专利名称：耐高温的阿魏菇突变株的制作方法
技术领域：
本发明涉及三株耐高温的食用菌菌株，具体地涉及通过离子束诱变技术获得的三株具有耐高温性能、遗传稳定的阿魏菇突变株。
背景技术：
阿魏菇(Pleurotus ferulae Lenzi)，又名阿魏侧耳、白灵蘑，商品名为白灵菇，属担子菌亚门层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属，子实体单生，菌盖直径5-15厘米，初期扁半球形，后渐平展，最后靠近基部下呈凹扁形，表面有龟裂斑，始终为白色，较厚，菌褶延生，稍密，菌褶淡黄色，菌柄白色，长2-6厘米，向基部渐细。
野生阿魏菇主要分布于新疆准葛尔盆地荒漠区的伊犁、塔城和阿勒泰地区，其中阿勒泰地区青河县的阿魏菇以色泽纯正、味道鲜美、营养价值高而享誉国内外。阿魏菇每年春末夏初发生，腐生或兼寄生在伞形科药用植物阿魏死根茎上。因此，有与中药阿魏相同的调节人体生理平衡，增强人体免疫力的功效。阿魏菇可入药具有消积杀虫作用，对于腹部肿块、肝脾肿大、脘腹冷痛等具有治疗效果。阿魏菇以营养丰富，兼具有多种药用功效，逐渐成为一种大众公认的保健食品，其鲜品、干制品及深加工产品深受国内外消费者的青睐。近年来，阿魏菇已成为我国商品性栽培食用菌的重要品种。
阿魏菇的人工栽培对温度的要求非常严格，过高的温度会导致蛋白质或核酸的变性失活，而过低的温度会使酶活力受到抑制，细胞的新陈代谢活动减弱。阿魏菇是一种低温型的食用菌，菌丝生长的最适温度较低，仅为23℃～25℃，如果温度过高，如35℃～36℃菌丝则停止生长；菇蕾发育最适温度仅为0～13℃，子实体发育的温度白天仅为10～15℃，夜晚为5～8℃。由于阿魏菇人工栽培对温度要求严格，并且菇蕾形成期、出菇期的温度如果过高会导致菇蕾形成困难和难以出菇，从而造成减产或绝收，从而给阿魏菇的周年生产带来困难。
目前，阿魏菇反季节的生产由于受到种质的限制，商品性好的阿魏菇都是通过冷房模式生产出的阿魏菇，因而成本非常高。因此，为了解决这一突出矛盾，诱变筛选获得适用于反季节生产的耐高温菌株就显得尤为重要。
食用菌诱变育种是人为利用某些理化因子诱导食用菌的遗传因子发生突变，再从多种突变体中选出适宜突变菌株的方法，诱变育种是获得优良食用菌菌株的常用手段。目前对食用菌诱变育种较为有效的理化因子包括60Co、紫外线、激光、X射线、超声波、快中子、亚硝酸、亚硝酸胍、氮芥、硫酸二乙酯等，研究人员根据各自的实验条件及不同菌种的特点选择不同的诱变剂，在食用菌新菌种的选育工作中已取得了不少成果。离子束诱变技术是由我国科技工作者于20世纪80年代中期开创的一种新的育种方法，离子束诱变法与传统的辐射法及化学诱变剂诱变法相比，具有损伤轻、突变率高、突变谱宽、易于获得理想菌株等特点，目前在微生物新品种的选育中取得了丰硕的成果。
本申请的发明人经过多年的潜心研究，通过离子束诱变技术从青河野生阿魏菇中分离获得了三株菌丝生长最适温度、菇蕾形成期和出菇期的温度均高于野生阿魏菇，并且遗传稳定的耐高温突变株，从而实现了阿魏菇的周年生产。
发明内容
本发明的一个方面提供通过离子束诱变技术从青河野生阿魏菇中获得的三种耐高温的阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)，其分别为阿魏菇青格里1号CGMCC 1761、阿魏菇青格里2号CGMCC 1762和阿魏菇青格里3号CGMCC1763。
其中，阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)青格里1号CGMCC 1761是一种耐高温的阿魏菇突变株，菌丝生长的最适温度为28-32℃，菌丝生长和出菇各阶段的温度均高于野生阿魏菇，成熟后菇形为掌形。
阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)青格里2号CGMCC 1762是一种耐高温的阿魏菇突变株，菌丝生长的最适温度为28-31℃，菌丝生长和出菇各阶段的温度均高于野生阿魏菇，成熟后菇形为圆形。
阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)青格里3号CGMCC 1763是一种耐高温的阿魏菇突变株，菌丝生长的最适温度为27-31℃，菌丝生长和出菇各阶段的温度均高于野生阿魏菇，成熟后菇形为马蹄形。
本发明的另一个方面提供利用这三种耐高温突变株培育阿魏菇的方法，该方法包括菌株斜面培养、种瓶和/或发酵罐培养、菌袋培养以及出菇培养的步骤。优选地，在出菇培养的步骤中还包括向菌袋中注入出菇水的步骤，其中出菇水的配方为α-奈乙酸0.0025％、赤霉素0.0025％、30烷醇0.025％，其余为无菌水。
三种阿魏菇突变株均具有耐高温的性能，使反季节生产阿魏菇变得容易，并且大大降低了成本，从而实现了阿魏菇的周年生产。
具体实施例方式
实施例1、野生阿魏菇菌丝细胞的离子束诱变筛选用无菌接种钩挑取一定量的青河野生阿魏菇新生菌丝，接入装有玻璃珠及30ml无菌水的150ml锥形瓶中，将菌丝尽量打散，用双层滤纸加单层脱脂棉过滤，制备菌丝单细胞悬液。在菌丝单细胞悬液中加入20％的脱脂奶作为保护剂，用移液器移取0.2ml菌丝单细胞悬液涂布于Φ90mm的无菌空白培养皿中，置于超净台风干，制成菌膜。
用不同剂量的N+束对菌膜进行辐照处理，处理后将菌膜用2ml无菌水洗脱，用移液器移取0.2ml菌丝单细胞悬液涂布于综合平板培养基上，在青河野生阿魏菇菌丝生长的极限温度条件下恒温培养10-15天，观察菌丝的长势并记录数据。接着用无菌牙签挑取在综合平板培养基上长出的单菌落菌丝，分别对应接种于基础平板培养基和综合平板培养基上，在突变株菌丝生长的最适温度条件下恒温培养，观察菌丝的长势并记录数据。然后再将在基础平板培养基上不能生长，而在对应的综合平板培养基上能够正常生长的单菌落接种到筛选平板培养基上，在突变株菌丝生长的最适温度条件下恒温培养，筛选耐高温菌株。
其中，基础平板培养基的成分为(w/v)玉米淀粉1.0％、葡萄糖2.0％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％、琼脂2.0％，其余为无菌水；综合平板培养基的成分为(w/v)小麦粉1.5％、酵母膏0.4％、KH2PO40.2％、MgSO40.2％、麸皮3.0％、琼脂2.0％，其余为无菌水；筛选平板培养基在基础平板培养基中加入0.2ml 100ppm的18种氨基酸和维生素B1、B2、B6溶液。
经过上述阿魏菇菌丝细胞的离子束筛选，获得两株耐高温的阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)，命名为青格里1号和青格里2号，并且将这两株突变株于2006年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号分别为CGMCC 1761和CGMCC 1762。
阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)CGMCC 1761是一种苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、维生素B6营养缺陷型耐高温菌株，菌丝生长的最适温度为28-32℃。在出菇阶段中，催蕾期、米粒期的温度为白天18℃、夜晚8℃；形成期的温度为白天22℃、夜晚14℃；展开期、成熟期的温度为白天20℃、夜晚12℃，成熟后菇形为掌形。该耐高温菌株的菌丝生长和出菇阶段的温度均高于野生阿魏菇(青河野生阿魏菇菌丝生长的最适温度为23℃～25℃，菇蕾发育最适温度为0～13℃，子实体发育的温度为白天10～15℃，夜晚5～8℃)，适于周年生产。
阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)CGMCC 1762是一种赖氨酸、维生素B6营养缺陷型耐高温菌株，菌丝生长的最适温度为28-31℃。在出菇阶段中，催蕾期、米粒期的温度为白天16℃、夜晚6℃；形成期的温度为白天20℃、夜晚12℃；展开期、成熟期的温度为白天18℃、夜晚12℃，成熟后菇形为圆形。菌丝生长和出菇阶段的温度均高于野生阿魏菇，适于周年生产。
实施例2、青河野生阿魏菇分生孢子的离子束诱变取一片未喷发分生孢子的青河野生阿魏菇子实体，将其置于放有培养皿的干燥器中，让其自然喷发，喷发后，将分生孢子收集起来，将收集的分生孢子用2ml无菌水洗脱、稀释制成一定浓度的分生孢子悬液。在分生孢子悬液中加入20％的脱脂奶作为保护剂，取0.2ml分生孢子悬液涂于Φ90mm的无菌空白培养皿中，置于超净台风干，制成菌膜。
用不同剂量的N+束对菌膜进行辐照处理，处理后将菌膜用2ml无菌水洗脱，用移液器移取0.2ml分生孢子悬液涂布于综合平板培养基上，在青河野生阿魏菇菌丝生长的极限温度条件下恒温培养10-15天，观察孢子的萌发、菌丝的长势并记录数据。接着用无菌牙签挑取在综合平板培养基上长出的单菌落菌丝，分别对应接种于基础平板培养基和综合平板培养基上，在突变株菌丝生长的最适温度条件下恒温培养，观察菌丝的长势并记录数据。然后再将在基础平板培养基上不能生长，而在对应的综合平板培养基上能够正常生长的单菌落接种到筛选平板培养基上，在突变株菌丝生长的最适温度条件下恒温培养，筛选耐高温菌株。
综合平板培养基、基础平板培养基和筛选平板培养基的配方同实施例1。
经过上述分生孢子的离子束诱变筛选，获得了一株耐高温的阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)，命名为青格里3号，并且将该菌株于2006年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 1763。
阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)CGMCC 1763是一种耐高温的阿魏菇菌株，菌丝生长的最适温度为27-31℃。在出菇阶段中，催蕾期、米粒期的温度为白天18℃、夜晚8℃；形成期的温度为白天22℃、夜晚16℃；展开期、成熟期的温度为白天20℃、夜晚14℃，成熟后菇形为马蹄形。菌丝生长和出菇阶段的温度均高于野生阿魏菇，适于周年生产。
实施例3、阿魏菇青格里1号的培养阿魏菇的培养过程包括菌株斜面培养、种瓶和/或发酵罐培养、菌袋培养以及出菇培养几个阶段。经过种瓶和/或发酵罐培养后，将发酵液接种于菌袋中，在菌丝的最适温度条件下恒温培养，待菌丝生理成熟后搔菌注入出菇水，进行出菇培养。
(1)、斜面培养用无菌接种钩刮取少量阿魏菇青格里1号(CGMCC 1761)，接种到PDA培养基上，在25℃培养5天；(2)、种瓶培养用无菌接种钩挑取一定量的经斜面培养的新生菌丝，接种到装有100ml种子培养基的250ml摇瓶中，以200转/分，28℃恒温培养144小时；其中种子培养基为按木屑粉78％、麸皮粉17％、白砂糖1％、石膏1％、石灰3％的比例配制，然后溶于无菌水中，使培养基的含水量为60％；(3)、发酵罐培养将经过种瓶培养的菌丝按1∶10的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中，以200转/分，30℃发酵120小时；经过发酵，发酵液清澈，菌丝球大小均匀，颜色为褐色。其中，发酵罐中的发酵培养基为小麦粉1.0％，蔗糖0.5％，酵母膏0.2％，KH2PO40.2％，MgSO40.15％，麸皮1.5％，其余为无菌水；(4)、菌袋培养将发酵液按1∶10的接种量接种于装有菌袋培养基的菌袋中，在29℃培养80天，待长满菌丝后在0℃冷刺激20天。其中菌袋培养基为按棉籽壳74.8％，麸皮15％，玉米粉6.0％，KH2PO40.2％，石膏1.0％，石灰3.0％的比例配制，然后溶于无菌水中，使培养基的含水量为60％；(5)、出菇培养向菌袋中注入出菇水，每个菌袋(1.1-1.2kg)中注入0.2ml出菇水。出菇水的配方为α-奈乙酸0.0025％，赤霉素0.0025％，30烷醇0.025％，其余为无菌水。青格里1号出菇阶段的培养条件为催蕾期、米粒期的温度为白天18℃、夜晚8℃，湿度80％，光照300lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％；形成期的温度为白天22℃、夜晚14℃，湿度90％，光照600lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％；展开期、成熟期的温度为白天20℃、夜晚12℃，湿度85％，光照800lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％，成熟后菇形为掌形。
实施例4、阿魏菇青格里2号的培养阿魏菇的培养过程包括菌株斜面培养、种瓶和/或发酵罐培养、菌袋培养以及出菇培养几个阶段。经过种瓶和/或发酵罐培养后，将发酵液接种于菌袋中，在菌丝的最适温度条件下恒温培养，待菌丝生理成熟后搔菌注入出菇水，进行出菇培养。
(1)、斜面培养用无菌接种钩刮取少量阿魏菇青格里2号(CGMCC1762)，接种到PDA培养基上，在25℃培养5天；(2)、种瓶培养用无菌接种钩挑取一定量的经斜面培养的新生菌丝，接种到装有100ml种子培养基的250ml摇瓶中，以200转/分，28℃恒温培养168小时；种子培养基的配方同实施例3；(3)、发酵罐培养将经过种瓶培养的菌丝按1∶10的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中，以200转/分，28℃发酵144小时；经过发酵，发酵液清澈，菌丝球大小均匀，颜色为橙色。发酵罐中发酵培养基的配方同实施例3；(4)、菌袋培养将发酵液按1∶10的接种量接种于装有菌袋培养基的菌袋中，在28℃培养90天，待长满菌丝后在0℃冷刺激30天；菌袋培养基的配方同实施例3；(5)、出菇培养向菌袋中注入出菇水，每个菌袋(1.1-1.2kg)中注入0.2ml出菇水。出菇水的配方同实施例3。青格里2号出菇阶段的培养条件为催蕾期、米粒期的温度为白天16℃、夜晚6℃，湿度80％，光照300lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％；形成期的温度为白天20℃、夜晚12℃，湿度90％，光照600lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％；展开期、成熟期的温度为白天18℃、夜晚12℃，湿度85％，光照800lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％，成熟后菇形为圆形。
实施例5、阿魏菇青格里3号的培养阿魏菇的培养过程包括菌株斜面培养、种瓶和/或发酵罐培养、菌袋培养以及出菇培养几个阶段。经过种瓶和/或发酵罐培养后，将发酵液接种于菌袋中，在菌丝的最适温度条件下恒温培养，待菌丝生理成熟后搔菌注入出菇水，进行出菇培养。
(1)、斜面培养用无菌接种钩刮取少量阿魏菇青格里3号(CGMCC1763)，接种到PDA培养基上，在25℃培养5天；(2)、种瓶培养用无菌接种钩挑取一定量的经斜面培养的新生菌丝，接种到装有100ml种子培养基的250ml摇瓶中，以200转/分，28℃恒温培养156小时；种子培养基的配方同实施例3；(3)、发酵罐培养将经过种瓶培养的菌丝按1∶10的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中，以200转/分，30℃发酵144小时；经过发酵，发酵液清澈，菌丝球大小均匀，颜色为米白色。发酵罐中发酵培养基的配方同实施例3；(4)、菌袋培养将发酵液按1∶10的接种量接种于装有菌袋培养基的菌袋中，在28℃培养85天，待长满菌丝后在0℃冷刺激25天；菌袋培养基的配方同实施例3；(5)、出菇培养向菌袋中注入出菇水，每个菌袋(1.1-1.2kg)中注入0.2ml出菇水。出菇水的配方同实施例3。青格里3号出菇阶段的培养条件为催蕾期、米粒期的温度为白天18℃、夜晚8℃，湿度80％，光照300lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％；形成期的温度为白天22℃、夜晚16℃，湿度90％，光照600lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％；展开期、成熟期的温度为白天20℃、夜晚14℃，湿度85％，光照800lx，CO2浓度＜0.03％-0.04％，成熟后菇形为马蹄形。
通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例性的描述，而不应当被理解为用来限制本发明的范围。
权利要求
1.一种耐高温的阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)青格里1号CGMCC 1761。
2.一种耐高温的阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)青格里2号CGMCC 1762。
3.一种耐高温的阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)青格里3号CGMCC 1763。
4.一种利用权利要求1-3中任意一项的突变株培育阿魏菇的方法，其特征在于包括菌株斜面培养、种瓶和/或发酵罐培养、菌袋培养以及出菇培养的步骤。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于在出菇培养的步骤中还包括向菌袋中注入出菇水。
6.根据权利要求5的方法，其中出菇水的配方为α-奈乙酸0.0025％、赤霉素0.0025％、30烷醇0.025％，其余为无菌水。
全文摘要
本发明提供通过离子束诱变方法从青河野生阿魏菇中获得的三种耐高温的阿魏菇突变株(Pleurotus ferulae)，其分别为阿魏菇青格里1号CGMCC 1761、阿魏菇青格里2号CGMCC 1762和阿魏菇青格里3号CGMCC 1763。本发明还提供利用这三种耐高温突变菌株培育阿魏菇的方法，该方法包括菌株斜面培养、种瓶和/或发酵罐培养、菌袋培养以及出菇培养的步骤。优选地，在出菇培养的步骤中还包括向菌袋中注入出菇水的步骤，其中出菇水的配方为α－奈乙酸0.0025％、赤霉素0.0025％、30烷醇0.025％，其余为无菌水。三株耐高温阿魏菇突变株的菌丝生长最适温度、菇蕾形成期和出菇期的温度均高于野生阿魏菇，而且遗传稳定，从而使反季节生产阿魏菇变得容易，并且大大降低了成本，实现了阿魏菇的周年生产。
文档编号A01G1/04GK1888049SQ20061010345
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月24日 优先权日2006年7月24日
发明者曾宪贤, 吕杰, 陈恒雷, 吕长武, 付永前 申请人:曾宪贤, 吕杰, 陈恒雷