专利名称：一种控制哺乳动物性别的方法
技术领域：
本发明涉及一种控制哺乳动物性别的方法。
背景技术：
传统的性别控制有两种方式，即受精之前控制和受精之后控制。前者是指受精之前，对精子进行人为干预，在受精之时就决定了后代的性别；后者是指对受精卵进行性别鉴定，使其获得所需性别的后代。这两种性别控制方式存在缺点是1、资源浪费。X和Y精子分离有一半的精子被淘汰掉，由此造成资源浪费。胚胎性别鉴定需要将受精后发育到囊胚或桑椹胚的可移植胚胎取下少量细胞，进行DNA体外扩增，获取雌雄信息，从而达到控制后代性别的一项技术，如果按着自然的雌雄分配比例计算，有50％的胚胎被淘汰掉，又一次的造成资源和经济上的浪费。
2、数量受限。①体内受精一年只能获得一头良种后代；②体外受精虽然可以获得多数已知性别的胚胎，但是由于受母性遗传基因的影响，很难得到良种后代，因为体外受精过程需要到屠宰场取母牛的卵巢，在屠宰场里取来的卵巢基本上是淘汰母牛或劣质母牛，所以做出的体外受精后代的遗传基因受到很大影响；③通过超排获得的性别鉴定胚胎数量有限。
3、价格贵不易被老百姓接受。经过XY精子分离获得的性控精液或性控胚胎一般比自然生产的高出二倍的价格，在生产中不易被老百姓接受。
哺乳动物体细胞克隆技术(mammalian somatic cell cloning)又称体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer)，是指通过特殊的人工手段，即以显微操作、电融合、复合活性化处理等技术为主线，将体细胞作为核供体，移入到成熟的、去核的、未受精的卵母细胞中，进行体外重构、体外培养、胚胎移植，从而达到扩繁同种基因型哺乳动物种群的目的。
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)，最初是由Friedenstein发现的一类易于贴附于塑料培养板表面的细胞，后来的研究证实在不同的诱导条件下，具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力。常用的MSCs分离与培养方法有1、密度梯度离心法根据MSCs与其它细胞的密度不同而采用Percoll分层液将其分离出来；2、贴壁筛选法根据MSC具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离，一般以4-12小时贴壁细胞为宜；3、流式细胞仪分选法根据MSCs细胞体积小，相对缺少颗粒的特性利用流式细胞仪对MSCs进行分选；4、免疫磁珠分选法可以根据MSCs表达的某些细胞表面标志进行富集或根据其表面负表达的抗原进行负分选，其效率和纯度较高。
卵母细胞的去核是体细胞核移植技术的关键技术环节。McGrath(McGrath，SolterD.Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion.[J]Science.1983.2201300-1302)，报道了一步去核法，即在注入核供体细胞的同时将细胞核吸引除去，此操作只需要一个显微操作管。Shiga(Shiga K，Fujite T，Hirose K.Production of calves by transfer of nuclei from cultured somaticcells obtained from Japanese black bulls.[J].j Theriogenology.1999，52527-535)，建立的一步挤压除核法，是用显微切割针在第一极体附近，将卵母细胞透明带切开1/3(周长的1/3)，调准切口，使其与切割针成垂直方向，固定卵母细胞，调节显微切割针，将切割针横压在卵母细胞的直径部位，垂直向下微微轻压，除去第一极体连同下面的一小部分细胞质。
发明内容
本发明的目的是提供一种控制哺乳动物性别的方法。
本发明所提供的控制哺乳动物性别的方法，是将哺乳动物骨髓间充质干细胞作为核供体细胞，移入到成熟的、未受精的、去核的哺乳动物卵母细胞中，进行体外重构、体外培养、胚胎移植，控制子代的性别。
所述哺乳动物骨髓间充质干细胞可通过密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪分选法或免疫磁珠分选法进行分离，最好通过密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离。
所述哺乳动物卵母细胞可来自于牛、羊、猫、狗和兔等动物。
所述哺乳动物卵母细胞优选来自于牛，其骨髓间充质干细胞可通过以下密度梯度离心法结合贴壁筛选法方法获得将牛骨髓单细胞悬液加入密度为1.082的Percoll细胞分离液中进行离心，取液面交界处的云雾状单个核细胞层，接种于塑料容器中进行培养，去掉非贴壁细胞，得到牛骨髓间充质干细胞。
所述牛骨髓单细胞悬液与密度为1.082的Percoll细胞分离液的体积比为1∶1。所述牛骨髓单细胞悬液为不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液。所述离心条件为80g离心30min。所述接种密度为1×105个-1×107个细胞/cm2，优选为1×107个细胞/cm2。
所述成熟的、去核的、未受精的哺乳动物卵母细胞可通过一步去核法McGrath(McGrath，Solter D.Nuclear transplantation in the mouse embryo bymicrosurgery and cell fusion.[J]Science.1983.2201300-1302)、挤压除核法Shiga(Shiga K，Fujite T，Hirose K.Production of calves by transferof nuclei from cultured somatic cells obtained from Japanese blackbulls.[J].j Theriogenology.1999，52527-535)获得，还可通过如下点击去核法获得将刚放出第一极体的哺乳动物卵母细胞的裸卵的透明带，在第一极体处切开1/3，再点击透明带，除去第一极体连同下面的核物质；所述1/3是透明带周长的1/3。
所述点击透明带的位置在调准卵母细胞第一极体位置后用固定管固定卵母细胞，点击透明带3点钟的位置，参照图5点击去核法去核照片。
所述刚放出第一极体的牛卵母细胞可按照以下方法获得将牛的卵母细胞在CR2aa+10％SCS+0.01mg/ml FSH+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素的培养基中成熟培养18-22小时，得到刚放出第一极体的卵母细胞。
本发明的控制哺乳动物性别的方法中所采用的骨髓间充质干细胞，与胚胎干细胞、原始生殖脊干细胞和体内其他部位的成体干细胞如胰腺干细胞等相比，骨髓间充质干细胞对培养条件要求不高，不需要添加多种细胞因子，扩增迅速容易分离纯化；采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法筛选骨髓间充质干细胞，相对于流式细胞仪分选法对细胞的损伤较小，相对于免疫磁珠分选法更经济实用相对于全骨髓法纯度更高；骨髓间充质干细胞克隆获得的168h囊胚，在体外继续培养体系中，50％的内细胞团可以完全脱离透明带，极显著高于体细胞克隆囊胚在继续培养中只有2-6％的囊胚可完全脱离透明带。本发明利用牛骨髓间充质干细胞核移植技术，控制良种牛性别，可降低性别控制成本，提高良种牛的生产性牛，可操作性强，为良种产业化提供技术支撑。
图1a为分离筛选的高纯度MSCs集落(×200)图1b为形成集落的MSCs原代培养细胞的瑞士-姬姆萨复合染色照片(×200)图2a为第2代牛MSCs(×100)照片图2b为第10代的牛MSCs细胞集落融合后形成水纹状(200×)
图2c为第10代接近融合的牛MSCs，细胞处于生长旺盛期，胞浆饱满，多个核仁(×400)照片图2d为照片第15代的牛MSCs形成的集落染色照片(×200)图3为作为核供体细胞的牛骨髓间充质干细胞第12代的多细胞集落(100×)照片图4为第12代牛MSCs细胞的吉姆萨染色鉴定的MSCs为单核细胞(100×)照片图5为点击去核法去核照片图6为体外培养168h骨髓间充质干细胞核移植囊胚(200×)照片图7为体外培养198h的骨髓间充质干细胞脱出透明带的克隆囊胚(200×)照片具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、利用牛骨髓间充质干细胞控制牛的性别一、牛骨髓间充质干细胞的分离1、骨髓间充质干细胞的分离及其原代(第一代)培养无菌条件下分离出牛(2～6月龄)股骨骨髓，使用带有4号针头的5ml注射器冲出骨髓，置于消毒的大培养皿中，将骨髓液依次经7号和4号针头轻轻吹打，过200目滤网，制成单细胞悬液。将单细胞悬液用不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS-)冲洗3次，重新悬浮后将细胞悬液以1∶1的体积比轻轻加入4℃预冷的密度为1.082的Percoll细胞分离液(购自美国Sigma公司，配方Percoll原液25.65mL+1.5moL/L NaCl溶液24.35mL)的试管中，80g离心30min取中间(液面交界处)的云雾状单个核细胞层，以PBS清洗2次准备接种。
将细胞悬液以1×107个细胞/cm2的密度接种于装有完全培养基的直径为35mm的塑料培养皿。每个培养皿加1.5ml完全培养基，置于37℃，体积分数为5％的CO2，饱和湿度条件下培养。在接种后48小时和72小时分别连续2次全量更换培养基，去掉非贴壁细胞，得到牛骨髓间充质干细胞。以后每2d～3d半量换液1次。在完全培养基中培养11至13天，获得骨髓间充质干细胞的原代培养物。其中，采用的完全培养基为L-DMEM+25％(体积百分含量)马血清+10％(体积百分含量)条件培养液+1％(质量百分含量)L-谷氨酰胺+1μmol/L的氢化可的松。其中，条件培养液按照如下方法配制无菌分离犊牛股骨骨髓5ml，加入10mL含有20％(体积百分含量)的胎牛血清(FBS)，1％L-谷氨酰胺的L-DMEM培养液培养2d～3d，收集培养液，离心取上清液制成条件培养液。
上述细胞的形态学观察结果表明，刚接种时，骨髓细胞悬液中的细胞呈圆形，大小不一，不能辨认细胞核，接种后第1天至第3天，可见形态相对均一的折光性较强纺锤形细胞，以及少量的成纤维细胞样的细胞，以后细胞逐渐增多，接种后第4天至第5天细胞进入对数生长期，细胞生长较快；接种后第11天至第13天细胞生长进入平台期，细胞数量扩增减慢，并开始出现融合，而且细胞逐渐出现多种形态，成纤维细胞样的细胞开始增加，可见少量大而扁平的细胞。牛骨髓间充质干细胞极易发生分化，接种密度低更不利于其生长，所以原代培养细胞密度适中(1×107个细胞/cm2)，接种后第3天至第4天形成典型集落，集落的细胞在50-100个左右(图1a)，同时可见一些微克隆。对形成集落的原代培养细胞进行瑞士-姬姆萨复合染色，光镜观察，细胞形态呈梭形状，胞核着粉红色，胞浆不着色，未见纤维丝等结构，各代之间形态较一致，细胞核有1-2个核仁，呈圆形(图1b)。
2、牛骨髓间充质干细胞的传代培养接种后第11天至第13天，原代(第一代)培养细胞生长融合后，用0.25％(质量百分含量)胰蛋白酶和0.1mmol/L的EDTA消化(消化前预热消化液，PBS冲洗细胞3次，以去除死细胞)，在倒置显微镜下观察，大约1min，当细胞突起回缩，细胞之间间隙增大，细胞接近圆形时，轻轻吹打平皿底壁，制成细胞悬液。80g离心6min弃上清液后，1∶2传代(由一个35mm平皿牛骨髓间充质干细胞经消化离心洗涤后，传代接种到2个35mm塑料平皿)，置于体积分数为5％的CO2饱和湿度，37℃培养箱中进行第二代细胞的培养，培养5-7天后，再按照上述方法进行传代、培养第三代细胞，第三代细胞培养3-4天后，再按照上述方法进行传代、培养第四代细胞。第四代细胞培养3-4天后，再按照上述方法进行传代、培养直至第十五代细胞。第十二代细胞以后，细胞形态逐渐变得不均一，细胞突起增多，大量多角形细胞出现，并且增殖能力逐渐减弱，4-6天才可达到完全融合。其中，所用的传代培养基为L-DMEM培养液+120mL/L FBS+10mL/L L-谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素。
传代细胞的形态学观察结果表明，牛MSCs原代细胞一经传代小圆形细胞均不见，第二代细胞主要为梭形、多角形(图2a)，呈现很多集落样细胞并融合成片，但是细胞间存在接触抑制，传代培养的细胞呈集落生长并融合成片，第二代牛MSCs形成的集落染色为单核，细胞呈梭形圆形和三角形，传至第10代的牛MSCs细胞集落融合形成水纹状(图2b)。原代培养接种密度适宜，虽然只见少数50-100个细胞组合的小集落，传代培养中可见大量集落形成并融合成片，第10代的细胞纯度高达98％，第10代细胞培养17天后发生融合的牛MSCs细胞成长旺盛，胞浆饱满，多个核仁(图2c)，第15代的牛MSCs细胞形成的集落染色结果如图2d。
细胞传到第12代以后，培养4-6天后，形成多细胞集落(图3)，第12代牛骨髓间充质干细胞经吉姆萨染色鉴定为单核细胞(图4)，纯度达98％。
将培养4-6天后的第十二代牛MSCs细胞作为核供体细胞进行核移植，同时以胎儿成纤维细胞作为对照。
二、去除牛卵母细胞细胞核将采集的牛卵巢，从灭菌的35℃生理盐水中取出，放在持有灭菌纸巾的左手上，选择直径为2-6mm的卵泡，用接有18G针头的5ml注射器吸取卵泡液，将抽取的含有卵母细胞的卵泡液注入15ml的离心管中，置于35℃保温水浴槽内，待沉淀后弃掉上清液，洗涤2次，将沉淀物移入到中央划有方格的平皿中，在实体显微镜下，选择有卵丘细胞附着，细胞质亮度均一，形态良好的卵母细胞，用成熟培养液洗涤2次后，移入4孔培养皿，置于39℃、体积分数为5％的CO2的培养箱中，进行22小时的成熟培养。卵母细胞成熟培养液采用CR2aa+10％SCS(Superovulated Cow Serum)+0.01mg/ml FSH(Follicle Stimulating Hormone)+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素。将成熟培养22h的在含有0.1％透明质酸酶(Sigma制)，不含Ca2+、Mg2+的HSOF液，即HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液中，吹打除掉卵丘细胞，裸卵以放出第一极体的位置，作为显微操作去核的标志。
表1HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液的组成
注浓度列中的“-”表示不含该物质。
表2、CR2aaEmbryo Culture medium
将经过22h成熟培养的卵母细胞裸卵洗净，每20个为一组移入7.5μg/ml的细胞松驰素B(CB)100μl微滴中，以显微操作仪的左手油压侧控制显微固定细管和右手侧控制显微切割针，在第一极体附近，将卵母细胞透明带切开1/3(周长的1/3)，调准切口，使其与切割针成垂直方向，固定卵母细胞，在调准卵母细胞第一极体位置后用固定管固定卵母细胞，用显微针点击透明带3点钟的位置，参照图5的点击去核法去核照片(箭头所指方向为第一极体)，或将切割针压在与卵母细胞透明带切口垂直方向(挤压法)或用微管吸引(吸引法)，除去第一极体连同下面的一小部分细胞质(核物质)。将除掉的这一小部分细胞质，放入载有2.5μg/ml Hoechst 33342液滴的载玻片上，10分钟后压片，在荧光显微镜下观察，发蓝色荧光的为去掉的DNA核。
三、移核配制2.5％蔗糖HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液(HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液+10％FBS+2.5％蔗糖)，作成100μl的微滴，将除核后的受核胞质，20个一组移入该液中，静置5分钟后，再将其移到同种液体的显微操作液微滴(100μl)中，同时将洗涤好的核供体细胞，也移到此液滴中。此时，核供体细胞和受核卵母细胞质均处于脱水状态，体积变小。将核供体细胞用微细吸管经切口处注入受核卵母细胞卵周隙，抽出显微移核细管，轻压透明带，使其切口闭合。
四、电融合及复合活性化处理将移核重构胚，移入0.25％蔗糖HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液(HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液+10％FBS+0.25％蔗糖中，静置5分钟使其复水，然后用0.25％蔗糖HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液洗涤2次，使其核质完全复原之后，用ECM2001(BTX)融合仪、1mm间隔的融合室、含有0.05％BSA的融合液(0.3M Manitol+0.5mM HEPES+0.05mMCa(C2H3O2)2+0.1mM Mg(C2H3O2)2+0.05％BSA)采用1.025kv/cm的电场强度进行直流电脉冲处理，脉冲宽度为50μs，连续2次的融合条件进行电融合，将电融合处理后的移核重构胚洗涤2次，移入0.25％蔗糖HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液中，放入38.5℃、体积分数为5％的CO2、100％湿度的常压CO2培养箱中，2小时后，观察融合状态，选择融合的重构胚，以5μl/10ml Ca-离子载体HSOF(+Ca2+、+Mg2+)液(其组成为1mg Calcium ionophore+0.191ml DMSO为储存液，5μl储存液+10ml HSOF(+Ca2+、+Mg2+)，在避光下处理4分钟，然后移入6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)SOF(+Ca2+、+Mg2+)液(其组成为2mM 6-DMAP+SOF(+Ca2+、+Mg2+)+10％FBS)中，放入38.5℃、体积分数为5％的CO2、100％湿度的常压CO2培养箱中，培养4小时，进行复合活性化处理。其中，HSOF(+Ca2+、+Mg2+)的组成为在表1的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液中加入1.17mM CaCl2和0.49mM MgCl2；SOF(+Ca2+、+Mg2+)的组成如表3。
表3、SOF(+Ca2+、+Mg2+)的组成
注浓度列中的“-”表示不含该物质。
五、移核重构胚的体外发育培养及细胞计数将复合活性化处理后的移核重构胚，移入预先放入培养箱预热平衡2h、每孔加有500μl CR2aa发育培养液(表2)的4孔培养皿中，覆盖矿物油，放入38.5℃、体积分数为5％的CO2、100％湿度的常压CO2培养箱进行7d的发育培养，观察体外培养环境条件下的重构胚的囊胚发育情况。结果如表4所示，本试验采用骨髓间充质干细胞和胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞，进行核移植试验，结果表明32h时2-cell期的卵裂率前者为70％(326/464)极显著低于后者的84.5％(300/355)(P＜0.01)；44h时4-cell期率两者间差异不显著；98-144小时桑椹胚发育率和144-168小时囊胚发育率前者分别为40.5％(188/464)和17.2％(80/464)极显著高于后者的31.6％(112/355)和9.3％(33/355)(P＜0.01)；体外培养168h骨髓间充质干细胞核移植囊胚，前者有一半的内细胞团从切口脱出透明带，形态学上克隆囊胚为长形(图6)，体外培养168小时的囊胚内细胞团完全脱离透明带能力前者(50％)极显著高于后者(6.1％)；体外培养198h的骨髓间充质干细胞克隆囊胚内细胞团完全脱离透明带，脱离透明带之后，形态学上发生很大变化，由长形变成圆形(图7)。
表4不同核供体细胞的核移植重构胚的体外发育及囊胚脱离透明带的形成
注a-bP＜0.0权利要求
1.一种控制哺乳动物性别的方法，是将哺乳动物骨髓间充质干细胞作为核供体细胞，移入到成熟的、去核的、未受精的哺乳动物卵母细胞中，进行体外重构、体外培养、胚胎移植，控制子代的性别。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述哺乳动物骨髓间充质干细胞通过密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法或密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述哺乳动物卵母细胞来自于牛、羊、兔、猫或狗。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述哺乳动物卵母细胞来自于牛。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述骨髓间充质干细胞通过以下密度梯度离心法结合贴壁筛选法方法获得将牛骨髓单细胞悬液加入密度为1.082的Percoll细胞分离液中进行离心，取液面交界处的云雾状单个核细胞层，接种于塑料容器中进行培养，去掉非贴壁细胞，得到牛骨髓间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述牛骨髓单细胞悬液与密度为1.082的Percoll细胞分离液的体积比为1∶1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述离心条件为80g离心30min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述接种密度为1×105个细胞-1×107个细胞/cm2。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述接种密度为1×107个细胞/cm2。
10.根据权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述成熟的、去核的、未受精的哺乳动物卵母细胞通过一步去核法、挤压除核法或点击去核法获得；所述点击去核法是将刚放出第一极体的哺乳动物卵母细胞的裸卵的透明带，在第一极体处切开透明带周长的1/3，再点击透明带，除去第一极体连同下面的核物质；所述1/3是透明带周长的1/3。
全文摘要
本发明公开了一种控制哺乳动物性别的方法。本发明所提供的控制哺乳动物性别的方法，是将哺乳动物骨髓间充质干细胞作为核供体细胞，移入到成熟的、去核的、未受精的哺乳动物卵母细胞中，进行体外重构、体外培养、胚胎移植，控制子代的性别。本发明用骨髓间充质干细胞克隆获得的168h囊胚，在体外继续培养体系中，50％的内细胞团可以完全脱离透明带，极显著高于体细胞克隆囊胚在继续培养中只有2－6％的囊胚可完全脱离透明带。本发明利用牛骨髓间充质干细胞核移植技术，控制良种牛性别，可降低性别控制成本，提高良种牛的生产性牛，可操作性强，为良种产业化提供技术支撑。
文档编号A61D19/00GK1908163SQ20061011264
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月28日 优先权日2006年8月28日
发明者董雅娟, 赵兴, 封纪武, 柏学进, 胡亮 申请人:莱阳农学院