专利名称：：用于治疗和诊断与骨髓增生异常综合征(mds)相关的增殖性病症的sall4的靶向的制作方法
技术领域：
：—般而言，本发明涉及与Wnt/(3-联蛋白信号通路相关的因子，更具体而言，本发明涉及通路的转录成分之间的相互作用，所述转录成分包括SALL蛋白家族和OCT4，其涉及胚胎和肿瘤干细胞的调节，包括通过靶向这些相互作用诊断和治疗增殖性病症的方法。背景信息源自胚泡的内细胞群(ICM)的胚胎干细胞能进行自我更新(self-renewing)细胞分裂并在未确定的时期内保持其多潜能性。当体外培养时，胚胎干细胞也可分化成多种不同细胞类型。Wnt/(3-联蛋白信号通路与正常人类干细胞(HSCs)和慢性髓细胞样白血病(CML)的粒系-巨噬系祖细胞(granulocyte-macrophageprogenitor)(GMPs)的自我更新相关。此外，转录因子OCT4已被鉴别为在前植入发展期间形成ICM的主要调控子。而且，OCT4蛋白通过调控宽范围的基因似乎在保持胚胎干细胞(ES)的多潜能性方面起主要作用。在癌症的病原学中，已经考虑干细胞的作用。不断增加的证据表明肿瘤可能包含着这类肿瘤干细胞，即导致肿瘤生长的稀有细胞(rarecell)。这些具有不确定增殖潜能的稀有细胞可解释癌细胞应答传统治疗方法中观察到的抗性。己知干细胞在成熟组织中可被鉴别，其中这类细胞源自特定组织；例如造血细胞。由于在正常器官发生中干细胞的自我更新特性被紧紧控制，自我更新的脱调节(de-regulation)可能导致致癌作用。例如，骨髓增生异常综合征(MDS)是在造血干细胞(HSC)—定水平下基因异常积聚为标志的血液病，在该水平下导致各类血细胞减少症、多谱系分化损伤(multilineagedifferentiationimpairment)和骨髓细胞凋亡。该疾病的致命性是由于各类血细胞减少症或转化为急性髓细胞性白血病(AML)。AML是以未成熟脊髓祖细胞(myeloidprecursor)在骨髓和外周血中的积聚为特征的血癌。从得自AML患者的骨髓样品中的基因易位(genetictranslocation)分析，显然对于血细胞生成关键的转录因子在白血病生成中起重要作用。认为AML的发病机理包括多歩基因更替。因为考虑仅HSCs具有自我更新的能力，所以HSC是多歩积累、白血病前期基因改变和将它们转化为所谓"白血病干细胞"(LSCs)的最佳候选。另夕卜，下游祖细胞(progenitor)可得到自我更新能力并且引起白血病。在当前的化学治疗方案中，LSC没有被特意耙向，然而己经发现这类细胞导致耐药性和白血病复发。SALL基因家族SALL1、SALL2、SALL3和SALL4最初基于它们的DNA序列与Drosophila^fl/"sal)的同源性而克隆。在果蝇属(Drosophila)中，印a"是形成后面的头和前面的尾片段所必需的同源异形基因。其在气管形成、光感受器的终末分化以及翅脉安置(wingveinplacement)中起重要作用。在人类中，SALL基因家族与正常发育以及肿瘤发生相关。SALL蛋白属于以在整个蛋白分布的多指结构域(multiplefingerdomain)为特征的一组C2H2锌指(zincfinger)转录因子。在果蝇气管形成中，5pa/Z是活化的无翅(Wingless)——Wnt直向同源物(ortholog)——的下游耙。已经阐明通过行使共激活因子的功能，SALL1与P-联蛋白相互作用，这表明SALL1和Wnt/(3-联蛋白信号通路之间的相互作用是双向的。发明概述本发明涉及SALL4——果蝇属(Drosophila)s戸/,的人同系物，其是发育必需的锌指转录因子。克隆并测序SALL4和其同种型(SALL4A、SALL4B和SALL4C)。本公开内容表明SALL4在人初级AML中没有停止产生。此外，阐述了在鼠科动物模型中的SALL4组成型表达的致白血病的潜力。而且，描述了形成类骨髓增生异常综合征(MDS)迹象和症状的SALL4B-转基因小鼠和随后的可植入性AML。与骨髓增生异常综合征(dysmyd叩oiesis)相关的凋亡的增加在转基因小鼠骨髓和集落形成(CFU)分析中是明显的。两种同种型能与P-联蛋白结合，并且协同增强Wnt/p-联蛋白信号通路。这表明SALL4的组成型表达引起MDS/AML，并且这类表达侵害Wnt/(3-联蛋白信号通路。在相关的方面，公开的鼠类模型提供研究人MDS/AML转化的平台，并且研究在白血病干细胞的发病机理中Wnt/(3-联蛋白通路的作用。在一个实施方式中，公开抗体或抗体片段，其与包括SEQIDNO:13所列出的氨基酸序列的多肽相结合。在另一个实施方式中，公开治疗对象中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，包括将治疗有效量的抗体施用给对象，所述抗体与包括SEQIDNO:13所列出的氨基酸序列的多肽相结合。在另一个实施方式中，提供治疗对象中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，包括将具有如下所述多核苷酸的组合物施用给对象，所述多核苷酸具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的补体、SEQIDNO:3的补体、SEQIDNO:5的补体和它们的片段中列出的序列，所述片段包括编码在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列的多核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一个实施方式中，公开治疗对象中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，包括将具有在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4禾口/或SEQIDNO:6中列出的序列的多肽组合物施用给对象。在相关的方面中，MDS是急性髓细胞性白血病(AML)。在一个实施方式中，公开诊断对象中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，包括提供对象的生物样品，将该生物样品在杂交条件下与探针接触，所述探针包括具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的补体、SEQIDNO:3的补体或SEQIDNO:5的补体列出的序列的多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，并且检测探针和生物样品之间的杂交，其中检测杂交与MDS有关。在另一个实施方式中，公开诊断对象中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，包括提供对象的生物样品，将该生物样品与抗体接触，所述抗体与包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列的多肽结合，并且检测抗体和样品之间的结合，其中检测结合与MDS有关。在一个实施方式中，提供分离白血病干细胞的方法，包括从对象获得细胞样品，从不表达SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的细胞分选表达含有SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的多肽的细胞，并且通过骨髓表面标记从表达含有SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的多肽的细胞样品选择白血病干细胞。在另一个实施方式中，提供具有人SALL4基因的转基因动物，其中修饰动物以表达含有编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸的核苷酸的人SALL4基因的序列。在相关的方面中，该动物组成型表达插入的SALL4基因。在一个实施方式中，公开了制备含有人SALL4基因的转基因动物的方法，其中修饰动物以组成型表达含有编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸的核苷酸的人SALL4基因的序列，所述方法包括将含有人SALL4基因的构建物的核酸分子引入胚胎细胞，其中所述人SALL4基因含有编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸的核苷酸，从源自引入构建物歩骤的细胞产生转基因动物，饲养该转基因动物以得到人SALL4基因纯合的转基因动物，并且检测从转基因动物的组织得到的人SALL4转录物。在一个实施方式中，公开调节多核苷酸细胞内表达的方法，所述多核苷酸编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸序列，所述方法包括将与多核苷酸杂交的双链RNA(dsRNA)或与多核苷酸杂交的反义RNA或它们的片段引入细胞。在一个实施方式中，公开了识别具有多能性潜能(pluripotentpotential)的细胞的方法，包括将从内细胞群(ICM)、肿瘤组织(neoplastictissue)或肿瘤分离的细胞与检测SALL家族成员蛋白表达的试剂(agent)接触，并且确定是否SALL家族成员蛋白在该细胞中表达，其中确定SALL家族成员蛋白在该细胞中表达与在细胞中诱导自我更新正相关，因此，这类表达表示多潜能性。在一方面，SALL家族成员包括SALL1、SALL3禾QSALL4。在相关的方面中，SALL4是SALL4A或SALL4B。在另一方面，试剂是针对SALL家族成员蛋白或与编码SALL家族成员蛋白的mRNA互补的核酸的抗体。在相关的方面中，SALL家族成员蛋白序列包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:22和SEQIDNO:24。在另一相关方面，核酸与包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:21和SEQIDNO:23的核酸序列的有义链互补。在一方面，细胞是胚胎干(ES)细胞、胚胎癌(EC)细胞、成体干细胞或肿瘤干细胞。在相关的方面中，组织是对象的血浆或活组织检査样品。在进一步相关的方面，对象是人。在一个实施方式中，公开了识别调控SALL家族成员蛋白对OCT4表达的影响的试剂的方法，包括用含有启动子-报告基因构建物的载体和含有编码SALL家族成员蛋白的核酸的载体共转染细胞，其中构建物含有可操作连接的OCT4启动子和编码基因表达报告蛋白的核酸，将该细胞与试剂接触并且检测在存在和不存在该试剂的情况下启动子-报告基因构建物的活性，其中检测启动子-报告基因构建物的活性与试剂对SALL家族成员蛋白/OCT4相互作用的影响有关。在相关的方面中，启动子区含有在SEQIDNO:26列出的核酸序列并且表达报告蛋白是荧光素酶。在另一个实施方式中，公开了诊断瘤性或增殖性疾病的方法，包括将对象细胞与检测SALL家族成员蛋白表达的试剂接触，和确定SALL家族成员蛋白是否在该细胞表达，其中确定SALL家族成员蛋白在该细胞中表达与在细胞中诱导自我更新正相关，因此，这类表达表示瘤形成或增殖。在一方面，标记该试剂并且控制歩骤包括通过将对象暴露于对该试剂位置成像的仪器检测试剂。在相关的方面中，通过磁共振、X-射线或放射性核素发射产生图像。在一个实施方式中，公幵了治疗瘤性或增殖性疾病的方法，其中对象细胞表现自我更新的脱调节，所述方法包括给对象施用含有抑制SALL4表达的试剂的药物组合物。在另一个实施方式中，公开了识别具有多能性潜能的细胞的试剂盒(kit)，其包含检测一种或多种SALL家族成员蛋白的试剂、提供试剂-细胞相互作用和标记试剂的足够条件的反应物和缓冲液、标记检测反应物和将试剂与细胞接触的说明书以及含有所述成分的容器。公开检测与增殖性疾病或瘤细胞形成进展相关的细胞的方法，包括将细胞与针对SALL4的抗体接触，将与抗体结合的细胞运用到表面分隔的腔(surfacedelimitedcavity)——该腔含有至少两个用于流体和细胞的进入或出去的孔，和允许细胞和流体通过该腔，其中在流体混合物中抗体结合的细胞通过光学检测器检测出，并且其中将电压运用到流体从而电压将结合的细胞分配到一个或多个收集器中。下面更详细地描述了根据本发明的示例性方法和组合物。附图简述图l(a-c)图解三种SALL4同种型(SALL4A，SEQIDNO:l[GenBankAcc.No.:AY172738];SALL4B,SEQIDNO:3[GenBankAcc.No.AY170621]);禾口SALL4C,SEQIDNO:5[GenBankAcc.No.AY170622]的性质。另外剪接产生两种变异体形式的SALL4mRNA。图1(a)SALL4A和SALL4B的蛋白质长度和不同数量特征sal-样锌指结构域存在具有变化。SALL4A(编码1,067氨基酸)含有八个锌指结构域，而SALL4B(编码623氨基酸)具有三个锌指结构域。SALL4C含有276氨基酸并且缺乏与全长SALL4A的氨基酸43到820相应的区域。两个变异体都具有外显子1、3和4，并且SALL4A含有1到4的所有外显子。然而，SALL4B使用另外的剪接受体，这导致外显子2的大的3'部分的缺失。图l(b)表示在不同组织中SALL4A变异体的RT-PCR分析。图解了SALL4的四个外显子和它们编码结构的能力，其中箭头表示用于SALL4转录物的PCR扩增(A)的引物。通过RT-PCR的组织依赖性SALL4转录物的表达(B)。用各种组织的cDNAs扩增对具有引物Al(外显子2)和Bl(外显子4)的SALL4A特异性的315-bp期望的产物。使用引物D1(外显子4)和C1(外显子l)扩增1,851-bp期望的SALL4B的产物。通过GAPDH确定可比较量的cDNA。图l(c)表示SALL4蛋白产物，通过SALL4肽抗体识别SALL4A禾BSALL4B。通过10%SDS-PAGE凝胶溶解短暂表达His-SALL犯(第1泳道)、His-SALWA(第2泳道)或对照载体(第8泳道)的Cos-7细胞的溶胞产物或不同人组织的溶胞产物，将它们转移到硝化纤维素膜上，并且用N-末端SALL4肽抗体探测。图2(a-b)表示SALL4在人初级AML和髓细胞性白血病细胞系中的表达。图2(a)表示在AML中，SALL4没有停止产生。标准化为GAPDH的SALL4A和SALL4B的实时PCR量表明SALL4A和SALL4B都在纯化的CD34+细胞中表达，但是在正常骨髓(N-3沐正常外周血(^3)细胞中SALL4A被快速下调并且SALL4B停止。与之相反，在15个初级AML样品和3个髓细胞性白血病细胞系(Kasumi-l、THP-1禾卩KG.l)中，SALL4A或SALL4B或者它们两者没有被下调。针对在纯化的CD34+细胞中SALL4A或SALL4B的表达校准结果。图2(b)表示在人AML(FABM1-M5,N-81)中SALL4蛋白的组成型表达，如通过免疫组织化学染色表示的。在正常骨髓(A)、正常脾脏(B)或正常胸腺(C)中，没有检测到SALL4表达。将所有细胞核染蓝。CD34+HSC/HPCs的核表明表示SALL4表达的褐色染色(D);急性髓细胞性白血病胚细胞(blasts)在微阵列白血病组织样品中表明相似的染色(E，低倍率[x4])。每一圆形代表一个白血病样品。F部分表示一个白血病样品的(F)高倍率(xlOO)图。红色箭头表示阳性核染色。图3(a-h)表示SALL4B转基因小鼠具有MDS-样/AML表型。图3(a)阐明SALL4B转基因小鼠的产生CMV/SALL4B转基因构建物和转基因系507的PCR分析。(A)转基因构建物的示意图。将SALL4B的大约1.8-kb的cDNA亚克隆入pCEP4载体，并且通过用Sail消化使CMV/SALL4构建物兴奋。(B)SALL4B在转基因小鼠中组织分布。在A部分，用于RT-PCR扩增的引物的位置用箭头表示。对于人SALL4BC-末端特异性的引物被用作5'引物，与对各种组织RT-PCR的SV40-非编码序列-特异性引物一起。图3(b)表示在SALL4B转基因小鼠中MDS-样变化。正常、年龄匹配的WT小配偶(littlemates)的外周血吉姆萨染色示出正常嗜中性粒细胞(A)，和正常红细胞和血小板(B，黑色箭头)。在转基因小鼠中，嗜中性粒细胞是多叶核的(E)，并且拟-Pelger-Huet-样非典型白细胞存在(F-H)，并且幼稚细胞数量增加(I-K)。在转基因小鼠中，也观察到成核的红细胞(L，红色箭头)、巨血小板(M，红色箭头)，和多染性(N)。在源自转基因小鼠骨髓的细胞离心涂片器(cytopsin)中，发现小叶过少(hypolobulated)核的双核发育异常的红细胞(O，红色箭头)和发育异常的巨核细胞(P，红色箭头)。WT对照动物的红细胞前体(C)和巨核细胞(D)被表示以进行比较。图3(c)表明AML在SALL4B转基因小鼠中可观察到。在外周血(A，x600)、骨髓活检标本(B，xlOO;C，x400)、骨髓涂片(D，x600)、肝(E，x100)、淋巴结(F，x400)和脾(G和H，大体观察(grossview);I，xlOO;和插入图x400)中，存在胚细胞。图3(d)表示SALL4B转基因小鼠中AML的流式细胞术分析。对于CD45、c-kit、Gr-l和Mac-l，AML细胞是阳性的；对于B220、CD3和Terl19是阴性的。图3(e)表示将SALL4B-诱导的AML连续植入NOD/SCID小鼠。在白血病植入后6周，在NOD/SCID小鼠中，通过白血病浸润引起的脾肿大(3e-A黑色箭头，3e-C)、肝肿大(3e-A双黑色箭头，3e-D)、淋巴结肿大(3e-B黑色箭头，3e-E)和肾无力(palekidney)(3e-B双黑色箭头，3e-F)的总图(A&B)和组织学(B、C、D、E,x200)。图3(f)表明SALL4B转基因和对照小鼠的骨髓之间的比较。与对照WT小鼠相比，SALL4B转基因小鼠骨髓示出增加的细胞构成(cellularity)、骨髓种群(Gr-l/Mac-l双阳性)、幼稚种群(c-kit阳性)和凋亡(膜钙蛋白V阳性，PI阴性)。图3(g)表示在SALL4B转基因小鼠的CFU中有增加量的幼稚细胞和凋亡。在培养的第7天，在SALL4B转基因小鼠的CFU中比对照CFU(A)中观察到更大量的幼稚细胞(B、C和D，红色箭头)和凋亡细胞(B、C和D，双红色箭头)。与这种形态学观察相一致，有增加的凋亡(膜钙蛋白V阳性，PI阴性，E)和更多的CD34+幼稚细胞(F)。图3(h)阐述SALL4B转基因和对照小鼠的骨髓CFU之间的比较。在SALL4B转基因和对照小鼠(A)中，发现不同类型群落的百分比。与对照小鼠相比，SALL4B转基因小鼠CFU表明CFU隱GM(B)(转基因53.6±10.3,N=13，相对比WT:38.1±3.1，N=8;P^.002)统计显著增力B，并且BFU-E(转基因7.8士3.8,N43，相对比WT:14.1±2.7,N=8;P=O.OOl)增加。图4(a-d)表示SALL4和Wnt/p-联蛋白信号通路之间的相互作用。图4(a)表明SALL4A和SALL4B都可以与|3-联蛋白相互作用。用HA-SALL4A或HA-SALL4B短暂转染从Cos-7细胞制备的核提取物(溶胞产物)。(A)抗-HA抗体识别SALL4A(165kDa)和SALL4B(95kDa)。(B)在溶胞产物检测(3-联蛋白。(C)使用HA亲和性树脂实施免疫沉淀反应，并且使用抗P-联蛋白抗对其进行检测。卩-联蛋白在HA-SALL4A和HA-SALL4B降低中很容易检测。图4(b)表示SALL4A和SALL4B活化Wnt/p-联蛋白信号通路。用l.Opg的SALL4A或SALL4B质粒和TOPflash报告质粒(UpstateUSA,Chicago,IL)转染NIH3T3细胞。在用Wntl或模拟品剌激24-h后，测量荧光素酶活性。图4(c)表示在CML的胚细胞期(N42)而不是慢性期(N41)存在SALL4蛋白表达，如免疫组织化学染色表示的。(A)表示在不同时期的CML标本的组织阵列的低倍数示图。在慢性期CML(B)不存在SALL4表达，所有细胞核保持蓝色(B,x4;D，x400)。然而在胚细胞-转捩(crisis)-期CML存在SALL4表达，如SALL4棕色核染色所指出的(C,x4;E,x400)。在CML加速期(N-6)，其中胚细胞数量增加但是仍<15%，仅幼稚胚细胞被观察到对SALL4表达染色阳性(F,红色箭头)；成熟嗜中性粒细胞不染色(F，黑色箭头，x600)。图4(d)表示工作假设(workinghypothesis)。在人千细胞/祖细胞表达SALL4，但是在正常血细胞生成期间不存在成熟造血细胞。SALL4同种型的组成型表达(没有停止产生SALL4)导致阻断分化和具有千细胞库(stemcellpool)异常膨胀的组成型更新，这导致白血病转化(+，存在SALL4表达；-，不存在SALL4表达)。图5图解SALL4B对OCT4启动子剂量依赖性的影响。将0.3吗的OCT4-Luc构建物(PMOct4)和O.l吗海肾质粒和增加量的(0-1.0吗)SALL4B或pcDNA3载体对照共转染。图6表示OCT4对SALL基因家族成员启动子的影响。每一(0.3|ttg)SALL-Luc启动子构瑋物(即pSALLI、pSALL3和pSALL4)和0.9吗的OCT4或pcDNA3载体对照在HEK-293细胞中共转染。转染后24小时后，评估每一组的荧光素酶活性。图7表示SALL4同种型A和B对SALL4启动子活性的影响。将0.3叫的SALL4-Luc和O.lpg表达质粒的SALL4A或SALL4B在不同细胞系(HEK-293或COS-7)中共转染；pcDNA3载体被用作对照。将荧光素酶活性标准化为海肾报告活性。值表示三次实验的平均士标准差(s.e.)。图8表示SALL4A对SALL4启动子活性的剂量依赖性影响。在HEK-293细胞中，将0.3叫的SALL4-Luc禾口0.1pg海肾质粒和增加比例的SALL4A构建物和对照pcDNA3载体共转染。将荧光素酶活性标准化为海肾报告活性。图9表示SALL4A对SALL1和SALL3启动子活性的影响。每一(0.3|ig)SALL-Luc启动子构建物和0.9吗的SALL4A质粒或pcDNA3载体(对照)在HEK-293细胞中短暂共转染。图10表示在存在过量SALL4A情况下，OCT4对SALL4启动子的影响。将0.25吗的SALL4-Luc构建物(pSALL4)与等量(0.5pg)的SALL4A和OCT4质粒在HEK-293细胞中瞬时共转染。将pcDNA3用作对照。图11表示在存在SALL4情况下，OCT4对其它SALL成员启动子的影响。用不同SALL成员启动子报告基因(pSALLl或pSALL3)和OCT4质粒和/或SALL4A构建物瞬时共转染在24孔平板中接种的HEK-293细胞。将pcDNA3用作对照。图12表示，自身启动子相互作用对其它SALL蛋白家族成员启动子活性的影响。将HEK-293细胞接种于24孔平板上，并且用0.3吗SALL1-Luc报告构建物和各种量的SALL1质粒(0.45和0.9ng)SIXl——先前发现活化SALU启动子，并被用作阳性对照——进行瞬时转染和共转染。将荧光素酶活性标准化为海肾报告活性。发明详述在描述本发明的组合物、方法和培养方法之前，应该理解本发明不拟限定于所描述的特定的组合物、方法和实验条件，同样组合物、方法和条件可以变化。也应该理解本文使用的方法仅仅是以描述具体实施方式为目的的，其不拟进行限定，因为本发明的范围仅仅在所附的权利要求书中进行限定。如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式"一("a"、"an"和"the")"包括复数涵义，除非文中明确指明相反。因此，例如"一种核酸(anuclearacid)"的涵义包括一种或多种核酸，和/或本文描述的组合物类型，在阅读了本公开内容等后，对本领域普通技术人员是显而易见的。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员共同理解的意义相同的意义。相似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料可被用于本发明的实施或检测，将被理解修改和变化被包含在本公开的精神和范围内。本文所提及的所有出版物整体被引入本文作为参考。同源基因框基因和同源异型基因在正常发育中起重要作用。一些同源基因框基因如Hox和Pax也在肿瘤发生或白血病发生中行使癌基因或肿瘤抑制物的功能。因为异质SALL4突变导致杜安放射线综合征(DuaneRadialRaysyndrome),所以在人发育中，SALL4、同源异型基因和转录因子的重要作用被认知。在相关的方面中，本文描述在白血病发生中SALL4的癌基因作用。在一个实施方式中，本公开内容鉴别两种SALL4同种型SALL4A和SALL4B。在相关的方面中，本公开提供SALL4核酸和蛋白质作为工具诊断和治疗具有增殖性疾病如血液恶性肿瘤和其它包含SALL4核酸和蛋白质组成型表达的肿瘤的分析。在相关的方面中，SALL4作为恶性干细胞标记，以便诊断和治疗癌症。例如，在血细胞生成期间，SALL4同种型在CD34+HSC/HPC群中表达，并且在正常人骨髓核外周血中迅速停止(SALL4B)或下调(SALL4A)。与之相比，在被检测的所有AML样品(N-81)中，SALL4被组成型表达，并且在人初级AML和髓细胞性白血病细胞系中没有停止。在相关的方面中，通过SALL4B转基因小鼠的产生，直接检测体内SALL4组成型表达的致白血病能力。这类转基因小鼠表现了失调的血细胞生成，非常像人MDS的血细胞生成失调，并且表现AML是可植入的。在这些SALL4B转基因小鼠中，MDS-样特征不需要协同突变并且在最早2个月大的时候被观察到。在这些小鼠中观察到的无效血细胞生成的特征为如在人MDS中，细胞过多的骨髓和反常的外周血细胞减少(嗜中性粒细胞减少和贫血)和发育异常，这相对于注意到的骨髓中增加的凋亡可能是次要的。尽管不被理论所束缚，在这些转基因小鼠中，白血病形成后期发作原因可能是在28个月的重复应力(replicativestress)期间，额外的基因损伤的积聚。疾病的后期发作也可能是SALL4-诱导的基因组不稳定性。此外，特异性、再发的染色体易位表现许多白血病的特征，其可山于免疫球蛋白或T细胞受体基因重排的正常过程的衰减(breakdown)，这引起之间-染色体易位而不是内染色体重排。在染色体易位断裂点将遗传信息从基因流到蛋白质具有几个治疗剂可以干扰的点。研究锌指结合蛋白结构域的序列特异性结合元素可被用来产生能作为基因开关(geneswitch)的新生序列特异性结合元素，所述基因开关可靶向染色体融合连接以停止异常基因融合产物的表达。在一个实施方式中，SALL4可被用作作为基因开关靶向染色体融合连接的融合蛋白的成分，以调节基因融合产物的表达。重组融合蛋白的产生在本领域是公知的(参见，例如Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989》。在一个实施方式中，检测SALL4蛋白和/或核酸，以诊断淋巴瘤和白血病或其它类型癌症的亚群。在另一个实施方式中，SALL44蛋白和核酸的检测可被用来识别处于形成/或得增殖性疾病的危险下的对象，包括但不限于人类对象。在进一步的实施方式中，公开用于鉴别改变SALL44蛋白和核酸水平的化合物的方法。在相关的方面中，SALL4可作为治疗靶，其中阻断SALL4的功能可抑制肿瘤的形成和发展。在另一方面，涉及白血病发生的潜在机制的研究表明SALL4A和SALL4B与P-联蛋白相互作用，所述P-联蛋白是涉及HSC自我更新的Wnt信号通路的必要成分。另外，在受体基因分析中，它们两种都能活化Wnt/p-联蛋白通路，这与在果蝇和人类中SALL家族功能相一致。而且，与P-联蛋白的情况相似，SALL4在CML中的表达在不同的疾病期变化在慢性期不存在SALL4表达，在加速期仅在幼稚胚细胞中可检测到，而在胚细胞期中强烈阳性。在这些研究的基础上，公开了工作假设(例如，参见图4d)。尽管不被理论所束缚，AML中SALL4的组成型表达可能使白血病胚细胞获得干细胞的特性，如自我更新和/或去分化，并且因此成为LSCs。该假设的模型与在卩-联蛋白的情况中所见到的类似。例如，在正常髓细胞生成中，(3-联蛋白仅仅在拥有自我更新特性的HSC中活化。在CML的胚细胞期，P-联蛋白通过在GMP中活化得到功能，这导致白血病转化。在另一方面，癌基因SALL4在正常血细胞生成和白血病发生中起重要作用。SALL4B转基因小鼠表现MDS-样表型，并且随后AML转化是可植入的。对于研究人类MDS,很少有动物模型目前是可行的。通过本文描述的方法产生的SALL4B转基因小鼠提供理解和治疗人MDS和其随后转化为AML的适合的动物模型。SALL4和Wnt/p-联蛋白信号通路之间的相互作用不但提供涉及白血病发生的SALL4的似乎正确的机制，而且促进理解在CML胚细胞转化中的Wnt/p-联蛋白信号通路的活化。如本文公开的，检查在所有人AML中的SALL4同种型和它们的组成型表达的鉴别。在体内，检测AML中SALL4表达的直接影响。公丌内容表明，在小鼠中SALL4的组成型表达足以诱导MDS-样症状和转化为AML,其是可植入的。本公开内容也表明SALL4能与(3-联蛋白结合并且活化Wnt/(3-联蛋白信号通路。SALL4和P-联蛋白在CML的不同期中具有相^i的表达方式。在一个实施方式中，提供含有下述序列的分离的多核苷酸，所述序列编码SEQIDNO:2(GenBankAcc.No.AAO44950)、SEQIDNO:4(GenBankAcc.No.AA016566)或SEQIDNO:6(GenBankAcc.No.AA016567)所列出的氨基酸序列。在相关的方面中，这些序列包含SEQIDNO:1(GenBankAcc.No.AY172738)、SEQIDNO:3(GenBankAcc.No.AY170621)、SEQIDNO:5(GenBankAcc.No.AY170622)或它们的补体所列出氨基酸序列。在另一相关方面，也公开了含有这些多核苷酸的载体，包括但不限于，在宿主细胞中可操作连接到指导多核苷酸表达的调节序列的表达载体。在另一个实施方式中，提供含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的分离的多肽。在一方面，提供治疗个体中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，该包括施用这类多肽。在另一方面，也公开与这类多肽结合的抗体或其结合片段。被用于公开的方法中的抗体包括特异性结合含有SALL4或在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的其同种型的多肽的抗体。在一方面，SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的片段被用于产生这些抗体。在相关的方面中，这样的片段基本上由SEQIDNO:13组成。在一个实施方式中，公开识别具有多潜能性潜力的细胞的方法，包括将从内细胞群(ICM)、肿瘤组织或肿瘤隔离的细胞与检测SALL家族成员蛋白表达的试剂接触，并且确定是否SALL家族成员蛋白在该细胞中表达，其中确定SALL家族成员蛋白在该细胞中表达与在细胞中诱导自我更新正相关，因此，这类表达表示多潜能性。在一方面，SALL家族成员包括SALL1、SALL3禾卩SALL4。在相关的方面中，SALL4是SALL4A或SALL4B。在另一方面，试剂是针对SALL家族成员蛋白或与编码SALL家族成员蛋白的mRNA互补的核酸的抗体。在相关的方面中，SALL家族成员蛋白序列包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:22和SEQIDNO:24。在另一相关方面，核酸与包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:21和SEQIDNO:23的核酸序列的有义链互补。在一方面，细胞是胚胎干(ES)细胞、胚胎癌(EC)细胞、成体干细胞或肿瘤干细胞。在相关的方面中，组织是对象的血浆或活组织检査样品。在进一步相关的方面，对象是人。如本文使用的，"多潜能性潜力"指细胞通过有丝分裂更新自己的能力。如本文使用的"正相关"指与观察到的现象肯定相关。例如，SALL4A或SALL4B的诱导与细胞更新能力相关。如本文使用的"瘤(neoplasm)"包括其语法上的变化，指组织新的和异常的生长，其可以是良性的或癌性的。如本文使用的"基本由……组成"包括特定分子实体(例如，但不限于特定序列鉴定剂(identifier))和不在本质上影响与特定分子实体相关的特性的其它分子实体。例如，对于产生针对SEQIDNO:2、SEQIDNO:4禾卩/或SEQIDNO:6的免疫原应答，含有SEQIDNO:13和佐剂的融合蛋白，将基本由SEQIDNO:13组成。抗体是本领域公知的并且例如，在美国专利第6,391,589号中被讨论。本发明的抗体包括但不限于多克隆的、单克隆的、多特异性、人、人化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库产生的片段、抗-个体基因型(抗-Id)抗体(包括例如对本发明的抗体的抗-Id抗体)和上述任何的抗原表位结合片段。如本文使用的术语"抗体"指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原免疫结合的抗体结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚种。本发明的抗体包括抗体片段，其包括但不限于Fab、Fab邻F(ab')2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)和含有VL或VH结构域的片段。包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段可以包括仅仅可变区(一个或多个)或者可变区(一个或多个)与下列的全部或部分的组合铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明也包括抗原结合片段，其也包括可变区(一个或多个)和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明的抗体也可以是任何包括鸟类和哺乳动物在内的动物源的。在一方面，抗体是人、鼠科动物(例如小鼠和大鼠)、驴、绵阳、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡源的。此外，这些抗体可以是动物抗体的人化版本(参见例如美国专利第6,949,245号)。本发明的抗体可以是单一特异性的、二特异性的、三特异性的或更多的多特异性。通过本领域已知的适当的方法可以产生本发明的抗体。目的抗原的多克隆抗体可以通过在本领域公知的多种方法产生。例如，本发明的多肽可被施用给多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导产生含有对抗原特异性的多克隆抗体的血浆。各种佐剂可被用来增加免疫反应，这取决于宿主种类，所述佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全或不完全的)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronicpolyols)、多聚阴离子、多肽、油乳胶、匙孔嘁血蓝蛋白、二础基苯酚和潜在可用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。这些佐剂也是本领域公知的。此外，抗体和类抗体结合蛋白也可通过噬菌体展示制备(参见，例如SmithandPetrenko,ChemRev(1997)97(2):391-410)。可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，所述技术包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或它们的组合。例如，可以使用本领域已知的在下列文献中教导的杂交瘤技术产生单克隆抗体例如，Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988);Hammerling,etal.,:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.，1981)(所述文献整体被引入本文作为参考)。如本文使用的术语"单克隆抗体"不限定于通过杂交瘤技术产生的。术语"单克隆抗体"指源自单一克隆的抗体，包括真核、原核或噬菌体克隆，并且不限定于产生克隆的方法。在一个实施方式中，提供使用这类抗体分离白血病干细胞的方法，包括从对象获得细胞样品，从不表达SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的细胞分选表达SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的细胞，并且通过骨髓表面标记从表达SEQIDNO:13中列出的氨基酸序列的多肽的细胞样品选择白血病干细胞。在相关的方面中，分选步骤包括通过荧光激活细胞分选法和/或磁珠分选法进行分选。在另一相关方面，标记是CD34、c-kit、Gr-l、Mac-l、MPO和/或非特异性酯酶。在进一步相关的方面，其中白血病干细胞对于B细胞(B220和CD19)、T细胞(CD4、CD8、CD3和CD5)、巨核细胞(CD41)和红细胞(Ter119)标记是阴性的。在一个实施方式中，公开识别具有多能性潜能的细胞的试剂盒，其包含检测一种或多种SALL家族成员蛋白的试剂、提供试剂-细胞相互作用和标记试剂的足够条件的反应物和缓冲液、标记检测反应物和将试剂与细胞接触的说明书以及含有所述成分的容器。根据本公开内容的方法识别干细胞首先从细胞群中不含有SEQIDNO:13标记表达阳性的细胞中分选含有SEQIDNO:13标记表达阳性的细胞。然后，从阳性标记细胞选择目的干细胞；这通过分选已知细胞标记的表达进行实施。已知与目的干细胞相关的任何标记都可被使用。根据本公开的方法，可以分选任何经猜测发现干细胞的细胞群。在一方面，细胞从非胎动物的骨髓获得，其包括但不限于人细胞。也可使用胎细胞。可以通过分选细胞领域已知的任何方法分选细胞，包括通过荧光激活细胞分选法(FACS)(参见，例如BaumgarthandRoederer,JImmunolMethods(2000)243:77-97)和或磁珠分选法(MACS)进行分选。传统的MACS方法被Miltenyi等所描述"HighGradientMagneticCellSeparationwithMACS,"Cytometry11:231-238(1990)。为了通过MACS分选细胞，用磁珠标记细胞，并且将细胞通过磁分离柱。该分离柱被置于强的永久磁铁中，从而在柱内产生磁场。被磁标记的细胞在柱内被捕获；没有标记的细胞通过柱。然后，从柱上洗脱捕获的细胞。在一个实施方式中，针对SALL4的抗体被用于细胞分选，以分离胚胎干细胞、成体干细胞和/或肿瘤干细胞。在另一个实施方式中，针对SALL4的抗体被用于流式细胞术分析以检测表达SALL4的细胞，其中这些细胞与增殖型疾病进展或瘤细胞形成相关。在相关的方面中，SALL4是SALL4A或SALL4B。在一个实施方式中，公开了检测在生物样品中含有编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的核酸序列的多核苷酸存在或不存在的方法，包括但不限于在杂交条件下，将生物样品与探针接触，所述探针包括具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5、或SEQIDNO:1的补体、SEQIDNO:3的补体或SEQIDNO:5的补体列出的序列的多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段，并且检测探针和生物样品之间的杂交，其中杂交指示多核苷酸存在。在另一个实施方式中，公开了检测存在于生物样品中含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽的方法，包括但不限于提供与多肽结合的抗体，将该生物样品与抗体接触，并且检测抗体和生物样品之间的结合，其中结合指示多肽存在。在一个实施方式中，描述治疗对象中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，包括将具有如下所述多核苷酸的组合物施用给对象，所述多核苷酸具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的补体、SEQIDNO:3的补体、SEQIDNO:5的补体或它们的片段列出的核酸序列，所述片段包括编码在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列的多核苷酸的至少15个连续核苷酸。在相关的方面中，该方法包括施用SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5列出的多核苷酸。在一方面，MDS是急性髓细胞性白血病(AML)。在一个实施方式中，公开识别调控SALL家族成员蛋白对OCT4表达的影响的试剂的方法，包括用含有启动子-报告基因构建物的载体和含有编码SALL家族成员蛋白的核酸的载体共转染细胞，其中构建物含有可操作连接的OCT4启动子和编码基因表达报告蛋白的核酸，将该细胞与试剂接触并且检测在存在和不存在该试剂的情况下启动子-报告基因构建物的活性，其中检测启动子-报告基因构建物的活性与试剂对SALL家族成员蛋白/OCT4相互作用的影响有关。在相关的方面中，启动子区含有包括但不限定于SEQIDNO:26的核酸序列，并且表达报告蛋白是荧光素酶。在另一个实施方式中，公丌治疗瘤性或增殖性疾病的方法，其中对象细胞表现自我更新的脱调节，所述方法包括给对象施用含有抑制SALL4表达的试剂的药物组合物。在另一个实施方式中，提供鉴别与含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出多肽结合的物质的方法，其中所述方法包括将多肽与候选物质接触，并且检测该物质与多肽的结合。在一个实施方式中，公开鉴别调节多肽功能的物质的方法，所述多肽含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所列出的氨基酸序列，其中所述方法包括将多肽与候选物质接触，并且检测多肽的活性，其中在存在候选物质的情况下活性的改变指示该物质调节多肽功能。在另一个实施方式中，描述诊断对象中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，包括但不限于提供对象的生物样品，将该生物样品在杂交条件下与探针接触，所述探针包括具有在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:1的补体、SEQIDNO:3的补体或SEQIDNO:5的补体列出的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的片段，并且检测探针和生物样品之间的杂交，其中检测杂交与MDS有关。在一方面，MDS是急性髓细胞性白血病(AML)。在另一个实施方式中，描述诊断对象中骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，包括但不限于提供对象的生物样品，将该生物样品与抗体接触，所述抗体与包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中列出的氨基酸的多肽结合，并且检测抗体和样品之间的结合，其中检测结合与MDS有关。在一方面，MDS是急性髓细胞性白血病(AML)。在一个实施方式中，公开诊断瘤性或增殖性疾病的方法，包括将对象细胞与检测SALL家族成员蛋白表达的试剂接触，和确定SALL家族成员蛋白是否在该细胞表达，其中确定SALL家族成员蛋白在该细胞中表达与在细胞中诱导自我更新正相关，因此，这类表达表示瘤形成或增殖。在一方面，标记该试剂并且控制步骤包括通过将对象暴露于对该试剂位置成像的仪器来检测试剂。在相关的方面中，通过磁共振、X-射线或放射性核素发射产生图像。在一个实施方式中，为一种调节多核苷酸细胞内表达的方法，所述多核苷酸编码在初级急性髓细胞性白血病细胞中组成型表达的锌指转录因子，所述方法包括将与多核苷酸杂交的双链RNA(dsRNA)或与多核苷酸杂交的反义RNA或它们的片段引入细胞。在相关的方面中，该调节是下调。在一个实施方式中，公开转基因动物。在通常的方面，通过以允许转基因表达的方式引入外源基因产生转基因动物。制造转基因动物的方法被普遍描述Wagner和Hoppe(美国专利第4,873,191号；其被引入本文作为参考)、Brinster等((1985);其全部被引入本文作为参考)和"ManipulatingtheMouseEmbryo;ALaboratoryManual"2ndedition(eds"Hogan，Beddington,CostantimiandLong,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1994);其全部被引入本文作为参考)。典型地，通过微量注入受精卵，转移基因。将微量注入的卵植入雌性宿主，并且筛选转基因表达的子代。转基因动物可以从大量动物的受精卵产生，所述动物包括但不限于爬行类动物、两栖类动物、鸟类、哺乳动物和鱼类。可以通过本领域已知的任何方法制备微量注入的DNA克隆。例如，可以用适当的酶切割微量注入的DNA克隆，以除去细菌质粒序列，并且使用标准技术在TBE缓冲液中的1。/。琼脂糖凝胶上电泳DNA片段。通过用溴化乙淀染色使DNA带可见，并且切离含有表达序列的带。然后，将切离的带置于含有0.3M乙酸钠、pH7.0的透析袋中。将DNA电洗脱入透析袋中，并用l:l的苯酚氯仿溶液洗提和通过两体积的乙醇沉淀。将该DNA重新溶解于1m的低盐缓冲液(0.2MNaCl、20mMTris、pH7.4和1mMEDTA)中，并且在Elutip-DTM柱上将其纯化。首先用高盐缓冲液(lMNaCl、20mMTris、pH7.4和1mMEDTA)预处理该柱，然后用5ml低盐缓冲液进行洗涤。使DNA溶液通过该柱三遍，以将DNA结合到柱基质。在用3ml低盐缓冲液洗涤后，用0.4ml高盐缓冲液洗脱该DNA，并且通过两体积的乙醇沉淀。通过在UV分光光度计中260nm处的吸收，测量DNA的浓度。本发明也提供含有至少一种有效量的能治疗病症的化合物和药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。本发明的组合物可含有其它治疗剂，如所描述的，并且可以被配制例如根据技术如在药学制剂领域公知的那些技术，使用传统的固体或液体载体或稀释剂以及对期望给药方式的恰当类型的药学添加剂(例如，赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、香料等)。用作发明制品成分的药物组合物可以以固体、溶液、乳液、分散体、微胶粒、脂质体等形式使用，其中所形成的组合物包括一种或多种上述化合物作为活性成分，与适合于肠内或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂混合。用作发明制品成分的化合物可以与例如通常无毒的，对于片剂、丸剂、囊剂、栓剂、溶液、乳液、悬液和其它适合使用的形式的药学可接受的载体相组合。可以使用的载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶体硅、马铃薯淀粉、尿素、中等链长度甘油三酯、葡聚糖和其它适合用于制备制剂的载体，其可以是固体、半固体或液体形式。另外，也可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂以及香料。本发明的药物组合物可以以含有无毒、药学可接受的载体或稀释剂的剂量单位制剂形式、以任何适当的方式给药，例如口服的，如以片剂、囊齐!J、颗粒或粉末的形式；舌下的；口腔的；肠胃外的，例如通过皮下、静脉内、肌肉内或脑池内注入或输注技术(例如，作为无菌可注射的水或非水溶液或悬液)；鼻的，如通过吸入喷雾；局部的，如以乳膏或软膏的形式；或者直肠的，如以栓剂的形式。本发明的化合物例如可以以适合立刻释放或延长释放的形式给药。通过使用含有本发明化合物的适合的药物组合物可以实现立刻释放或延长释放，或者特别在延长释放的情况下通过使用设备如皮下植入片(subcutaneousimplants)或渗透泵实现所述释放。本组合物也可以用脂质体给药(administeredliposomally)。除了灵长类如人，各种其它哺乳动物可根据本发明的方法进行治疗。例如，包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它牛科动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或鼠科种类的哺乳动物也可被治疗。然而，在其它物种例如鸟类(例如鸡)，该方法也可被实行。在上述方法中治疗的对象一一其中需要耙向细胞进行调节，是哺乳动物，其包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它牛科动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或鼠科种类，并且优选人类，男性或女性。术语"治疗有效量"指诱发出正在被研究人员、兽医、医学博士或其它临床医师研究的组织、系统、动物或人的生物或医学反应的对象化合物的量。如本文使用的术语"组合物"拟包括含有特定成分、特定量的产物，以及可以直接或间接由特定成分、特定量组合产生的任何产物。至于"药学可接受的"，其指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害。术语化合物的"给药"和/或"施用"化合物应该被理解为指将本发明的化合物提供给需要治疗的个体。用于施用本发明化合物的药物组合物可以简单的以剂量单位形式存在，并且可以通过药物领域公知的任何方法进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种补充成分的载体结合。一般而言，通过使活性成分均一并紧密与液体载体或细分固体载体或这两者结合，然后如果需要使产品形成需要的剂型。在药物组合物中，以足够对疾病的过程或症状产生预期效果的量包含活性目标化合物。含有活性成分的药物组合物可以是适合口服应用的形式，例如片剂、药片、锭剂、水或油悬液、可分散的粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊或糖浆剂或酏剂。意欲用于口服应用的组合物可以根据药物组合物制造领域任何已知的方法进行制备，并且这类组合物可以含有选自下列的一种或多种试剂甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供药学上精致和可口的制剂。片剂含有与药学可接受的无毒赋形剂混合的活性成分，所述赋形剂适合于制造片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸l丐或磷酸钠；粒化或崩解剂，例如玉米淀粉或褐藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是没有包衣的或者它们可以通过已知的技术包衣，以延迟在胃肠道崩解和吸收，并因此在更长的时期提供持续作用。例如，可以使用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可被包衣以形成控制释放的渗透性治疗片剂。用于口服应用的制剂也可作为硬胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，所述惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或者用于口服应用的制剂也可作为软胶囊存在，其中活性成分与水或油介质混合，所述介质如花生油、液体石蜡或橄榄油。水性悬液含有与适合制造水性悬液的赋形剂混合的活性成分。这类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可以是天然发生的磷脂例如卵磷脂，或者是烯烃氧化物与脂肪酸的縮合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者是烯烃氧化物与长链脂肪醇的縮合产物例如十七碳乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol),或者氧化乙烯(ethyleneoxide)与从脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的縮合产物例如聚氧乙烯山梨醇一油酸酯(polyoxyethylenesorbitolmonooleate)，或者氧化乙烯与从脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合产物例如聚乙烯失水山梨糖醇一油酸酯(polyethylenesorbitanmonooleate)。水性悬液也可包含一种或多种防腐剂例如乙基或正-丙基对-羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。油性悬液可以通过将活性成分悬浮于植物油而配制，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或者悬浮于矿物油而配制，所述矿物油例如液体石蜡。油性悬液可含有增稠剂例如蜂蜡、固体石蜡或十六醇。可以加入增稠剂如前面列出的那些和调味剂以提供可口的口服制剂。可以通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸，保存这些组合物。适合于通过加入水制备水性悬液的可分散粉末和颗粒，提供与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂以上面已经提到的那些作为实例。额外的赋形剂例如甜味剂、调味剂和着色剂也可以存在。糖浆剂或酏剂可以与甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖一起配制。这类剂型也可含有润滑剂、防腐剂和调味剂以及着色剂。药物组合物可以是无菌可注射水或油悬液。可以根据己知技术使用前面所述的适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该悬液。无菌可注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如为1,3-丁二醇中的溶液。可以被使用的可接受的载体或溶剂是水、林格液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油传统上被用作溶剂或悬浮介质。因为这个原因，可以使用任何温和的不挥发性油，其包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸可用于制备可注射剂(injectable)。本发明的化合物也可以栓剂的形式被施用以用于直肠给药。通过混合药物和适合的非刺激性的赋形剂——其在普通温度下是固体，但是在直肠温度下是液体，并因此在直肠融化释放药物——可以制备这些组合物。这样的材料是可可脂和聚乙二醇。为了局部应用，使用含有本发明的化合物的乳膏、软膏、凝胶剂、溶液或悬液等。(为了该应用，局部应用应该包括漱口剂类和含漱液)。根据本公开内容的核酸——其编码能干扰SALL4的多肽或肽一一可被用于基因治疗方法，例如治疗个体，其目标为防止或治愈(完全或部分)肿瘤例如癌症，或涉及失去细胞循环和/或细胞生长的适当调控的其它病症，或需要特异性细胞死亡的其它病症。载体例如病毒载体已被用于本领域以将核酸引入宽范围的不同靶细胞。典型地，将载体暴露于耙细胞，以便转染可以在足够比例的细胞中发生，以从期望多肽的表达提供有用的治疗或预防效果。转染的核酸可以被永久的引入每一靶向肿瘤细胞的基因组中，这提供长期持久的效果，或者可选地治疗可能必须被周期性的重复。多种载体一一病毒载体和质粒载体——在本领域是已知的，参见美国专利第5,252，479号和WO93/07282。具体而言，大量病毒已被用作基因转移载体，包括乳多空病毒例如SV40、痘苗病毒、疱疹病毒属包括HSV和EBV、以及逆转录病毒。在本领域许多基因治疗方案已经使用无能力的鼠科逆转录病毒。将核酸引入细胞的替代应用病毒载体的其它己知方法包括电穿孔、磷酸钙共沉淀、机械技术例如微量注射、冲击方法、脂质体介导的转移和直接DNA摄取以及受体介导的DNA转移。受体介导的基因转移一一其中将核酸通过多聚赖氨酸连接到蛋白质配体，其中配体对在靶细胞表面上存在的受体是特异性的——是将核酸特异性靶向特定细胞的技术的一个实例。在对象的治疗中——其中靶向细胞进行调节，适当剂量水平通常是每千克患者体重每天大约0.01到500mg，这可以以单一或多剂型施用。优选地，剂量水平是每天大约0.1到大约250mg/kg;更优选地，每天大约0.5到大约100mg/kg。适当的剂量水平可以是每天大约0.01至IJ250mg/kg，大约0.05至U100mg/kg，或者大约0.1到50mg/kg。在该范围内，剂量可以是每天0.05到0.5、0.5到5或5到50mg/kg。对于口服给药，组合物优选以含有1.0到1000毫克活性成分特别是1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分的片剂形式提供，以根据待被治疗的患者症状调节剂量。化合物可以按照每天1到4次的方案给药，优选每天一次或两次。然而，应该理解，对于任何特定患者具体的剂量水平和给药频率可以改变，这并将取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用长度、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药模式和时间、排泄速率、药物组合、具体病症的严重性和宿主经历的治疗。下面的实施例用于阐明而非限制本发明。实施例1方法分子克隆根据标准方法实施质粒构建和DNA测序。对于克隆SALL4同种型，基于基因组克隆RP5-1112F19(SEQIDNO:25)(GenBank登记号AL034420)，设计PCR引物。根据供应商的方案，使用源自人胎儿肾(BDBiosciencesClontech,PaloAlto,CA)的Marathon-ReadycDNA文库克隆SALL4同种型。将扩增的PCR产物克隆入TA克隆载体(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)，并且通过DNA测序检测核苷酸序列。通过PCR，并使用在每一端具有限制性内切酶位点BamHI的5'引物和3'引物，产生GAL4-SALL4B构建物5'引物5'-TTATCAGGATCCTGGTCGAGGCGCAAGCAGGCGAAACCC-3'(SEQIDNO:7);禾口3'引物5'-CCAGGATCCTTAGCTGACCGCCAATCTTGTTTC-3'(SEQIDNO:8)。期望GAL4-SALL4B构建物编码最小GALDNA-结合结构域和全长SALL4B的493氨基酸，除了第一个氨基酸甲硫氨酸。在不同组织中，确定另一种的剪接模式在成熟组织中，使用反转录(RT)-PCR评估SALL4的mRNA表达模式。从BDBiosciencesClontech购得一组(panel)八个标准化的源自不同成熟组织的第一链cDNA制品。在50卞1含有5pl的cDNA、10mMTrisHC1(pH8.3)、50mMKC1、2mMMgCl2、0.2mMdNTPs和1.25U的TaqDNA聚合酶(PerkinElmerLifeSciences,Boston,MA)的反应体积中，实施PCR扩增。在94。C下最初变性10分钟后，在下面的条件下实施30个循环的扩增94'C下变性30秒、55。C下退火30秒、72'C下延伸30秒。循环后，在72'C下进行最后的7分钟延伸。使用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA的扩增控制模板加载浓度。下面是对SALL4同种型特异性选择的引物对1)SALL4A引物(有义引物5'-ATTGGCACCGGCAGTTACCACC(SEQIDNO:9);反义引物5'陽AGTACTCGTGGGCATATTGTC-3'(SEQIDNO:IO))和2)SALL4B引物(有义弓l物5'-ATGTCGAGGCGCAAGCAGGCGAAAC-3'(SEQIDNO:11);反义弓l物5'-丁TAGCTGACCGCAATCTTGTTTTCT-3'(SEQIDNO:12))。在1%琼脂糖凝胶上，通过电泳分离PCR产物。也使用DNA测序来确认扩增产物。抗体产生根据其潜在抗原性(氨基酸1-13)，选择人SALL4的肽MSRRKQAKPQHIN(SEQIDNO:13)，并且使用其制备抗肽抗体。该区域也与小鼠SALL4的区域相同，所以可以期望产生的抗体与小鼠SALL4交叉反应。与LampireBiologicalLaboratoriesInc.(Pipersville,PA)合作，在兔中产生SALL4抗肽抗体。凝胶电泳和蛋白质印迹分析根据Laemmli,在SDS10%w/v的聚丙基酰胺平板凝胶中，实行十二垸基硫酸钠-聚丙基酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后将蛋白转移到硝化纤维素膜上。如制造商(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)描述的，用电化学发光检测系统，实施具有SALL4抗肽抗体(1:100)的兔免疫血清的免疫印迹。白血病和正常组织在核准的InstitutionalReviewBoard协议下，从UniversityofTexas和2004年之间的存档(file)中，收集在石蜡块或冻存在二甲基亚砜(DMSO)中的白血病和正常样品。所有肿瘤的诊断基于根据FABClassificationforHematopoieticNeoplasms(造血瘤的FBA分类)的形态和免疫表型标准。从Cambrex购买CD34+新鲜细胞。实时定量RT-PCR在这些研究中，使用TaqMan5'核酸酶分析(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。使用RNeasy微型试剂盒(MiniKit)分离并用DNaseI(Qiagen)消化，源自正常骨髓和外周血、15个AML样品和三个白血病细胞系的纯化CD34+HSCs/HPCs的总RNA。使用SuperscriptII反转录酶和聚(dT)12-18引物(Irwitrogen)，在20中反转录RNA(lpg)。在加入80水并混合后，使用5屮L等份式样(aliquots)进行每一TaqMan反应。使用引物表达软件(PrimerExpresssoftware".5版本(AppliedBiosystems)设计TaqMan弓1物和探针。使用TaqManPCR核心试剂盒(corereagentkit)(AppliedBiosystems)和ABIPrism7700序列检测系统(SequenceDetectionSystem)(PEAppliedBiosystems)，实施SALL4和GAPDH的实时PCR。在1xTaqManPCR缓冲液中，PCR反应混合物含有3.5mMMgCl2;0.2mM脱氧三磷酸腺苷(dATP)、脱氧三磷酸胞苷(dCTP)和脱氧三磷酸鸟苷(dGTP)的每一种；0.4mM脱氧三磷酸尿苷(dUTP);0.5^M正向引物；0.5pM反向引物；0.1TaqMan探针；0.25U尿嘧啶DNA转葡萄基酶；和0.625UAmpliTaqGold聚合酶。将cDNA(5pL)加入到PCR混合物中，并且PCR反应物的最终体积为25pL。所有的样品运行两次。使用GAPDH作为内源性对照。热循环仪条件是5CTC进行2min、95。C进行10min，并且对95。C进行0.30min和60。C进行1min作45个循环。使用序列检测系统软件(SequenceDetectionSystemsoftware)1.6.3版(AppliedBiosystems)分析数据。获得结果作为循环阈值(Ct)的值。该软件确定在基线荧光信号基础上的阈值线，并且给出达到阈值的点作为Ct值。该Ct值与模板拷贝的起始数量呈反比。所有的测量实施两次。TaqMan序列包括下列GAPDH正向引物(5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(SEQIDNO:14))和反向引物(5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(SEQIDNO:15))，TaqMan探针(5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC陽3'(SEQIDNO:16))禾卩SALL4正向引物(5'-CCTCCTAATGAGAGTATCTGGGTGAT-3'(SEQIDNO:17))和反向引物(5'-TTAAAACATACAGCGCATGATTGG-3'(SEQIDNO:18》。组织阵列(TissueArray)设计和构建包括来自白血病样品的三个肿瘤核心的组织阵列被切片(5pm厚)。使用手动组织阵列仪(BeecherInstruments,SilverSpring,MD)构建该组织阵列。免疫组织化学根据标准技术实施免疫组织化学染色。简单地说，将甲醛固定的、石蜡嵌入的4-nm-厚的组织切片脱蜡(deparafinized)并水合。用Tris缓冲液(pH9.9;DakoCorp.,Carpinteria,CA)和快速微波组织处理器(rapidmicrowavehistoprocessor)回收热诱导的表位。在IOO'C下，培育10min后，在流动的自来水中洗涤载玻片5min，然后用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS;pH7.2)洗涤5min。然后在增湿的室中，在室温下将组织切片与抗SALL4抗体(1:200)—起温育5小时。在用PBS洗涤三次后，在室温下将组织切片与抗小鼠免疫球蛋白G和过氧化物酶一起温育30min。在用PBS洗涤三次后，将组织切片与3，3'-二氨基联苯/H202(Dako)一起温育进行显色；使用苏木精对该切片复染。当瘤细胞(赘生细胞)表现确定的核染色时，认为其对于SALL4阳性。转基因小鼠的产生SALL4BcDNA——相应于整个编码区域，被亚克隆入pCEP4载体(IntroGene;现在Crucell，Leiden,TheNetherlands)以产生用于转基因试验的CMV/SALL4B构建物。随后用Sail消化——这不会在SALL4BcDNA内切割，释放仅含有CMV启动子、SALL4cDNA编码区、SV40内含子和多腺苷酸化信号的线性片段，而没有额外的载体序列。通过在耶鲁大学(YaleUniversity)的转基因小鼠实验室实施前核注射(pronuclearinjection)产生转基因小鼠。SALL4B建立者(founder)小鼠识别和转基因的传递通过PCR分析确定。用于基因分型的PCR引物跨越(span)5'SALL4BcDNA与CMV启动子的结合区(有义引物5'誦CAGAGATGCTGAAGAACTCCGCAC-3'(SEQIDNO:19);反义引物5'-AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3'(SEQIDNO:20》。血液分析使用MascotHemavet细胞计数器(CDCTechnologies,Oxford,CT)确定自动差分全血细胞计数。对于祖细胞分析，将1.5xI04的骨髓细胞铺于2份1.25-ml甲基纤维素培养物中，该培养物中补充有重组小鼠白介素-3(IL-3)(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、干细胞因子(SCF)(50ng/ml)和促红细胞生成素(3U/ml)(M3434,StemCellTechnologies,Vancouver,BritishColumbia,Canada)。在第7天到第14天之间记录集落(CFU-G、CFU-GM、CFU-M、CFU-GEMM和BFU-E)。用赖-吉染色(Wright-Giemsastain)将得自聚集的CFU细胞的外周血、骨髓涂片和细胞离心涂片(cistospin)染色。流式细胞术分析用与Gr-l、Mac-1,B220、Terl19、c-kit、CD34、CD45、CD41、CD19、CD5、CD3、CD4、CD8、碘化丙锭(PI)或膜钙蛋白V(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA)直接结合的抗体对细胞染色。在FACScan上获得一万散射门控(scatter-gated)红细胞，并且用CellQuest软件(BDBiosciencesClontech)进行分析。统计分析对于所有的统计分析，使用学生的t-试验(student，st-Test),呈现正常的双尾分布和不等的变量。细胞培养物HEK-293细胞(得自人胎儿肾脏)和细胞系KG.1、Kasumi-1和THP-1购自AmericanTypeCultureCollection(Manassas,VA)。在37°C下，具有5%二氧化碳和10%胎血清的增湿环境下，保持细胞。转染在转染24小时后，用100^荧光素酶细胞培养物裂解剂(PromegaCorp.,MadisonWi)提取细胞。用10pi的细胞提取物实施的P-半乳糖苷酶分析使用p-半乳糖苷酶酶分析系统(EnzymeAssaySystem)(Promega)和制造商提供的标准分析方案(除了lMTris基代替碳酸钠被用作停止缓冲液)。对于荧光素酶分析(Promega)，根据制造商的用法说明使用5pl的提取物。在减去背景后，对于每一样品，将荧光素酶活性(任意单位)标准化为卩-半乳糖苷酶活性(任意单位)。启动子报告基因分析—般来说，用在HEK-293或COS-7细胞中表达SALL家族蛋白或OCT4蛋白的0.1吗至0.12吗之间的海肾质粒禾n/或各种量(0-L0吗)的质粒，转染含有OCT4启动子(SEQIDNO:26)的OCT4-Luc构建物(PMOct4)或含有SALL家族蛋白(艮卩SALL1、SALL3、SALL4A或SALL4B)启动子(即分别为SEQIDNO:27、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29，其中SALL4A和SALL4B共有相同的启动子)的SALL-Luc构建物。一般地，pcDNA3载体被用作对照。然后，在转染后24小时，监控转染的细胞的荧光素酶活性。结果人SALL4的两种可选剪接同种型的分子克隆通过5'和3'RACE-PCR(5'和3'cDNA端-聚合酶链式反应的快速扩增)，使用人胎儿肾Marathon-ReadycDNAs(BDBiosciencesClontech)作为模板，分离SALL4的两个全长转录物。分离的较大cDNA片段的序列分析显示单一、大的开放阅读框架命名为SALL4A，其从强共有起始序歹U(strongconsensusinitiationsequence)开始，并且预期编码1,053个氨基酸。SALL4另一个剪接变异体被命名为SALL4B，其缺乏相应于全长SALL4A的氨基酸385-820的区域(图la)。假定被SALL4BcDNA编码的蛋白预期由617个氨基酸组成。为了排除这两个明显的剪接变异体可能是人造产生的可能性，比对这两种变异体的mRNA序列和相应的人基因组序列。SALL4A含有所有的外显子(l-4)(图la)，而SALL4B缺乏外显子2的3'大的部分。外显子-内含子的剪接位点满足G-T-A-G规则。这两种剪切变异体具有相同的翻译阅读框，但是SALL4BmRNA编码具有内缺失的蛋白质。SALL4A含有8个锌指结构域，而SALL4B具有3个锌指结构域。在人的组织中，SALL4同种型的表达模式通过在各种人组织中反转录(RT)-PCR，描述SALL4可选的剪接模式。扩增普遍存在的GAPDH基因cDNA的片段作为对照(图lb)。315-bp片段代表更长的剪接变异体——SALL4A，被在一些组织中扩增，达到各种表达水平。SALL4B变异体以不同的表达水平存在于每一组织中。对于造血组织中SALL4表达的详细研究在下面的结果中描述。SALL4抗体的产生和SALL4蛋白质产物的识别为了识别SALL4基因产物并证实存在SALL4变异体，发展了对SALL4的合成肽(氨基酸l-13)的多克隆抗体。选择该区域，是因为其是两种SALL4变异体共有的。亲和纯化的SALL4肽抗体特异性识别人肾总溶胞产物内的2种内源性蛋白质。这两种蛋白大约为165kDa和95kDa，其分别与在Cos-7细胞中过表达的SALL4A和SALL4B的分子量相同(图lc)。用该抗体的蛋白质印迹证实SALL4同种型具有不同的组织分布，这与在mRNA水平观察到的分布相似(图lb-B)。在人初级AML和髓细胞性白血病细胞系中，SALL4没有停止产生因为染色体部位20ql3——SALL4位于这里——经常涉及肿瘤，所以检査AML中SALL4mRNA表达。通过在源自AML样品(N-15)的骨髓细胞、髓细胞性白血病细胞系(N二3)中实时RT-PCR，定量研究SALL4表达，并且将其与得自纯化的CD34+干/祖先聚集(HSCs/HPCs，购自Cambrex)、正常骨髓(N-3)和正常外周血(N-3)的非瘤造血细胞的SALL4表达进行比较。随着使用同种型特异性引物(参见图2a),SALL4B禾Q/或SALL4A的一个或两个在AML样品和髓细胞性白血病细胞系中，没有停止产生(SALL4B)或下调(SALL4A)。将数据标准化为GAPDH的内源性表达，并且针对在纯化的CD34+细胞中的SALL4A或SALL4B的表达水平进行校准。与在正常骨髓中完全缺乏SALL4B相反，在全部15个AML样品中的13个和全部所有的三个髓细胞性白血病细胞系中，在初级AML中的表达没有停止。在AML样品中SALL4A的平均标准化水平比在正常骨髓中的SALL4A的平均标准化水平高40倍。在髓细胞性白血病细胞系KG.1、Kasumi-l和THP-1中，SALL4A表达水平分别比在正常骨髓中SALL4A表达水平高8-、25-和240-倍。有趣地是，与在正常骨髓中相比，在60。/。的AML样品和所有的3个细胞系中，SALL4A和SALL4B表达水平增加。在剩下的40%的AML样品中，SALL4A或SALL4B没有被下调。在人初级AML中，SALL4蛋白的组成型表达为了研究观察到的异常SALL4表达是否也在蛋白质水平存在，检査81个AML样品，其范围为AML类型Ml到M5(FAB分类):M1(N=20)、M2(N=27)、M3(N=8)、M4(N=16)、M5(N二3)和AML非特异性的(N-7);正常骨髓、胸腺和脾以及正常CD34+HSCs/HPCs的数个样品。正常骨髓、脾脏和胸腺表示没有可检测到的SALL4蛋白表达，正常CD34+HSCs/HPCs表示阳性但是更弱的SALL4蛋白染色；然而，在白血病细胞的细胞核内检测到强的多的SALL4表达(图2b-F)。所有81个AML样品表现异常的SALL4表达，并且最强的染色见于AML-M1和-M2。这些发现与通过实时RT-PCR标明的SALL4mRNA表达水平相一致(图2a)。数据表明SALL4存在于CD34+HSCs/HPCs中，并且在成熟粒细胞和淋巴细胞中被下调。结果，在白血病中SALL4的组成型表达防止了白血病胚细胞免于分化和/或获得通常在HSC中所见的特性。组成型表达全长人SALL4B的转基因小鼠的产生为了直接检测SALL4的组成型表达是否足够诱导AML，产生SALL4转基因小鼠模型。将CMV启动子融合入编码617个氨基酸的人SALL4B的cDNA(图3a-A)，选择SALL4B是因为在先前检査的每一组织中，其被表达(图lb-B)。CMV启动子先前被用于在大多数小鼠器官中异位表达人基因。实施RT-PCR扩增以检测野生型(WT)、全长SALL4B在转基因小鼠中的过表达。在转基因小鼠的多种组织中，检测SALL4B转录物，所述组织包括脑、肾、肝、脾、外周血、淋巴结和骨髓(图3a-B)。出生三周后，在多个系的20%的转基因小鼠中观察到异常歩态(abnormalgaits)和相关的脑积水；60%具有多囊肾。这些发现表明SALL4B在神经和肾脏发育中起重要作用。在转基因小鼠中的MDS样症状和AML在所有来自6系的14只转基因小鼠组中的血液异常的监控表明所有小鼠在6-8个月大时具有明显的MDS挂特征。在外周血涂片上，可见幼稚胚细胞和非典型以及发育异常的白细胞一一包括多叶核嗜中性粒细胞和拟-Pelger-Huet-样——数量的增加(图3b)。核红细胞和巨血小板也存在，以及红细胞和巨核细胞发育异常的特征，例如双核红细胞前体和小叶过少的巨核细胞。这些14只小鼠的6只(43%)最终进展成为急性白血病(表1)。表1在SALL4B转基因小鼠中，类MDS/AML的综述。小鼠ID性别建立者大小表型AML涉及的结果和器官<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>许多器官——包括肺、肾、肝、脾和、淋巴结一一的白血病浸润，增强疾病的攻击(图3c)。考虑白血病胚细胞起源于骨髓，因为其对CD34、c-kit、Gr-l、Mac-l、MPO和非特异性酯酶是阳性的；它们对B细胞(B220和CD19)、T细胞(CD4、CD8、CD3禾nCD5)、巨核细胞(CD41)和红细胞(Terll9)标记是阴性的(图3d)。SALL4B-诱导的AML是可植入的在免疫缺陷NOD/SCID小鼠中，通过皮下注射连续植入SALL4B-诱导的AML，形成在大约6周开始的攻击性的致死AML。植入疾病的特征为散布到多器官，并且就具有标记性的脾肿大和肝肿大(图3e)。在SALL4B转基因小鼠中，无效血细胞生成和过度凋亡对幼小的SALL4B转基因小鼠(2-6个月大)的血液异常的研究显示其外周血表现最小的脊髓发育不良的特征，而该特征是统计学显著的白血病和嗜中性粒细胞减少以及中度贫血(表2)。表2.SALL4B转基因小鼠和野生型对照的CBC<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>为了确定这些转基因小鼠中血细胞减少症的原因是否与生产问题相关，研究了它们的骨髓。与野生型对照相比，骨髓样品显示出增加的细胞构成和增加的脊髓种群(图3f)(在SALL4B转基因小鼠中，Gr-1/Mac-1双阳性种群67±16%，N=10对WT:55.3±4%，N=ll;P=0.048)。因为过量的凋亡在人MDS无效血细胞生成中起到重要作用，所以接下来在体内和体外检测SALL4转基因小鼠的凋亡。在SALL4B转基因小鼠中，观察到增加的凋亡，对于初级骨髓(在转基因小鼠的膜钙蛋白V-阳性，PI-阴性种群中4.4±2.4%，N40对比WT:1.86±1.55%，N=7;P^.03)和7天CFUs(在转基因小鼠的膜钙蛋白V-阳性，PI-阴性种群中20.1士6。/。,N^0对比WT:10.9±4%,N=7;Pi.002)(图3f和g)。这些发现可解释以下事实尽管在骨髓中增加脊髓种群，这些转基因小鼠在外周血具有统计上显著低的嗜中性粒细胞计数，这相比于它们骨髓中的正在发生的无效髓细胞生成是次要的。在SALL4B转基因小鼠中，也注意到幼稚细胞种群增加，对于初级骨髓(SALL4B转基因小鼠中c-kit-阳性种群10.2±1.3%,N=14对比WT:6.5±2.5%,N=10;P:O細)(图3f)禾口7天CFUs(SALL4B转基因小鼠中CD34-阳性种群11±2.2%,N=8对比WT:6.3±2.4%,N=7;PK).002)(图3g)。相似的总集落在SALL4B转基因小鼠(平均=51,N40)和WT对照(平均=40^=6)中被观察到。然而，与WT对照相比，在SALL4B转基因小鼠CFU中，发现增加的脊髓和减少的红细胞集落种群(图3h),如已在人MDS患者和其它MDS小鼠模型中报道的。这些观察表明，SALL4B转基因小鼠的缺陷在于影响造血分化(hematopoieticdifferentiation)的干细胞/祖细胞水平。在体外SALL4A和SALL4B与(3-联蛋白的结合接下来，研究在白血病发生中SALL4可能影响的潜在信号通路。在果蝇中，印W(sal)是Wnt信号的下游靶。ALU——另一种SALL基因家族成员，可与P-联蛋白相互作用。对于这种相互作用的高亲和位点位于C末端双锌指结构域。发现SALL1的该区域几乎与SALL4的该区域完全相同。该发现促进了调查SALL4是否也能与)3-12联蛋白结合。血细胞凝集素(HA)靶向的SALL4A和SALL4B的表达构建物被产生。如在图4a中所示的，HA-SALL4A和HA-SALL4B降低内源性(3-联蛋白，但是仅仅HA没有这种影响。SALL4A和SALL4B活化Wnt/13-联蛋白信号通路为了研究SALL4同种型和P-联蛋白相互作用的功能性影响，使用含有多拷贝Wnt反应元件(Wnt-responsiveelements)的荧光素酶报告基因(TOPflash;UpstateUSA)以确定SALL4A和SALL4B活化规范(canonical)Wnt信号通路的能力。Wntl在多种细胞系中表明有效激活该报告构建物。在HEL-293细胞系中，瞬时转染TOPflash报告质粒，其中Wnt和其Wnt/p-联蛋白信号通路存在。也用SALL4A或SALL4B共转染TOPflash报告质粒。通过增加的荧光素酶活性，表明SALL4A和SALL4B明显活化Wnt/p-联蛋白信号通路(图4b)。在CML的不同期，B-联蛋白和SALL4的相似表达模式已知失调Wnt/(3-联蛋白信号涉及LSCs的形成。卩-联蛋白涉及LSC自我更新的最好证明来自CML胚细胞转化研究。已阐明Wnt信号在CML胚细胞期被活化，但是不在慢性期被活化，其中包括失调的Wnt信号如P-联蛋白活化，可对CML的GMP赋予自我更新的能力，并导致它们的胚细胞转化。在果蝇属中，考虑在SALL4和(3-联蛋白与spalt位置之间的潜在相互作用为Wnt信号的下游靶，检测不同期的CML中的SALL4蛋白表达。SALL4表达存在于胚细胞-期CML(N42,75。/。)，但是不存在于慢性期(N41，100%)(图4c)。在加速期(N-6，10%)——在该时期胚细胞数量增加，在未染色成熟脊髓细胞例如嗜中性粒细胞的背景上，观察到表达SALL4的幼稚胚细胞。SALL4对0CT4启动子的影响为了鉴别SALL4对OCT4启动子的影响，用海肾质粒和增加浓度的SALL4B共转染OCT4-Luc构建物(图5)。如图所示，增加SALL4B增加超过8倍的OCT4启动子活性。为了确定OCT4是否刺激SALL基因成员启动子的活性，在HEK-293细胞中，启动子构建物(pSALLl、pSALL3和pSALL4)和OCT4—起共转染。如可从数据(图6)所见的，在转染后24小时后，当与pcDNA3载体对照相比时，OCT4过表达显著刺激SALL基因成员SALL1、SALL3和SALL4的启动子活性。同样，存在少量过度的SALL4完全阻止了这种活化(图10)。为了确定是否具有SALL家族成员蛋白对SALL启动子的任何自调控，用SALL4-Luc和海肾报告基因一起共转染，SALL4A或SALL4B表达质粒是HEK-293和COS-7细胞(图7)。如在该图中所示，SALL4(A和B同种型)在不同的细胞系中抑制其自己的启动子活性。进一步，该自抑制是计量依赖性的(参见图8)。当SALL4A与SALL4启动子比例达到6:1时，相对于基础水平，启动子活性降低大约3.5倍。该数据表明SALL4具有自抑制功能。这不是对于所有SALL成员都是事实，例如，SALL1没有表明其启动子的自抑制(图12)。数据也表明外源性加入SALL4强烈活化SALL1和SALL3启动子(参见，图9)，这表明SALL4能调节涉及胚胎干细胞功能的SALL基因家族的其它成员。因为OCT4对SALL4启动子的刺激可被SALL4完全抑制(图10)，检查SALL4以确定它是否抑制了OCT4对其它SALL成员启动子的活化。如可在图11中所见的，SALL4也抑制OCT4对其它SALL成员启动子的活化。成体干细胞和胚胎瘤(embrvoniccarcinoma)中的SALL4组织干细胞集落的特性仍然难以弄清楚，因为没有区分干细胞和分化后代的标记。对于许多组织，已经开发出一组分子标记来限定干细胞细胞间隔。本数据表明在多潜能性和自我更新方面，SALL4是胚胎干细胞的主要调节剂。例如，胚胎瘤展示早期胚胎干细胞的表型，并且胚胎瘤具有多潜能性潜力。因此，通过免疫组织化学检测该类型的肿瘤中SALL4蛋白的表达。免疫组织化学数据确定地表明胚胎瘤的所有肿瘤细胞示出核染色，而所有非肿瘤细胞是隐性的。这些观察表明SALL4可被用作正常和恶性胚胎生殖细胞和胚胎干细胞的特异性标记。假定SALL4在非常早期胚胎干细胞中表达，并且胚胎瘤被报告产生自这些细胞的转化，免疫组织化学也表明a)正常乳房小叶中的SALL4阳性细胞，占上皮细胞的2%以下，和b)乳腺癌样品中，观察到在细胞簇或分散的细胞中观察到SALL4蛋白表达。此外，SALL4蛋白在正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞的细胞核中表达。而且，用SALL4抗体，在其它正常成熟组织例如前列腺和肺中、产生自这些组织的瘤中观察到该多能性基因表达。观察到在支气管上皮细胞和前列腺腺泡中存在少量表达SALL4的细胞和它们的基质细胞，以及发现SALL4在正常前列腺和肺以与在乳腺小叶上皮细胞内表达相似的频率进行表达。另外，通过用SALL4抗体的免疫组织化学研究，前列腺癌中分散的肿瘤细胞表达SALL4蛋白。总之，本样品表明(l诉抗-SALL4抗体免疫染色是鉴别胚胎瘤的有用诊断工具，(2)在数种人干细胞和癌细胞中发现SALL4的表达；(3)在人组织中识别表达SALL4的细胞可被用来识别干细胞、它们的恶化前细胞和恶性细胞,和(4)SALL4代表胚胎干细胞、成体干细胞和肿瘤干细胞的理想标记。参考文献1,Mu伤，G,，Ijst>A.F"Gore,S.D,&Ho，A,Y'Mydodysplasticsyiutcome.ilen说totogy(AmSocHcmatolEducProgram),176-99(2003).2.Giliiland，D*G"Jordan,C,T,&Felix,C.A,Themolecularbasisof〗ciikemia<Tfeomtoogy(八mSocHt'i加tolEducProgram),80-97(2004).3.Tenen，D*G,Disruptionofcliffereutiationinhumancancer:AMLshowstheway.Na￡HevCancer3,89-101(2003〕，4,Rosi"arin，入G"Yang*Z'&Resendes，K,KTnmscriptbna〗rcguktioninmydopoiesis:ilematopoitsticfktedioice，myeloiddiffeientiatkm，andlcukcmoge加sis.ExpHematol33，13143(2005),5,Friednian，A-D/TranscdptioHa!regtilalioiiofmyelopoicsis.IntJHem迈to]75,466-72(2002).6,Oill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