲种子200粒，先用75％酒精表面灭菌20秒，再用0.1％升汞溶液浸泡3min，然后用无菌水冲洗至干净，放入无菌培养皿培养基上，8天萌发率达到70％；b、取刚萌发幼苗的叶为外植体，切割成大小0.5cm2，将其接入琼脂固化MS+2，4-D0.05mg/L+BA0.5mg/L的愈伤诱导培养基上，接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接5个外植体，固体培养条件为日光灯2500lx，光照12h/d，温度为25±1℃，湿度为65±5％，20-25天后，得到愈伤组织；固体培养基添加蔗糖3％，调节pH 5.8，灭菌时间均为20min，温度为121℃；体胚的诱导发生c、然后在MS+2，4-D0.05mg/L+BA0.5mg/L的培养基上继代培养一次，挑选新鲜、松散、浅黄色的愈伤，以30g/L的接种量接入液体培养基MS+2，4-D0.05mg/L的250ml的三角瓶中，液体培养基添加蔗糖3％，调节pH 5.8，灭菌时间均为20min，温度为121℃，在25±1℃，2500lx，120转/min的条件下培养25天，在培养的第12天，出现球状颗粒，20天后其中的愈伤表面完全被球状突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌发，形成白色的茎段。
实施例2愈伤组织的诱导a、选择新疆雪莲种子300粒，先用75％酒精表面灭菌25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡4min，然后用无菌水冲洗3次，放入MS培养基上，11天萌发率达到80％；b、取刚萌发幼苗的叶为外植体，切割成大小0.6cm2，将其接入琼脂固化MS+2，4-D0.1mg/L+BA1.0mg/L的愈伤诱导培养基上，250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接6个外植体，固体培养条件为日光灯3500lux，光照12h/d，温度为25±1℃，湿度为65±5％，23天后，得到愈伤组织；固体培养基添加蔗糖4％，调节pH 5.85，灭菌时间均为20min，温度为121℃。
体胚的诱导发生c、然后在MS+2，4-D0.1mg/L+BA1.0mg/L的培养基上继代培养一次，挑选新鲜、松散、浅黄色的愈伤，以30g/L的接种量接入液体培养基MS+2，4-D0.1mg/L的250ml的三角瓶中，液体培养基添加蔗糖4％，调节pH 5.85，灭菌时间均为20min，温度为121℃，在25±1℃，3000lux，120转/min的条件下培养17天，在培养的第13天，出现球状颗粒，20天后其中的愈伤表面完全被球状突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌发，形成白色的茎段；实施例3愈伤组织的诱导a、选择雪莲种子400粒，先用75％酒精表面灭菌30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡5min，然后用无菌水冲洗3次，放入无菌培养皿上，15天萌发率达到90％；b、取刚萌发幼苗的叶为外植体，切割成大小0.8cm2，将其接入琼脂固化MS+2，4-D2.0mg/L+BA3.0mg/L的愈伤诱导培养基上，250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接6个外植体，固体培养条件为日光灯35001ux，光照12h/d，温度为25±1℃，湿度为65±5％，25天后，得到愈伤组织；固体培养基添加蔗糖5％，调节pH 5.9，灭菌时间均为20min，温度为121℃。
体胚的诱导发生c、然后在MS+2，4-D2.0mg/L+BA3.0mg/L的培养基上继代培养一次，挑选新鲜、松散、浅黄色的愈伤，以30g/L的接种量接入液体培养基MS+2，4-D2.0mg/L的三角瓶中，液体培养基添加蔗糖5％，调节pH 5.9，灭菌时间均为20min，温度为121℃。在25±1℃，3500lx，120转/min的条件下培养20天，再培养14天，出现球状颗粒，20天后其中的愈伤表面完全被球状突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌发，形成白色的茎段。
实施例4愈伤组织的诱导a、选择雪莲种子350粒，先用75％酒精表面灭菌30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡5min，然后用无菌水冲洗3次，放入无菌培养皿上，15天萌发率达到90％；b、取刚萌发幼苗的叶为外植体，切割成大小0.8cm2，将其接入琼脂固化MS+2，4-D1.5mg/L+BA2.0mg/L的愈伤诱导培养基上，250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接6个外植体，固体培养条件为日光灯3500lux，光照12h/d，温度为25±1℃，湿度为65±5％，25天后，得到愈伤组织；固体培养基添加蔗糖5％，调节pH 5.9，灭菌时间均为20min，温度为121℃。
体胚的诱导发生c、然后在MS+2，4-D1.5mg/L+BA2.0mg/L的培养基上继代培养一次，挑选新鲜、松散、浅黄色的愈伤，以30g/L的接种量接入液体培养基MS+2，4-D1.5mg/L的三角瓶中，液体培养基添加蔗糖5％，调节pH 5.9，灭菌时间均为20min，温度为121℃。在25±1℃，3500lx，120转/min的条件下培养20天，再培养14天，出现球状颗粒，20天后其中的愈伤表面完全被球状突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌发，形成白色的茎段。
权利要求
1.一种雪莲体胚诱导发生的方法，其特征在于按下列步骤进行a、选择雪莲种子，先用75％酒精表面灭菌20-30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡3-5min，然后用无菌水冲洗3次，放入无菌培养皿或MS培养基上，8-15天萌发；b、取刚萌发幼苗的叶外植体，切割成大小0.5-1cm2，将其接入琼脂固化MS+2，4-D0.05-2.0mg/L+BA0.5-3.0mg/L的愈伤诱导培养基上，固体培养条件为日光灯2500-3500lx，光照12h/d，温度为25±1℃，湿度为65±5％，20-25天后，得到愈伤组织；c、然后在MS+2，4-D0.05-2.0mg/L+BA0.5-3.0mg/L的培养基上继代培养一次，挑选新鲜、松散、浅黄色的愈伤，以30g/L的接种量接入液体培养基MS+2，4-D0.05-2.0mg/L的三角瓶中，在25±1℃，2500-3500lx，120转/min的条件下培养15-20天，再培养12-14天，出现球状颗粒，20天后其中的愈伤表面完全被球状突起包埋，25天后表面突起不同程度的萌发，形成白色的茎段。
2.根据权利要求1所述的一种雪莲体胚诱导发生的方法，其特征在于固体培养基为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接5-6个外植体。
3.根据权利要求1所述的一种雪莲体胚诱导发生的方法，其特征在于固体培养基或液体培养基添加蔗糖3-5％，调节pH5.8-5.9，灭菌时间为20-25min，温度为121℃。
全文摘要
本发明涉及一种雪莲体胚诱导发生的方法，该方法是将雪莲种子进行愈伤组织的诱导，体胚的诱导发生得到雪莲的体胚。根据植物叶片再生原理，以幼苗子叶为外植体，经固体和液体悬浮培养诱导形成雪莲体胚，为人工种子的制作奠定基础。
文档编号A01H4/00GK1736174SQ200510096979
公开日2006年2月22日 申请日期2005年8月29日 优先权日2005年8月29日
发明者林侃, 王晓军, 赵民安, 刘敏, 努尔波拉提, 赵海清, 贾莉芳, 付小春 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所