专利名称：：利用多基因重组表达多蛋白复合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及编码至少两个各编码至少三种生物活性多肽的多基因的重组多核苷酸，所述每个多基因都处于单个开放阅读框(ORF)中，其中构成多基因的基因所编码的至少两种多肽为非病毒来源，构成多基因的基因所编码的至少两种多肽每一种均至少能够瞬时与由所述多基因的基因所编码的至少另一种多肽进行相互作用，并且构成每个多基因的基因彼此之间通过编码至少一种蛋白酶裂解位点的序列和/或通过编码至少一种自我裂解肽的序列来连接。本发明的其它实施方案为含有重组多核苷酸的载体，含重组多核苷酸和/或载体的宿主细胞以及用该重组多核苷酸和/或载体转化的除人外的转基因动物。本发明也涉及多核苷酸的制备方法和多蛋白复合物的生产方法。本发明的实施方案尤其可用于基因治疗、候选药物的筛选、疫苗制备以及为结构解析所进行的多蛋白复合物结晶。
背景技术：
：后基因组时代的生物研究努力的焦点集中于阐明蛋白质相互作用的网络(相互作用组(interactome))。由于鉴定得到的多蛋白复合物其存在于天然细胞中的量并不足以进行具体的分子生物学分析，因此他们的研究就依赖于用来大规模制备异源蛋白质的重组技术。在多蛋白表达之前，重组表达方法要求投入不相称的劳动和物质投入，而在表达之后则无法为作出改进的表达研究提供快速改变多蛋白组分的灵活性。有几种重组技术目前被用于获得多亚基复合物。蛋白质能够例如以可溶形式或以包涵体形式在大肠杆菌(Eco/O的分离物中进行表达，纯化，随后与以相似方式制备得到的蛋白质在体外重构成为多蛋白复合物。真核细胞(例如哺乳动物细胞或酵母细胞)也能够用作瞬时表达试验的宿主。该方法完全有赖于存在有效的体外重构法。对于具有小亚基大小的较为简单的系统而言，该方法可以产生可接受的结果，但是总的说来它无法应用于含多个且也较大的亚基的更为复杂的多蛋白复合物(例如接近于完全高等真核状态的-尤其是人类的-调节复合物)。共表达已经被认为是上述体外重构策略的较好替代策略。过去已经开发了几种用于原核表达和真核表达的共表达系统。在原核系统中，共个或两个基因和不同抗性标记及复制子的质粒来实现。真核细胞的共表达已经通过使用杆状病毒系统而实现，开始时通过几种病毒的共感染并不太成功，后来通过单个病毒表达出所有蛋白从而获得更大的成功，这提供了许多有利条件并排除了几种原核系统中所存在的缺陷(例如比较小的亚基尺寸、可靠进程的缺乏、真核(尤其是人)蛋白表达的困难等等)。对于杆状病毒系统而言，已经表明由单个病毒进行表达可显著提供产率(Bergeretal.(2004)M^wre说Wec/z.22,1583-1587;同样参见Comment(2004)，AtoweS/o^c/z.22,vii,New&Views(2004),A^/we5,'o^c/2.22,152,ResearchHighlights,淑騰她/ZzoA2,7(2005);Bertolotti-Ciarleteta1.(2003)K"cc/"e21,3885-3900),同时决定性地减少后勤需求，对于大规才莫制备而言尤其是这样。多蛋白表达的主要改进在于为制备多基因表达盒提供了模式系统，该多基因表达盒由本发明人提供，描述于WO2005/085456Al(PCT/EP2004/013381;同样参见Bergereta1.(2004)z&力中。WO2005/085456Al(PCT/EP2004/013381)中所描述的MultiBac技术使简单地制备多基因表达盒和简单地变更或修改表达试验成为可能(Bergeretal.(2004)麵)。然而，成功表达并在体内组装多亚基复合物，尤其是具有多个(6、7、8或更多个)亚基(它们构成真核的，例如人，基因调节复合物的主要部分)的多亚基复合物的一个障碍基于这么一个事实在许多情况下这些亚基的相对表达水平一般都有显著差异，其机制(例如转录和翻译效率、蛋白质稳定性、mRNA稳定性以及二级结构等等)尚未得到充分理解。结果，在固有的不平衡系统中以最少的量表达的亚基表明通过限制总复合物的产量的多亚基复合物制备试验的完全成功。因此，转录/翻译系统将产生无法结合到该过程中的过量的其它组分，由此"浪费"了细胞转录/翻译的资源。个体表达水平彼此之间一般相差几倍(例如最高达10倍或更多)，从而蒙受对成功制备期望多亚基复合物尤其是对于具有超过4个，例如5、6、8、IO或更多个亚基的复合物(例如在多个真核基因调节复合物的情况下)来说是难以控制的损失。小核糖核酸病毒超群(super-group)的病毒具有由单链RNA分子所组成的基因组，所述单链RNA分子在正义方向上含有一个或两个编码包括病毒蛋白在内的多蛋白的ORF,所述病毒蛋白通过病毒蛋白酶裂解位点或通过自我裂解肽而相互连接(参见，例如，Ryanetal.(1997)丄Gener.Virol.78,699-723)。通过重组病毒表达多蛋白以制备蛋白复合物的基本概念已经在TCR(T细胞受体)CD3复合物(Szymczaketal.(2004)NatureBiotech.5,589-594)的重构中得到了应用。该作者利用了两种重组逆转录病毒载体，其中一种载体包括编码两个TCR亚基的序列，而另一载体则编码包括4个CD3亚基的多蛋白。这些亚基通过源自口蹄疫病毒(，/zf/zowy附)的自我裂解的2A肽序列进行连接。该方法的一个缺点在于，为了重构完整的复合物必须制备两个单独的载体且须进行两次转染。该病毒多蛋白方法已被用于杆状病毒表达系统来制备小构建体，例如异二聚的IL画12(Kokuhoetal.(1999)Vet.Immunol.Immunopathol.72,289-302)和包括源自杆状病毒多角体蛋白的核目标信号和所研究蛋白在内的融合蛋白(US5179007)。因此，本发明所要解决的技术问题是提供用于改进多蛋白表达的新系统。
发明内容上述技术问题的解决方法由权利要求所限定的实施方案来提供。特别地，本发明提供编码至少两个各编码至少三种生物活性多肽的多基因的重组多核苷酸，所述每个多基因都处于单个开放阅读框(ORF)中，其中构成多基因的基因所编码的至少两种多肽为非病毒来源，构成多基因的基因所编码的至少两种多肽每一种均至少能够瞬时与由所述多基因的基因所编码的至少另一种多肽进行相互作用，并且构成每个多基因的基因彼此之间通过编码至少一种蛋白酶裂解位点的序列和/或通过编码至少一种自我裂解肽的序列来连接。根据本发明的多核苷酸可以是DNA、RNA或包括一个或多个合成核苷酸类似物的多核苷酸。该多核苷酸可以单链或双链的形式存在。DNA尤其是双链DNA形式是优选的。本发明的多核苷酸可以通过化学合成来制备。本发明优选的多核苷酸构建体通过重组基因技术来制得(参见,例如，Sambrooketal."MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989)。本文所采用的"多基因"是在单个ORF中编码至少3种生物活性多肽的核酸序列。这样，构成多基因的每个"基因，，都是编码具有特定功能，尤其是结构功能、调节功能或酶学功能的多肽，尤其是编码蛋白质或其片段、变体、突变体或类似物的核酸序列。优选地编码多肽的"基因"包括编码结构蛋白、调节蛋白或酶蛋白或其片段、变体、突变体或类似物的cDNA编码区。由多基因中包含的基因所编码的多肽"片段"意指原始多肽的一部分或一个区域，优选至少保留完整蛋白的一种功能的片段。由多基因中包含的基因所编码的多肽"变体"意指源自另一个种的原始多肽的功能性或非功能性等价物或者是选择性剪接或翻译后处理中所得到的原始多肽的功能性或非功能性衍生物。由多基因中包含的基因所编码的多肽"突变体"意指天然存在的蛋白通过插入、置换、添加和/或缺失一个或多个氨基酸残基而得到的多肽。由多基因中包含的基因所编码的多肽"类似物，，意指原始多肽的功能性等价物，它甚至可以具有不相关的氨基酸序列却可以实现与其相类似的多肽的同样功能。相应地，在核酸水平上，基因"片段"是该"片段"来源的原始基因的一部分或一个区域。基因"变体"与原始基因相比它具有在不同种中所发现的序列，或者它可以编码剪接变体或翻译后处理形式的目的多肽。"突变体"则通过插入、置换、添加和/或缺失一个或更多个核普酸而从亲代基因中获得。基因"类似物，，编码亲代基因所编码多肽的功能性等价物。根据本发明的多基因中的至少两个基因是非病毒来源的。"非病毒"意指编码多肽(代表功能性蛋白或其片段、变体、类似物或突变体)的核酸序列最初不是发现于或不是来源于病毒基因组的。特别地，根据本发明的多核苷酸的多基因中所包括的核苷酸序列源于真核细胞和/或原核细月包。由此，根据本发明，编码多亚基集合体的亚基(例如多蛋白复合物或代谢途径成员或至少可潜在地与另一者进行至少是瞬时相互作用的任何其它蛋白)的基因至少出现在两个开放阅读框(ORF)中。编码集合体的亚基(多肽)的序列至少出现在两个多基因中，其中构成每个多基因的基因相互之间通过编码蛋白酶裂解位点的序列(可能不止一个)或至少一个自我裂解肽的序列(即包括蛋白酶识别位点的序列)而连接。根据本发明的优选实施方案，能够对连接构成多基因的基因的序列所编码的裂解位点进行裂解的一种或多种蛋白酶由本发明的多核苷酸编码。更优选地，编码一种或多种蛋白酶的基因是至少一个多基因的一部分。合适的蛋白酶裂解位点和自我裂解肽对本领域技术人员而言是已知的(参见，例如，inRyanetal.(1997)J.Gener.Virol.78,699-722;Scymczaketal.(2004)NatureBiotech.5,589-594)。蛋白酶裂解位点的优选实例是以下蛋白酶的裂解位点马铃薯Y病毒(potyvirus)NIa蛋白酶(例如烟草蚀紋病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒Pl(P35)蛋白酶、byovimsNIa蛋白酶、byovirusRNA-2编码的蛋白酶、口痴病毒(aphthovims)L蛋白酶、肠道病毒(enterovirus)2A蛋白酶、鼻病毒(rhinovirus)2A蛋白酶、微小核糖核酸病毒(picorna)3C蛋白酶、豇豆花叶病毒组(comovirus)24K蛋白酶、香蕉苞片花叶病毒(nepovims)24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C样蛋白酶、凝血酶、因子Xa和肠激酶。由于TEV(烟草蚀紋病毒)蛋白酶高度的裂解严谨度，该蛋白酶裂解位点是特别优选地。这样，根据本发明的多基因的基因优选由一段核苦酸连接，所述核苷酸包含编码通式为EXXYXQ(G/S)的氨基酸序列的核苷酸序列，其中X代表任何氨基酸(TEV裂解发生在Q和G或者Q和S之间)。最优选的分别是编码ENLYFQG和ENLYFQS的接头核苷酸序列。优选的自我裂解肽(也叫"顺式水解作用元件"，CHYSEL;参见deFelipe(2002)Curr.GeneTher.2,355-378)源自马铃薯Y病毒和心病毒(cardiovims)2A肽。尤其优选的自我裂解肽选自源于FMDV(口蹄疫病毒)、马鼻病毒(equinerhinitis)A病毒、Thoseaasigna病毒和猪捷中病毒(porcineteschovims)的肽。本发明多基因编码的至少两种多肽至少能够与由该多基因所编码的另一种多肽进行瞬时相互作用，或者它们至少被怀疑至少能够与所述多基因所包含的基因所编码的另一种多肽进行瞬时相互作用。形成于多肽之间典型的"相互作用"包括共价键和、氢键、静电作用以及范德华力。"瞬时"相互作用在生物分子尤其是在蛋白中是普遍的，并且一般以酶及其底物的相互作用、受体及其(激动剂或拮抗剂)配体的相互作用、代谢途径成员之间的相互作用以及调节(例如基因调节)复合物之间的相互作用为代表。构成本发明多基因的核苷酸序列所编码的多肽可以是相同或不相同的。由此，本发明构建体中出现的各个多基因可包含编码兴趣蛋白的各个核苷酸序列的一个或多个拷贝。通过这种方式，例如，可能提供用于优化表达期望蛋白的构建体，特别是在蛋白正常地以不同水平进行表达和/或出现在不同化学计算法的大分子集合中的情况下更是如此。因此，在多肽于普通所用系统中表达较少的情况下，可以把两个或多个拷贝的相应编码序列整合至本发明构建体的一个或多个多基因中。在多肽在期望的复合物中以二聚体、三聚体或多聚体出现时，可以采用同样的方法。按照这种方式，本发明的构建体可以根据本领域技术人员期望表达和/或纯化的任何复合物或其它大分子集合体的需要(表达水平、化学计量学等等)分别组装。更优选的是构成多基因的基因从由编码多蛋白复合物成员的基因和编码代谢途径成员的基因所组成的组中进行选择。优选的多蛋白复合物为诸如转录因子复合物基因之类的基因调节蛋白复合物，诸如核运输和/或细胞运输中所涉及的复合物等运输复合物、蛋白折叠复合物、受体/配体复合物、细胞-细胞识别复合物、细胞凋亡中所涉及的复合物、细胞周期调节中所涉及的复合物等等之类的运输复合物。代谢途径成员为，例如碳水化合物代谢(例如醣酵解、葡糖异生、柠檬酸循环、糖原生物合成、乳糖途径、卡尔文循环等等)、脂质代谢(例如三酰基甘油代谢、脂肪酸激活、脂肪酸卩-氧化(偶数链/奇数链)、a-氧化途径、脂肪酸生物合成、胆固醇生物合成等等)，诸如谷氨酸反应、Krebs-Henseleit尿循环、shikimate途径、Phe和Tyr生物合成、Trp生物合成之类的氨基酸代谢等等，能量代谢(诸如氧化磷酸化、ATP合成、光合作用、甲烷代谢等等)，核酸代谢(噤呤及嘧啶的生物合成和降解、DNA复制等)。多蛋白复合物的成员和代谢途径成员可以从例如http:〃www.biocarta.com/genes/index.asp牙口G.Michal(ed)BiochemicalPatchways,l.editon,JohnWiley&Sons,Hoboken,NJ，USA,1999中获取,其所公开的内容以参考的方式结合在本文中。根据本发明的各个多基因都含有至少3个基因，即编码生物活性多肽的序列。更优选的是编码4、5、6或者甚至更多蛋白的多基因。按照如上所提及的，优选的是能够裂解与多肽相连的蛋白酶裂解位点的一种或多种蛋白酶由至少一种多基因所编码。根据优选实施方案，本发明的多核苷酸包含至少两个均可以可#:作地连接到一个多基因上的启动子序列，由此能够控制多基因的表达。本发明构建体中合适的启动子可以选自由下列物质所组成的组polh、p10和pXIV的极晚期枯草病毒启动子、vp39枯草病毒晚期启动子、vp39polh枯草病毒晚期/极晚期启动子、p^冲。狄、pc加、e//、/35、J"26枯草病毒早期启动子；CMV、SV40、UbC、EF-la、RSVLTR、MT、PDS47、Ac5、Pgal和Padh。启动子序列可以是对所有多基因来说都是相同的，或者也可以为不同的多基因选择不同的启动子。优选地，每个含有本发明多基因的ORF的两端都被诸如SV40、HSVtk或BGH(骨生长激素)之类的终止序列所连接。本发明的多核苷酸可以包括诸如增强子或抑制序列等其它调节序列。进一步优选根据本发明的多核苦酸含有至少一个用于整合到载体或宿主细胞中的位点。该整合位点可方便地把多核苷酸分别基因组整合或瞬时整合到载体(例如病毒)和宿主细胞(例如真核宿主细胞)中。基因组整合位点更为优选。特别优选的整合位点是那些适合于把多核苷酸整合到病毒中的位点。更优选地，整合位点适合于多核苦酸整合到选自下列病毒所组成的组的病毒中腺病毒、腺相关病毒(AAV)、自主性细小病毒、单纯疱渗病毒(HSV)、逆4争录病毒、rhadinovirus、Epstein-Barr病毒、十曼病毒、塞姆利基森林病毒以及杆状病毒。在其它优选实施方案中，整合位点适合于把多核苷酸整合到真核宿主细胞中，所述真核宿主细胞优选选自下列细月包所组成的组哺乳动物细胞(诸如人细胞，例如HeLa、Huh7、HEK293、HepG2、KATO-III、IMR32、MT-2、胰腺(3细胞、角质形成细胞、骨髓成纤维细胞、CHP212、原代神经细胞、W12、SK-N-MC、Saos-2、W138、原代肝细胞、FLC3、143TK-、DLD-1、脐静脉细胞、胚胎肺成纤维细胞、原代包皮成纤维细胞、骨肉瘤细胞、MRC5、MG63细胞等等)、猪细胞(例如CPL、FS-13、PK-15)、牛(例如MDB、BT)细胞、羊(例如FLL-YFT)细胞、线虫(C.e/ega朋)细胞、酵母(例如酿酒酵母(S.cweT^,ae)、裂变酵母(S.pow6e)、白色念珠菌(C."/^c朋s)、巴斯德毕赤酵母(尸.paWo〃s))细胞以及昆虫细胞(诸如秋灰夜蛾(5Th^^e^fe),比如Sf9、Sf21，ExpressSf+,HighH5纟田月包，果虫乾(D.melanogaster),比^口S2Sc/me/Je尸纟田月包。特别优选的整合位点选自Tn7的转座子元件、X整合酶特异性附着位点以及SSR(位点特异性重组酶)，优选cre-lox特异性(LoxP)位点或FLP重组酶特异性重组(FRT)位点。在本发明的优选实施方案中该多核苷酸额外地包括以对毒性物质的抗性为基础来选择具有所需性质的宿主细胞的一个或多个抗性标记。合适的抗性标记实例是那些提供氨节青霉素、氯霉素、庆大霉素、大观霉素和/或卡那霉素抗性的抗性标记。为使本发明的多核普酸整合到原核宿主细胞中，该多核普酸优选包括用于进行增殖的、取决于原核宿主中的/^基因的条件性R6Kj复制起点。本发明多核苷酸的特别优选实施方案通过把多基因作为表达盒插入WO2005/085456A1(PCT/EP2004/013381)所公开的构建体中而产生。因此，优选本发明的多核普酸包括根据下式I的功能性排列X-T1-MCS1-P1-『A曙B1-P2画MCS2-T2曙Y(I)包括(a)以头对头、头对尾或尾对尾排列的至少两种表达盒T1-MCS1-P1和P2隱MCS1-T2，每种表达盒都包括多克隆位点MCS1或MCS2，MSC1的两侧为启动子Pl和终止序列Tl,MCS2的两侧为启动子P2和终止序列T2(b)在启动子Pl和P2之间具有至少一个增殖组件M(multiplicationmoduleM),包括至少两个限制性酶切位点A和B(c)至少两个限制性酶切位点X和Y,它们每个都位于一个表达盒两侧，^巾(i)限制性酶切位点A和X以及B和Y都是相容的，但是(ii)连接产物AY和BX不能通过限制性酶切位点A、B、X和Y特异性的限制性酶a、b、x或y来进行酶解，并且(iii)限制性酶切位点A和B以及限制性酶切位点X和Y是不相容的，其中每个多基因被插入到一个表达盒中。至于具有式(I)排列的构建体的另一优选实施方案，在WO2005/085456Al(PCT/EP2004/013381)中有明确地提及。具体而言，增殖组件M中的限制性酶切位点A和B选自由下列限制性酶切位点所组成的组限制性酶切位点BstZ171、Spel、Clal及Nrul或通过其同切点酶进行裂解的限制性酶切位点。同切点酶为具有相同裂解位点的限制性酶。此外，限制性酶切位点X和Y的优选实例是选自由Pmel和Avrll或通过其同切点酶进行裂解的限制性酶切位点所组成组中的限制性酶切位点。特别优选的具有插入到上式(I)所包含的一个表达盒中的各个多基因的多核苷酸包括下列特征(a)启动子PI和P2选自由polh及P10所组成的组；(b)终止序列选自由SV40及HSVtk所组成的组；(c)增殖组件M中的限制性酶切位点A和B选自由限制性酶切位点Bstl711、Spel、Clal及Nrul所组成的组；(d)限制性酶切位点X和Y选自由限制性酶切位点Pmel和Avrll所组成的组；并且(e)病毒整合的位点选自由cre-lox和Tn7所组成的组。至于具有上述根据式(I)排列的多核苷酸的制备，在WO2005/085456Al(PCT/EP2004/013381)中有明确地提及。在各自都含有多基因的两个或更多个ORF当中编码几种生物活性多肽的本发明多核苦酸的供应在多亚基蛋白复合物的编码基因的克隆和表达方面作出了重要改进一方面，由于待连接的编码序列尺寸和数目均巨大，因此把所有亚基基因组装至单个ORF当中通常来说是不可能或者是非常困难的。另一方面，对各存在于相分开的表达盒中的多亚基复合物的几个或所有成员进行有效组装通常被证明是非常低效的，这是由于复合物总产量是由表达最少的亚基所决定的。根据本发明，多蛋白集合体的亚基由至少两个各自编码至少三种多肽(优选非病毒来源)的多基因(每个都代表一个ORF)来进行编码，从而在构建体及其组成(尤其是多基因的集合体)的易管理性和表达效率(尤其是在本发明的多核苷酸存在于合适载体中的情况下)之间取得了最佳折衷。因此，本发明的其它实施方案是含有上述多核苷酸的载体。该载体可以选自由质粒、表达载体和转移载体所组成的组。更优选地，本发明的载体可用于真核基因转移、瞬时基因转移或病毒载体介导的基因转移。尤其优选的载体是真核表达载体诸如选自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、自主型细小病毒(autonomousparvovirus)、单纯疱渗病毒(HSV)、逆转录病毒、Epstein-Barr病毒、慢病毒、塞姆利基森林病毒(Semlikiforestvirus)和杆状病毒之类的病毒。本发明最优选的载体是杆状病毒表达载体。本发明优选的杆状病毒是其中基因v-cath和chiA是被功能性破坏的实施方案，原因在于这使得感染以及蛋白表达期间细胞区室(cellularcompartments)的维持得到了改善。V-cath基因编码由依赖于病毒DNA、chiA中并列基因的过程而引起的细胞死亡所激活的病毒蛋白酶V-CATH,所述并列基因编码曱壳酶。这两种基因优选都被破坏以消除V-CATH活性并得以选择利用壳多糖亲和色谱而不产生干扰形式的chiA基因产物。因为病毒依赖性蛋白水解活性和细胞裂解的减少，由缺少功能活性v-cath和chiA基因的杆状病毒系统所生成的表达产物质量得到显著改善。优选地，对于cre-lox位点特异性重组而言，本发明的载体包括SSR位点，优选LoxP位点。更优选地，cre-lox位点位于杆状病毒基因v-cath和chiA中的一者或两者当中以破坏它们的功能。本发明的载体优选包含一个或多个用于筛选成功转染有正确组装载体的宿主的标记基因。合适的标记基因实例是荧光素酶、P-Gal、CAT、编码诸如GFP、BFP、YFP、CFP及其变体的荧光蛋白的基因以及lacZa基因。一种或多种标记基因可以是所提及实例的功能性等同的变体、突变体、片段或类似物或者是本领域技术人员所知道的其它合适标记物。在氨基酸水平上，变体、突变体或类似物与来源于所述变体、突变体或类似物的标记物相比优选表现出至少75%、更优选85%、尤其优选90%、特别是至少95%的同源性。在另一优选实施方案中，本发明的载体包括转座子元件，优选Tn7附着位点。更优选地，这样的转座子元件，例如Tn7附着位点，位于标记基因内以便由转位所产生的成功整合可以通过测试该功能性标记基因所提供的表型来进行评估。参见SEQIDNO:1和2以及图1和2，其分别公开于上述专利申请中)所公开的pFBDM或pUCDM为基础。本发明其它优选的转移载体是分别以上述pFBDM和pUCDM载体的衍生物为基础的。特别优选的pFBDM和pUCDM的衍生物的实例是转移载体pSPL(图3)、pFL(图4)、pKL(图5)及pKDM(图6)。,口pUCDM—样，pSPL含有条件性复制起点(R6Ky)。pKL(比如pFBDM)含有高拷贝数的复制起点(ColEl)。pKDM和pKL具有源自pBR322的^f氐拷贝复制起点。与pFBDM类似，pFL、pKL和pKDM也含有转座子元件(Tn7R、Tn7L)。载体pSPL、pFL及pKL具有位于双表达盒两侧的LoxP不完全反向重复序列(和pUCDM—样)。所有载体都含有上述增殖元件(M)以产生多基因盒l。在Cre介导的质粒融合中，PFL和pKL(以及衍生物)为接受载体，pUCDM和pSPL(以及衍生物)是供体载体。上述用于产生本发明构建体的转移载体的优选实例的重要特征概括在下表1中。表l:优选的转移载体的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*或者是任何其它普通试^r克隆菌林(redendA-Pif)**参见WO2005/085456A1因此，可以通过限制性酶切和酶连接或者通过重组(例如，采用BD融合酶)把本发明的多基因插入诸如pFBDM、pUCDM、pSPL、pFL、pKL或pKDM之类载体的多克隆位点(MCS1和MCS2)当中。杆状病毒转移载体pFBDM、pUCDM、pSPL、pFL、pKL或pKDM包括经改造以提高蛋白产量的经修饰的受体杆状病毒DNA,并且可通过简单快速的方法，经由进入位点(accesssites)(attTn7和LoxP)把基因整合到适用于该目的的五.co//细胞当中的杆状病毒DNA上。根据又一实施方案，本发明提供含有本发明的多核香酸和/或载体的宿主细胞。优选的宿主细力包的实例为哺乳动物细胞，例如人细月包、啮齿动物细胞、诸如CPL、FS-13及PK-15之类的猪细胞、诸如MDB和BT之类的牛细胞、诸如FLL-YFT之类的羊细胞、线虫细胞、诸如酿酒酵母、裂变酵母、巴斯德毕赤酵母以及白色念珠菌之类的酵母细胞、昆虫细月包，例如来自秋灰夜蛾的细胞和诸如WSc/meWer细胞之类来自果蝇的细胞，来自秋灰夜蛾的细胞优选Sf9、Sf21、expressSF+或HighFiveh5细胞、和诸如大肠杆菌之类的细菌，优选ToplO、Dh5a、DH10a、HB101、TG1、BW23473及BW23474菌抹。优选的人细胞选自Hela、Huh7、HEK293、HepG2、KATO-III、IMR32、MT-2、胰腺卩细胞、角质形成细胞、骨髓成纤维细胞、CHP212、原代神经细胞、W12、SK-N-MC、Saos-2、W138、原代肝细胞、FLC3、143TK-、DLD-1、脐静脉细胞、胚胎肺成纤维细胞、原代包皮成纤维细月包、骨肉瘤细胞、MRC5、MG63细胞。含有本发明的多核苷酸和/或载体的宿主细胞可以是分离细胞或者它们可以存在于组织或器官中。本发明的另一实施方案涉及转化有本发明的至少一个多核普酸序列和/或载体的除人外的转基因动物。优选的转基因动物是啮齿动物、猪、牛及线虫的种。本发明的转基因动物特别适用于阐明多蛋白复合物的作用或者用于体内筛选生物活性化合物。本发明的另一实施方案为根据上文所述的多核苷酸的制备方法，包括如下步骤(a)提供优选扩增构成所述至少两个多基因的基因的编码区域；(b)为所述编码区域提供编码所述至少一个蛋白酶裂解位点和/或所述至少一个自我裂解肽的序列；并(c)组装步骤(a)和(b)所获得的片段以便在各多基因中形成单个ORF;并(d)把所述至少两个多基因组合到单个多核苷酸中。本发明的另一方面为用于制备本发明载体的方法，包括如下步骤(a)按照上文所述产生至少两个多基因，它们各自在单个ORF中都含有至少3个基因(优选通过上述制备本发明多核苷酸的方法)；并(b)把该多基因克隆到质粒或病毒载体中，其中每个多基因中的至少一个基因是非病毒来源的，并且由该基因所编码的至少两种多肽能够至少瞬时与由该基因所编码的另一多肽进4亍相互作用。优选地，装配到多基因中的一个基因是编码能裂解蛋白酶裂解位点的蛋白酶的基因，所述裂解位点连接由多基因所编码的多肽。优选上文所述蛋白酶。本发明的多基因及载体的构建能够通过本领域技术人员通常所知的各种分子物学技术(参见，例如，A謂beletal(eds)CurrentprotocolsinMolecularBiology,HohnWiley&Sons,Hoboken,NJ,USA，2003)来实现。多基因的制备可以通过例如PCR扩增编码特定多肽的核苷酸序列(例如，采用相应的cDNA模板)来实现，优选利用提供编码至少所述一种蛋白酶裂解位点和/或所述至少一种自我裂解肽的序列的引物(5、或3')。优选地，该引物还包括识别合适限制性酶的序列。优选地，各个引物都含有与另一引物的限制性酶切位点不相同的限制性酶切位点，从而使所得扩增产物与另一扩增产物和/或含相同限制性酶切位点的线性化载体进行定向连接成为可能。根据另一通过定向连接来制备构建体的优选实施方案，引物可以包括限制性酶的识别序列，所述限制性酶产生诸如RsrII或Bs伍II之类无法自我连接的悬突。在引物自身不包含限制性酶切位点的情况下，也有可能提供具有含一个或多个期望限制性酶切位点的接头的扩增产物。当然，也有可能利用任何来源(除了扩增以外)来提供期望多肽的编码区域。例如，所需的序列可以如所述那样已经存在或者存在于相应载体中，其中所述序列可以通过合适的限制性酶剪切而从相应载体中获得。通过连接合适的含所需元件的接头来为不含有合适限制性酶切位点等的构建体提供合适的序列(限制性酶切位点、蛋白酶裂解位点/自我裂解肽、接头等等)。随后用合适的限制性酶对扩增产物或任何其它合适的构建体(含限制性酶切位点)进行酶切。当然，优选对所采用的任何引物序列进行选择以便在最终的多基因组装之后，优选进入合适的载体之后，每个多基因都可以形成一个ORF。根据本发明优选实施方案，扩增产物或其它合适的序列随即可以顺序连接或同时连接到合适的载体中，例如在上述MultiBac载体系统的MCS1或MCS2。例如，可以把一个多基因引入pFDBM中而另一多基因则可以连接到pUCDM(如WO2005/085456Al(PCT/EP2004/013381)中所描述的)。所形成的构建体随即通过cre-lox位点特异性重组(pUCDM衍生物)和Tn7特异性转座(pFBDM衍生物)而用于制备相应的杆粒，以产生可用于感染用于表达和纯化所研究多蛋白复合体的相应昆虫细胞的杆状病毒表达载体。除了通过限制性酶切/连接来制备多基因并把这些多基因引入合适载体之外，利用合适的重组酶进行同源性重组来组装该构建体也是可能的。基于重组酶克隆技术的合适实例为可以从BDBiosciencesClontech,Heidelberg,Germany获得的In-Fusion⑧系统(参见Clontechniques,October2002,P.10)和可以从GeneBridegesGmbH,Dresden,Germany获得的Red/ET重组系统(参见WO-A-99/29837;http:〃www.genebridges.com)。In-Fusion系统要求在将要被融合入具有相应同源区域的线性构建体(例如合适的载体)的DNA分子之中有15bp的同源区域。相应地，含有本发明多基因的载体可以通过为组成型编码区域(和编码蛋白酶裂解位点和/或自我裂解肽的连接序列一起)提供15bp的合适同源序列来依次组装或者同时进行组装。如果需要，可以对15bp的同源序列进行选择，以便按照所需顺序组装组成型编码区域。当然，合适的同源区域1^(1@^丁@重组系统与In-Fusion⑧系统不同，区别在于前者需要40bp-60bp的同源序列，但待插入片段的构建体不必是线性的。在表达双重组酶系统"ET"(RecE/RecT或Reda/Redp)的宿主优选大肠杆菌菌抹的体内进行重组。由此，构成多基因的片段可以直接和合适的载体一起转化到合适的宿主优选大肠杆菌细胞中。通过该方式，每个多基因既可以一个片段一个片段(优选包含多蛋白复合物的成员多肽的编码区域+至少一个蛋白酶裂解位点序列/自我裂解肽序列的编码区域)依次组装至合适的载体中，也可以通过同时转化所有片段组装至合适的载体中。由于本发明人已经发现用该构建体表达相应多蛋白产生相当的表达水平，因而本发明特别优选的多核苷酸构建体含有至少具有类似长度的多基因。根据本发明，"类似长度的多基因"是指多基因的核苷酸序列相互之间长度差别不超过50%,更优选不超过30%,特别是不超过20%甚至更少。此外，本发明提供了一种在体外制备多蛋白复合物的方法，包括如下步骤(a)在合适的培养基中以允许多基因表达的条件培养本发明所述的宿主细胞；并(b)从培养基和/或宿主细胞中回收由多基因所编码的表达产物。本发明也涉及一种在体内制备多蛋白复合物的方法，包括如下步骤(a)按照上面所述产生至少两个多基因，它们各自在单个ORF中都含有至少3个基因，并(b)把该多基因转化入动物中，从而在所述动物中表达该多基因。优选地，根据步骤(b)用多基因转化动物受到载体尤其是病毒载体更优选是杆状病毒载体的影响。杆状病毒载体是把多基因送递到哺乳动物种当中的特别有用的载体。上述体内方法优选在哺乳动物、线虫或昆虫中实施。合适动物种的特别优选实例在上文中作了限定。本发明实施方案也可用于制备直接针对蛋白多亚基集合体的疫苗。与各个蛋白组成的复合物相比，多亚基复合物通常展现出不同的表位。因此，根据本发明所制备的多蛋白复合物以更合适的方式展现出天然存在的相关表位，由此为抗体制备提供了更好的目标抗原。近来，利用重组杆状病毒表达载体制备了由来自严重急性呼吸器官综合症(SARS)冠状病毒的4种蛋白所组成的病毒粒子样颗粒(VLP)(参见Morolaetal.(2004),FEBSLett.576,174-178)。利用本发明所述的多基因表达系统将较大地方便于这种疫苗制备用感染性颗粒的有效表达。特别地，通过本发明所述的表达工具可以使含有比SARS-VLP实例显著有更多多肽的多亚基集合体的获得高产表达。因此，本发明还涉及制备疫苗的方法，包括如下步骤(a)给哺乳动物施用至少一种本发明的多核苷酸和/或载体，藉此本发明的多基因在该哺乳动物中进行表达；(b)任选对该哺乳动物施用佐剂；并(c)任选对特异性针对由该多基因编码的至少一种多肽的抗体和/或产生该抗体的脾细胞进行分离。本发明提供了重组制备多蛋白集合体的简便方法。可就蛋白复合物的相互作用或组成这些多亚基集合体的蛋白的修饰对这些多亚基集合体进行检测。根据本发明所产生的多亚基集合体也可以用于检测它们与可发挥出具有医疗价值、显著生物活性的候选化合物(有机小分子、核酸、肽、多肽等等)之间的相互作用。因此，本发明也涉及用于检测蛋白复合物之间相互作用或蛋白质修饰的方法。根据优选实施方案，本发明提供了一种对蛋白复合物相互作用或多蛋白复合物修进行体外筛选的方法，该方法包括如下步骤；(a)提供本发明所述含有至少两个多基因的宿主细胞；(b)把该宿主细胞维持在允许该多基因表达的环境中；并(c)对该多基因所编码的多肽之间的相互作用或修饰进行检测。本发明的另一优选实施方案为候选化合物体外筛选方法，所述候选化合物能够(i)与多蛋白复合物进行相互作用和/或(ii)对多蛋白复合物中的蛋白进行修饰和/或(iii)抑制多蛋白复合物之内或之间的相互作用和/或抑制多蛋白复合物之内的蛋白质的修饰作用，所述体外筛选方法包括如下步骤(a)提供本发明所述含有至少两个多基因的宿主细胞；(b)把该宿主细胞维持在允许该多基因表达的环境中；(c)候选化合物与该宿主细胞相接触；并(d)对该表达产物与该候选化合物之间的相互作用和/或该表达产物之间的相互作用和/或该表达产物的修饰和/或该表达产物之间相互作用的抑制进行检测。本发明的多核苷酸和/或载体也适合于体内筛选蛋白-蛋白、蛋白-(多)蛋白复合物或者多蛋白复合物-多蛋白复合物相互作用或者多蛋白复合物的修饰(磷酸化、糖基化等)。因此，本发明的另一优选实施方案为体内筛选候选化合物的方法，所述候选化合物能够(i)与多蛋白复合物进行相互作用和/或(ii)对多蛋白复合物中的蛋白进行修饰和/或(iii)抑制多蛋白复合物之内或之间的相互作用和/或抑制多蛋白复合物之内的蛋白质修饰作用，该方法包括如下步骤(a)提供含有至少一个本发明的含至少两个上述多基因的多核苷酸和/或载体的动物，藉此该多基因在该动物中进行表达；(b)给该动物施用候选化合物；并(c)对该表达产物与该候选化合物之间的相互作用和/或该表达产物之间的相互作用和/或该表达产物的饰和/或该表达产物之间相互作用的抑制进行检测。本发明所述的多蛋白表达工具也具有医疗用途。特别地，生物活性多蛋白复合物和具有医疗优势的蛋白质组合物，例如抗体混合物，任选可与白细胞介素和/或佐剂联合，通过本发明的多核香酸和/或基因送递载体而被施用到动物或人中。由此，本发明进一步涉及上述多核普酸和/或载体和/或宿主细胞用于制备包含用于基因治疗的多基因转移载体的药物中的用途。目前正尽很大的努力发展治疗用途的基因递送系统。在过去基因疗法既聚集了巨大的热情也是批评的焦点。而今，在获取安全且可临床应用的人类疾病体内外治疗方法的道路上，基因疗法的临床试验评价已经取得了很大进步(参见WorgallS.(2004)Peadiatr.Nephrol.)。总体上，目前基因疗法作为一种非常有前途的校正遗传性及后天性失调方法，该疗法需要永久或短暂表达治疗性基因产物(Worgalls.,ibid.)。基于病毒的重组载体，特别是那些无法在哺乳动物中复制的重组载体(例如杆状病毒)近来已经作为哺乳动物细胞基因递送的有力工具而出现并已成功运用于包括人、灵长类动物、啮齿动物、猪、牛以及绵羊细胞在内的整个哺乳动物细胞系中(参阅KostandCondreay(2002)TrendsBiotech.20,173-180)。为了获得离体和体内综合基因转移/治疗效果，出现了越来越多的polycistronic病毒载体需求以便通过组合基因疗法而非单个基因疗法来获得更有效的结果(deFelipe(2002),Curr.Genether.2,355-378;Planelles(2003)Meth.Mol.Biol.229,273-284)。通过利用具有装载了人衰老加速因子蛋白融合域的杆状病毒gp64包膜蛋白的pesudotyped杆状病毒(Hueseretal.(2001)Nat.Biotech.19,451-455)阐明了把accessory基因结合入载体病毒中的必要条件，其中上述载体病毒被施加到体内以阻止例如由于补体系统引起的钝化(inactivation),这举例说明了除被转移的多个基因之外，为了实现治疗目的而在病毒制备水平上进行重组修饰的必要性。由此，对制备基因治疗药物而言本发明所述的重组杆状病毒是优选的。更优选地，用作本发明药物的载体是包括至少两个上面所定义的多基因的杆状病毒，所述多基因编码(i)一个或多个治疗性多肽以及(il)一个或多个杆状病毒蛋白。在优选实施方案中，根据(ii)的蛋白是从假型(pseudotyped)杆状病毒所表达的人源化杆状病毒蛋白，优选人源化杆状包膜蛋白gp64,例如融合有诸如衰老加速因子之类人蛋白的gp64。此外，本发明涉及体内基因疗法，包括如下步骤(a)提供含有本发明所述多核苷酸的多基因转移载体；以及(b)给患有遗传病的患者施用该多基因转移载体。本发明进一步提供离体基因疗法，包括如下步骤(a)收集患有遗传病的患者的细胞；(b)用含本发明所述多核苷酸的多基因转移载体来转化所收集的细胞；并(c)给该患者施用该转化的细胞。根据本发明所制备的多蛋白复合物可方便地用于生物物理学研究，尤其是利用结晶学、电子显微镜和/或NMR技术所进行的结构研究，蛋白质化学研究，特别是用于蛋白质-蛋白质之间相互作用，以及用于药物开发。由此，本发明涉及本发明所述多核苷酸和/或载体和/或宿主细胞在多蛋白复合物结晶中的用途。本发明的另一实施方案为制备多蛋白复合物的试剂盒，包括(a)用于PCR扩增构成多基因的编码序列的引物；(b)质粒或病毒载体；以及(c)任选的适合于质粒或载体增殖的宿主细胞。引物被便利地设计来满足制备各多基因的单个ORF的需要，并且可以含有与质粒或病毒载体(依次地或同时地)连接的限制性酶切位点和/或该引物可以含有通过同源重组(例如，采用上述In-fusion⑧系统或Re^/E俨系统)将多基因组装和/或插入质粒或病毒载体的序列。图1示出编码人TATA-BOX结合蛋白(hTPB)核心(hTBPc,在位置159截断的全长蛋白的c-端片段)的PCR产物的核苷酸序列(SEQIDNO:1)和推断的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。指出RsrII限制性酶切位点(存在于引物序列中)的位置。图2示出hTBPc基因区段体外连接和混合物的亚克隆的琼脂糖凝胶电泳析照片。PCR扩增的hTBc基因经RsrII消化并纯化(第1道)。与连接酶温育后产生含l个、2个、3个及更多个与每一个ORF中的基因相连接的串联体(concatamer)的梯状电泳带(第2道，第3道为MBIDNA标记物lkb梯状电泳带)。对由此所产生的含一个多基因的表达构建体的混合物进行亚克隆，其中每个所述多基因都具有不同数目的能够用RsrII进行限制性酶切消化来释放的经连接的hTBPc基因(第4-7道)。在所插入的多基因证据(evidence)1(第8道)、2(第9道)、3(第10道)及5(第11道)hTBPc基因之外所进行的消化，在每一条中所述hTBPc基因都是在单个ORF中产生的。图3显示作为本发明优选的转移载体构建体基础的基本转移载体pSPL的示意图。图4显示作为本发明优选的转移载体构建体基础的基本转移载体pFL的示意图。图5显示作为本发明优选的转移载体构建体基础的基本转移载体pKL的示意图。图6显示作为本发明优选的转移载体构建体基础的基本转移载体pKDM的示意图。图7显示作为本发明优选的转移载体构建体基础的基本转移载体pFBDO[hTBPc]3的示意图。图8显示pFBDO[hTBPc]的核普酸序列(SEQIDNO:3)。图9显示转移载体构建体pUCDMCSTAFlTBPcTAF2的示意图。图10显示pUCDMCSTAFlTBPcTAF2的核苦酸序列(SEQIDNO:4)。图11显示转移载体构建体pFBDO[HisTEVTAF6TAF9]his的示意图。图12显示pFBDO[HisTEVTAF6TAF9]his的核苷酸序列(SEQIDNO:5)。通过以下非限制性实施例对本发明作进一步阐述。实施例实施例1:制备多基因并连接于表达载体中此处通过利用人TATA-Box结合蛋白(hTBP)核心(hTBPc，在位置159截断的全长蛋白的c-端片段)示出多基因制备的原理。利用正义引物通过聚合物酶链式反应(PCR)对编码hTBPc的基因进行扩增，所述正义引物结合到含有具有RsrII限制性酶切位点的悬突且进一步编码氨基酸间隔区和烟草蚀紋病毒(TEV)裂解位点的基因的5、端。反义引物结合到该基因的3'端并含有RsrII限制性酶切位点。RsrII为产生3个核苷酸的不对称悬突的限制性酶，该悬突无法自我连接，因此，该限制性酶切产物是不对称的并且该连接生成方向性产物。PCR产物经RsrII消化并纯化。图1显示了PCR产物的DNA(SEQIDNO:1)和推导的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。如图2所示，连接产生了hTBPc的串联体。把离体连接反应混合物亚克隆到合适的载体会产生含编码1、2、3及5hTBP蛋白的多基因的表达构建体，所述l、2、3及5hTBP蛋白处于单个多蛋白中并由TEV蛋白酶裂解位点所间隔。图3和4分别显示了所形成的一个表达载体(pFBDO[hTBPc]3)的示意图和核苷酸序列(SEQIDNO:3)。实施例2:构建含有编码人通用转录因子亚基的多基因的杆状病毒载体形成插入至由杆状病毒表达的转移载体pUCDMA(参见WO2005/085456A1(PCT/EP2004/013381))中、编码多蛋白的多基因，除hTBPc以外，该多蛋白还包括人TBP相关因子hTAFl和hTAF2，所述多基因中的基因被编码氨基酸间隔区和TEV蛋白酶位点的序列所间隔。图9显示了所形成的构建体pUCDMCSTAFlTBPcTAF2的示意图。该构建体的核香酸序列显示于图10中(SEQIDNO:4)。形成插入至由杆状病毒表达的转移载体pFBDM(参见WO2005/085456Al(PCT/EP2004/013381))中、编码包括TEV蛋白酶和人TBP相关因子hTAF6和hTAF9在内的多蛋白的多基因的另一构建体，该多基因中的基因被编码氨基酸间隔区和TEV蛋白酶位点的序列所间隔。图11显示了所形成的构建体pFDDO[HisTEVTAF6TAF9]his的示意图。图12显示该构建体的核普酸序列(SEQIDNO:5)。实施例3:制备杆粒构建体，昆虫细胞感染及蛋白表达为了构建含有上述两种多基因的杆粒构建体，构建体pUCDMCSTAFlTBPcTAF2(pUCDM衍生物)和pFDDO[HisTEVTAF6TAF9]his(pFBDM衍生物)各自一皮引入WO2005/085456Al(PCT/EP2004/013381))实施例5(针对pUCDMCSTAFlTBPcTAF2;CM-/ax位点特异性重组)和实施例6(针对pFDDO[HisTEVTAF6TAF9]his;Tn7转座)所述的DH10MultiBacCre细胞中。如果需要，可在WO2005/085456Al(PCT/EP2004/013381)所述DH10MultiBacCl:e细胞上进行一步式转座/cre-lox位点特异性重组。杆粒的制备、昆虫感染及蛋白表达可以根据已确定的方法实施(参见，例如，0、Reillyetal.(1994)"Baculovirusexpressionvector.Alaboratorymanual"OxfordUniversityPress,NewYork-Oxford;，，Bac-toBacTMBaculovirusExpressionSystemsManual"Invitrogen,LifeTechnologies,Inc.,2000)。下列序列表为本说明书的一部分，其中序列如下SEQIDNO:1为图1所示的编码人TATA-Box结合蛋白(hTPB)核心(hTBPc,在位置159截断的全长蛋白的c-端片段)的核苦酸序列。SEQIDNO:2为图1所示的人-Box结合蛋白核心(hTBPc)氨基酸序列。SEQIDNO:3为图8所示的pFBDO[hTBPc]3的核苦酸序列。SEQIDNO:4为图10所示的pUCDMCSTAFlTBPcTAF2的核普酸序列。SEQIDNO:5为图12所示的pFBDO[HisTEVTAF6TAF9]his的核苷酸序列。权利要求1.一种编码至少两个各编码至少三种生物活性多肽的多基因的多核苷酸，所述每个多基因都处于单个开放阅读框(ORF)中，其中构成多基因的基因所编码的至少两种多肽是非病毒来源的，构成多基因的基因所编码的至少两种多肽每一种均至少能够瞬时与由所述多基因的基因所编码的至少另一种多肽进行相互作用，并且构成每个多基因的基因彼此之间通过编码至少一种蛋白酶裂解位点的序列和/或通过编码至少一种自我裂解肽的序列而连接。2.权利要求1所述的多核苷酸，其中每个多基因都是可操作地连接在能够控制该多基因表达的启动子序列上。3.权利要求1或2所述的多核苷酸，其中每个ORF的两端为终止子序列。4.根据前述任一权利要求的多核普酸，其中所述蛋白酶裂解位点选自下列蛋白酶的裂解位点所组成的组马铃薯Y病毒NIa蛋白酶、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirusNIa蛋白酶、ByovimsRNA-2编码的蛋白酶、口瘉病毒L蛋白酶、肠道病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、微小核糖核酸病毒3C蛋白酶、豇豆花叶病毒组24K蛋白酶、香蕉苞片花叶病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C样蛋白酶、凝血酶、因子Xa和肠激酶。5.权利要求4所述的多核普酸，其中所述蛋白酶裂解位点为TEV(烟草蚀紋病毒)蛋白酶裂解位点。6.根据权利要求1-4中任一所述的多核苷酸，其中所述自我裂解肽选自由口瘠病毒2A肽和心病毒2A肽所组成的组。7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述自我裂解肽为FMDV(口蹄疫病毒)2A肽。8.根据前述任一权利要求所述的多核苷酸，进一步包括能够裂解所述蛋白酶裂解位点的蛋白酶的基因。9.根据权利要求5所述的多核苦酸，其中所述蛋白酶基因是至少一个所述多基因的一部分。10.根据前述任一权利要求所述的多核苦酸，其中至少一个多基因包括至少4个基因。11.根据权利要求IO所述的多核苷酸，其中每个多基因包括至少4个基因。12.根据权利要求1-11任一项所述的多核苷酸，其中所述多基因的核普酸序列的长度相互之间相差少于50%,优选少于30%，更优选20%。13.根据前述任一权利要求所述的多核苷酸，进一步包括至少一个用于整合到载体或宿主细胞中的位点。14.根据前述任一权利要求所述的多核苷酸，其中构成所述多基因的基因选自由编码多蛋白复合物的成员的基因和编码代谢途径成员的基因所组成的组。15.根据前述任一权利要求所述的多核苷酸，包括根据式I的功能性排列X-T1-MCS1國P1-rA-Bl-P2-MCS2-T2-Y(I)包括(a)以头对头、头对尾或尾对尾排列的至少两种表达盒T1-MCS1-P1和P2-MCS1-T2,每种表达盒都包4舌多克隆位点MCS1或MCS2，MSC1的两侧为启动子Pl和终止序列Tl，MCS2的两侧为启动子P2和终止序列T2(b)在启动子Pl和P2之间的至少一个增殖组件M,包括至少两个限制性酶切位点A和B(c)至少两个位点X和Y,它们每个都位于一个表达盒的两侧，^巾(d)限制性酶切位点A和X以及B和Y都是相容的，但是(e)连接产物AY和BX不能通过限制性酶切位点A、B、X和Y特异性的限制性酶a、b、x或y来进行酶解，并且(f)限制性酶切位点A和B以及X和Y是不相容的，并且其中每个多基因被插入到一个所述表达盒中。16.根据权利要求15的多核苷酸，其中增殖组件M中的限制性酶切位点A和B选自由下列限制性酶切位点所组成的组限制性酶切位点BstZ171、Spel、Clal及Nrul或通过其同切点酶进行裂解的限制性酶切位点。17.根据权利要求15-16所述的多核香酸，其中所述限制性酶切位点X和Y选自由Pmel和Avrll或通过其同切点酶进行裂解的限制性酶切^f立点所纟且成的纟且。18.根据权利要求15-17任一所述的多核苷酸，其中(a)启动子Pl和P2选自由polh及P10所组成的组；(b)终止序列选自由SV40及HSVtk所组成的组；(c)增殖组件M中的限制性酶切位点A和B选自由限制性酶切位点BstZ1711、Spel、Clal及Nrul所组成的组；(d)限制性酶切位点X和Y选自由限制性酶切位点Pmel和Avrll所组成的组；并且(e)病毒整合的位点选自由cre-lox和Tn7所组成的组。19.一种载体，其中包含根据前述权利要求任一所述的多核苷酸。20.根据权利要求19所述的载体，为真核表达载体或转送载体。21.根据权利要求19或20的载体，为病毒。22.根据权利要求21所述的载体，为杆状病毒表达载体。23.根据权利要求22所述的载体，其中所述杆状病毒基因v-cath和chiA一皮功能性-皮坏。24.根据权利要求19-23任一所述的载体，包括位点特异性重组酶(SSR)的位点。25.根据权利要求24所述的载体，包括cre-lox特异性重组的LoxP位点。26.根据权利要求19-25任一所述的载体，包括转座子元件。27.根据权利要求26所述的载体，其中该转座子元件是Tn7附着位点。28.—种宿主细胞，含有根据权利要求l-18任一所述的多核苷酸和/或根据权利要求19-27任一所述的载体。29.根据权利要求28所述的宿主细胞，选自由细菌、酵母细胞、昆虫细月包、线虫细月包和哺乳动物细胞所组成的组。30.根据权利要求29所述的宿主细胞，选自由如下细胞组成的组大肠杆菌(Eco/z)、酿酒酵母(S.cerevzw"e)、巴斯德毕赤酵母(尸.pa^w^)、裂变酵母(S./wm6e)、白色念珠菌(C.a/6,c"朋)、Sf9细胞、线虫(C.e/eg"朋)细胞、人细胞、啮齿动物细胞、猪细胞、牛细胞以及羊细胞。31.—种非人转基因动物，其用权利要求l-28任一项所述的多核苦酸和/或权利要求19-27任一项所述的载体转化。32.根据权利要求31所述的动物，选自啮齿动物、猪、牛和线虫。33.—种用于制备权利要求l-18任一项所述多核苷酸的方法，包括如下步骤(a)对构成所述多基因的基因的编码区域进行扩增；(b)为所述编码区域提供编码所述至少一个蛋白酶裂解位点和/或所述至少一个自我裂解肽的序列；(c)组装步骤(a)和(b)所获得的片段以便在各多基因中形成单个ORF;(d)把所述至少两个多基因组合到单个多核苷酸中。34.—种体外制备多蛋白复合物的方法，包括如下步骤(a)在合适的培养基中在允许多基因表达的条件下培养权利要求28-30任一项所述的宿主细胞；并(b)从培养基和/或宿主细胞中回收由多基因所编码的表达产物。35.根据权利要求1-18任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求19-27任一项所述的载体和/或根据权利要求28-30任一项所述的宿主细胞在制备含有用于基因治疗的多基因转移载体的药物中的用途。36.根据权利要求1-18任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求19-27任一项所述的载体和/或根据权利要求28-30任一项所述的宿主细胞在多蛋白复合物结晶中的用途。全文摘要本发明涉及编码用来编码至少3种多肽的多基因的多核苷酸，其中至少一种构成多基因的基因是非病毒来源的，至少2种由构成多基因的基因所编码的多肽都能够至少瞬时与由所述多基因的基因所编码的至少另一种多肽进行相互作用，并且构成多基因的基因相互之间通过编码至少一种蛋白酶裂解位点的序列来连接。本发明也涉及由多基因编码的多蛋白。本发明进一步的实施方案为含有重组多肽的载体，含重组多肽和/或载体的宿主细胞以及用重组多肽和/或载体转化的除人外的转基因动物。本发明也涉及多核苷酸的制备方法以及多蛋白复合物的制备方法。本发明的实施方案尤其可用于基因治疗、候选药物的筛选、疫苗制备以及为结构解析所进行的多蛋白复合物结晶。文档编号A01K67/027GK101356275SQ200680050687公开日2009年1月28日申请日期2006年11月6日优先权日2005年11月8日发明者I·伯格,T·里克蒙德申请人:Eth苏黎世公司