专利名称：：嵌合非整倍体干细胞的选择，增殖和使用的制作方法嵌合非整倍体干细胞的选择，增殖和使用与相关专利申请的交叉引用本申请主张于2005年11月9日提交的美国临时专利申请60/735,715的优先涉又，其全文在此引用作为参考。经联邦资助的研究和开发所形成发明的权利的声明本发明在政府资助下产生，该资助由国家卫生研究院授予，资助号K02MH01723。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术：
：干细月包具有在体内发育成为多种不同细月包类型的潜力。干细胞理^仑上可无限制地分裂以补充其它细胞。当干细胞分裂时，各新细胞既可能维持为干细胞，也可能成为具有特定功能的其它细月包类型，例如月几肉细月包，红血细月包或脑细月包。干细月包通常被分类为全能性或多能性。全能性干细胞具有完全的分化潜力它可生成体内所有不同类型的细胞。受精卵细胞是全能性干细胞的一个范例。多能性干细胞可生成体内来自于三个主要生殖细胞层或胚胎本身的任何细胞类型。祖细胞还可分化成为特化细胞。然而，与干细力包不同，-且细力包不能自我更新，且它们只能生成一种或少lt几种细"包类型。干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来自于胚胎。为进行研究，可从体外受精(例如在体外受精诊所)的卵子发育而成的胚胎获取胚胎干细胞，并在供体的知情同意下为研究目的进行捐献。胚胎通常在四或五天呈中空樣"求状(成为胚嚢)时获取。胚嚢包括三个结构滋养层，即围绕胚嚢的细月包层；嚢胚腔，即胚嚢内的空腔；以及内细胞团，在嚢胚腔一端约30个细胞的群。举例来说，可通过分离内细胞团并在体外生长获得胚胎干细月包。内细月包团通常生长于飼养细月包层(例如小鼠胚胎成纤干细胞具有多能性并可成为体内的任何细胞类型。成体干细力包为未分化的细力包。该种细"包可/人组织或器官中的分化细胞中鉴定得到。成体干细胞可自我更新，并能分化成为组织或器官的特化细胞类型。人胚胎干细胞(HESCs)在基础科学和治疗策略(包括再生医学中的移植)中具有极大的应用潜力(AmitM,等人AW227:271-278(2000))。HESCs4吏用上的一大挑战是维持稳定的细胞系，特别是在延续传^之后(AmitM,等人5/o/227:271-278(2000》CarpenterMK,等人DevZ)，229:243-258(2004》RosierES，等人Devi^"229:259-274(2004))。事实上，最近才艮道了由非整倍体干细月包克隆扩增导致的NM-资助的HESC系(例如Hl，H7,H9)的染色体不稳定性(DraperJS，等人NatBiotechnol22:53-54(2004);LakshmipathyU,等人5VemCe〃s22:531-543(2004);PeraMF，7VW5/o&c/wo/22:42-43(2004》。Themostfrequentlyreportedchromosomalabnormalitieswerehyperploidies,particularlytrisomiesofchromosomes12,17or20(DraperJS5等人NatBiotechnol22:53-54(2004);LakshmipathyU,等人StemCells22:531-543(2004》PeraMF,NatBiotechnol22:42-43(2004)),althoughthegeneralityofchromosomalinstabilityisuncertain(ThomsonJA,等人Science282:1145-1147(1998);AmitM，等人DevBiol227:271-278(2000);ReubinoffBE,等人NatBiotechnol18:399-404(2000);ThomsonJA，等人TrendsBiotechnol18:53-57(2000);XuC,等人.NatBiotechnol19:971-974(2001);ChengL,等人StemCells21:131-142(2003》.此前，细胞遗传学家曾忽略了未能鉴定所有染色体的细胞遗传学分析，因为人们认为缺失的染色体体现了细胞遗传学分析的不准确性，而非真的存在染色体缺失。事实上，遗传:技术人员协会的细胞遗传实—睑室手册指出如果在中期[分散]存在的染色体数量少于45条，可以^暇定部分染色体在处理过程中遗失，且中期[分散]不适合进行分斗斤。参见Barch等人,(1997)TheAGTCytogeneticsLaboratoryManual.Lippincott:Philadelphia。本发明指出了非整倍体在干细胞中的作用并提供了在其它问题中干细胞使用和分析的工具。发明概述本发明提供了检测和定义干或祖细胞的非整倍体嵌合情况的方法。在一些实施方式中，该方法包括检测群中非整倍体嵌合体的存在，其中在群内的不同细胞中至少4企测到3种不同的核型。在一些实施方式中，其中对群内的至少30个细胞进行非整倍性筛选。在一些实施方式中，对细胞的非整倍性进行记录。在一些实施方式中，在群内的不同细J包中至少才企测到4,5,6,7,8,9,10,15,20或更多种不同的核型。在一些实施方式中，该方法包括"险测具有净亚4咅体嵌合核型的细月包，并乂人具有净亚倍体嵌合核型的细月包中筛选染色体中至少部分为亚倍体的干或祖细胞系以进行分化，进一步增殖或移植。在一些实施方式中，该方法包括"险测具有净亚4咅体嵌合核型的细胞，并从具有净亚倍体嵌合核型的细胞中筛选染色体中至少部分为亚4咅体的干或3且细月包系以进4亍药物筛选。在一些实施方式中，该方法包括^r测具有净超倍体嵌合核型的细胞，并从具有净超倍体嵌合核型的细胞中筛选染色体中至少部分为超倍体的干或细l包系以进4亍分化，进一步增殖或移植。在一些实施方式中，该方法包括4全测具有净超倍体嵌合核型的细胞，并从具有净超倍体嵌合核型的细胞中筛选染色体中至少部分为超倍体的干或祖细胞系以进行药物筛选(例如，筛选可以选择性抑制或杀死细胞的药物)。在一些实施方式中，该方法进一步包括在4企测步骤前通过至少一个周期(例如，至少2，5,10,20，30，40,50,6070,80,100或更多)的细胞分裂对干细胞进行传代。在一些实施方式中，对细月包群中至少10%，20%,30%，40%,50%，60%，70%,80%,90%的细1包的核型进4亍了才企测。在一些实施方式中，该才企测步驶《包括了包含多重荧光原位杂交在内的荧光原^立杂交(FISH)。在一些实施方式中，该4企测步骤包括了光谱核型分析技术(SKY)。在一些实施方式中，该4企测步骤包括了G显带。在一些实施方式中，该才企测步骤包括了DAPI或其它染色体可碎见化染色或才支术。在一些实施方式中，该4企测步骤包括了流式细胞术。本发明还提供了与能够分化成为预期细胞类型的细胞相比优先抑制不能进行分化的细胞的药剂的筛选方法。在一些实施方式中，该方法包括将该药剂与具有净超4咅体嵌合核型的细月包相接触，其中该细胞无法分化成为预期细胞类型；以及选4奪抑制该细月包增殖的药剂。在一些实施方式中，该方法进一步包4舌以下步-骤将该药剂与具有亚倍体核型的细胞相接触，其中该细胞能够分化成为预期细胞类型；并且选择能够抑制不能分化的超倍体细胞的增殖，但不能明显抑制能够分化成为预期细胞类型的亚倍体细胞增殖的药剂。本发明还提供了干细胞或祖细胞群的维持或改善方法。在一些实施方式中，该方法包4舌^r测细胞群内的细胞中至少一个染色体或其部分的核型；并且将细胞群中在至少一个染色体或其部分上具有整倍体或亚倍体核型的细胞与在至少一个染色体或其部分上具有超倍体的细月包相4咅体或亚4吾体细力包来维*持或改善干细力包或3且细力包群。在一些实施方式中，通过荧光激活细胞分选(FACS)进4亍该^r测和分离步-骤。在一些实施方式中，在分离步-骤后4吏具有整4咅体或亚倍体核型的细胞分化。在一些实施方式中，在分离步-骤后具有整倍体或亚倍体核型的细胞被增殖。在一些实施方式中，在分离步骤后具有整倍体或亚倍体核型的细胞被移植到个体。定义"非整倍体"采用其标准含义，即，对单倍体染色体的^青确倍数的任意偏离(包括增加和/或减少)，以及染色体内变化。因此，在至少部分单倍体基因组的两个拷贝出现偏差，即，一条或多条染色体或其部分存在超过2个拷贝，或缺失一条或多条染色体或其部分将被认为是非整倍体。有时可用术语"非正体"来描述非整倍体，该术语包含在对非整倍体的此项定义之内。此处所用的"非整倍体嵌合体，，指在细胞群中至少存在三种不同的核型，其中至少两种为不同的非整倍体状态。在一些实施方式中，在细胞群中存在4,5，6,7,8，9，10或更多的4t型。"药物筛选，，指通过多(例如，库)分子筛选以鉴定一种或多种具有预期生物作用的分子。该种分子(有时称为"药剂")可包括，但不限于，小有机分子或生物分子，例如抗体，核酸，肽，脂质，糖或其组合。此处所用的术语"核型"指细胞中存在的染色体的数量和/或类型。"祖细胞"指可分化成为有限数量的细胞类型，〗旦通常无法反分化成为干细胞的细胞。例如，在骨髓中发现的血液3且细胞作为其自然进展的一部分可生成终末分化红和白血细胞。此处所用的"干细胞"指全能性或多能性的细胞。全能性干细胞可随着支持发育胚胎的胚胎胎盘分化成为任何的体细胞类型。全能性干细胞可生成发育有机体(包括胎盘)中所发现的所有细l包。多能性干细月包可发育成为三种主要的组织类型中的多种内胚层(例如，肠道内层)，中胚层(例如，肌肉，骨，血液)，以及外胚层(例如，表皮组织和神经系统)，^旦通常在发育;昝能上具有限制(例如，它们可形成胎盘组织或指定系的其它细l包类型)。图1显示了早代和晚代H7HESCs的染色体百分比数值。星号表示了整倍体细胞(46条染色体)在图中的预计位置。请注意两个细胞系在早代群中均显示了明显比例的亚倍体细胞，而晚代细胞则容易出现克隆超倍体。图2显示了早代和晚代H9HESCs系的染色体百分比数值。星号表示了整倍体细胞(46条染色体)在图中的预计位置。请注意两个细胞系在早代群中均显示了明显比例的亚倍体细胞，而晚代细胞则容易出现克隆超倍体。图3-4显示了超倍体对神经元分化的作用。在PA6细胞上培养哺乳动物ESCs以诱导神经元分化。然后在存在或不存在紫杉醇的情况下处理细胞6天以诱导非整倍体。测定染色体数，将平行培养皿固定并染色以测定神经元标记tujl。图3显示了紫杉醇对细胞的处理可诸导非整倍体，特别是超倍体。图4显示了紫杉醇诱导的超倍体明显降低了神经元分化潜能。发明详述I.导言本发明涉及令人惊奇的发现，即非整〗咅体嵌合体^J"常规存在和发育中的干细胞具有一定作用。如今的干细胞研究者相信3K整倍体仅是一种异常，因此未在移植或其它治疗用途中进行使用。事实上，当前干细胞分离和维持的方法强调了整倍体的至关重要。参见，美国专利6,200,806。相反地，本发明提供了在干细胞或祖细胞群中4全测非整倍体嵌合核型的方法，并提供了所选的特定非整倍体嵌合核型的干细胞或祖细胞的用途和分析。非整倍体嵌合体指细胞群内核型的分布。如此处所作的进一步解释，非整倍体嵌合体事实上并不异常，而是正常干细l包群的突出性能。然而，干细月包群确士刀的非整倍体嵌合体组成可同时影响两种基因型并能影响细胞群的表型，包括该群保留其分化成为多种分化细胞类型能力的能力。与之前对干细胞的描述不同，本发明发现在干细胞群内不同核型的嵌合体是一种标准，且它能影响细胞群的表型，包括其生理功能以及作为干细胞产生最佳作用的能力。相应地，本发明提供了"群核型分析"，其中^r测了群内比之前描述更多数量细胞的核型。此外，与之前描述相反，通过群核型分析所得的结果可选择具有特定非整倍体(例如，亚倍体核型)的细胞群，而在之前具有亚倍体的细月包或者-陂忽略，或者4皮主动丢弃。另外，本发明还允许选择特定非整倍体(例如，在特定染色体上的超倍体和/或在其它染色体上的整4咅体或亚倍体)。细月包群内不同核型的范例包4舌，^f旦不限于，至少一个具有正常染色体互补的细胞(例如，在人体中，22对称为"常染色体"的非性染色体加上两条性染色体)与至少一个非整倍体细胞同时存在。此外，在非整倍体嵌合群中可能存在各种单独群中的不同核型。例如，细胞群可包括一些特定染色体的部分或全部为亚在一些实施方式中，细胞群可包括一些特定染色体的部分或全部为胞。在一些实施方式中，细胞群可包括一些特定染色体的部分或全部为超倍体的细胞，以及其它不同染色体的部分或全部为超倍体的细月包。在一些实施方式中，在细l包群中至少部分细月包具有净亚倍体嵌合核型。"净亚倍体嵌合核型"指群内细胞的一条或多条染色体或其部分主要(例如，大于50,60,70，80,90,95或99%)为亚倍体的细胞群。在一些实施方式中，大部分细胞在一条特定染色体中为亚倍体。在其它的实施方式中，群内的亚倍体细胞在不同(例如，至少1,2,3,4,5或更多)染色体或其部分中为亚倍体。在某些情况下，对于特定染色体为亚倍体的细胞对其它染色体或其部分为整倍体和/或超倍体。可以理解虽然细胞群可具有"净"亚倍体核型，该群可包含整倍体和超4咅体细力包，尽管该细月包为少数。在一些实施方式中，在细月包群中至少部分细月包具有超亚倍体嵌合核型。"净超倍体嵌合核型"指群内细胞的一条或多条染色体或其部分主要(例如，大于50,60,70,80,90,95或99%)为超倍体的细胞群。在一些实施方式中，大部分细胞在一条特定染色体中为超倍体。在其它的实施方式中，群内的超倍体细胞在不同(例如，至少1,2,3,4,5或更多)染色体或其部分中为超倍体。在某些情况下，对于特定染色体为超倍体的细力包对其它染色体或其部分为整倍体和/或亚倍体。可以理解虽然细胞群可具有"净"超倍体核型，该群可包含整倍体和亚倍体细胞，尽管该细胞为少数。在一些实施方式中，该细月包群由亚4咅体和超4咅体细月包和/或同时包含亚倍体和超倍体染色体或其部分的细胞组成。以上方面的范例为具有一种染色体至少部分的三个拷贝^f旦只有另一染色体部分一个拷贝的细胞。在另一实施方式中，细胞群中的至少部分细胞包含染色体易位。本发明可用于任何类型的干或^L细胞。干细胞的示范类型包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞可来源于任何类型的动物，包括人和非人哺乳动物。因此，本发明所采用的干细胞包括人成体干细胞和人胚胎干细胞。祖细胞包括所有生物中存在的多种祖细胞类型，包括但不限于造血(血液)，神经系统，淋巴，胰腺，心脏，肺，肌肉，骨，软骨，结締组织，角膜，头发，皮肤，肝，肠，目艮，脂肪，乳腺，曱状腺，有性生殖的系。在一些实施方式中，癌症(或肿瘤)干细月包可通过选择与癌症表型相关的非整倍体进行分离。该种细胞是以鉴定特异性抑制或杀死癌症干细^9包为目的的药物筛选的有用^4示。另夕卜，可对干细胞群进行分选以排除与癌症相关的核型，从而使群中的剩余细月包可在移才直等应用中采用。分离干细胞和祖细胞的技术已众所周知并可参见，例如，Thomson等人，Sc/ewce282:1145-(1998);Bodnar,等人，5VemCe〃sA77iDeve/o/me"f13:243-(2004);Li等人，Cwrew/别o/ogy8:971誦(1998);Schwartz等人,Jowm(3/7Vewrosc/e"ceieyearc/z74:838(2003)。II.4企测非整倍体嵌合体与之前对干细胞的描述不同，本发明人发现无需克隆扩增特定的非整倍体。因此，可对更大量的细月包进4亍核型分冲斤乂人而测定核型分布。通常该分析包括对数量大于之前干细胞研究者通常采用的分析量的细胞进行核型分析。本领域的技术人员将能理解应对细胞群内的大量细胞进行单独核型分析以确定准确的核型分布(即，"非整倍体嵌合")，该细胞群可包^"整倍体核型。因此，在一些实施方式中对细月包群中超过30,50，75,100,150,200,300,同核型的准确分布。所分析细胞的数量将决定特定核型出现的检测限。例如，名夂才全测以1%频率出现的核型，需要测定细胞群内至少100个细胞的核型，优选观'J定如200,300，500或更多单个细月包的核型。在一些实施方式中，本发明的方法包含了测定足够量的单个细月包的4亥型以^r测以例3口1%，0.1%,0.001%,0.0001%,0.00001%或更小的频率出现的单独核型的存在。在一些实施方式中，对细月包群中所有细月包，或基本上所有细月包(例如，至少80,90，95或99%)的核型进4于了4全测。一^:而言，单个细力包的核型分冲斤将包括检测细胞中几乎所有的染色体，而非仅仅筛选一种特定染色体或染色体部分的存在。然而，在其它实施方式中，本发明还允许仅冲企测细胞中一些染色体的数量(例如，2,3,4,5或更多染色体)。尽管任何类型的显示方法均可用于显示由非整倍体嵌合检测所得的数据，本发明人发现以柱状图和/或表格形式有助于显示结果，乂人而直乂见显示细月包群中不同染色体或其部分的凄t量变化。图1-2显示了该种4主^]犬图的范例。如图1-2所示，该分斗斤可集中关注各分析细胞中染色体的总数。然而，还可对各细胞中各不同染色体的数量进行更具体的分析。体嵌合体。可通过核型分析测定染色体凄t量，染色体同一性和/或染色体完整性。染色体完整性指染色体处于完整的状态(处于正常状态)或显示曾通过破损，易位事件，孩i观事件(包括缺失，易位，插入，扩增，倒位以及染色体内或染色体间的任意变动)被破坏的证据。在一些实施方式中，可采用荧光原位杂交(FISH)法测定细胞核型。FISH法已为本领域公知并可参见，例如，美国专利申_清2005/0214842。多重FISH(M-FISH)法对多个染色体的核型分才斤特别有用。示范性的M-FISH法包括，光谱核型分析(SKY)法。SKY法的描述参见，例如SchrockE,等人Sc/e"ce273:494(1996);SpeicherMR,等人7VW2:368(1996);T,Vignon等人iV^G匿f15:406,(1997);Macville,M.，等人，倫，Ce〃，編108(4-5):299-305(1997)。SKY法涉及使用以各种焚光标记进行标记的多重染色体^笨4十，以可测标记来4吏染色体"着色"，/人而可以评估和鉴定完整的染色体互补。在一些实施方式中，如荧光激活细胞分选(FACS)等流式细i包术可用于测定细l包群中细胞的核型。例如，DNA染#十(例如，石爽化吡。定，溴化乙4t，Hoechst33342，33258,DAPI等)可用于标记细胞中的DNA，然后可基于来自染料的信号量对细胞进行分选。本方法提供了基于DNA含量对染色体总量的估计，但未提供特定染色体增加或减少的具体信息。然而，釆用非特异性DNA染泮+或其它标记的流式细月包术足以区分净亚4咅体细月包和净超4咅体细胞。作为非特异性DNA染并牛的替代物，还可采用对特定染色体具有特异性的标记。后一方法对未活3夭分裂因而处于间期的细月包最为有效。该探针可基于核苷酸，或仍能碱基配对的化学差异分子，例如肽核酸(具有肽骨架)等。尽管不是特别有效，假定如上讨论有足量细胞可进行分析，也可采用大规才莫传统核型分析。任何4企测染色体的染色或光学或生物物理:技术均可用于进^f亍核型分4斤。在一些实施方式中，可采用DAPI/其它荧光染色剂或明视野染色剂对染色体进行染色。可通过吉姆萨染色(G显带)等劳动密集型方法对淋巴细胞和羊水细胞等细胞进行传统的核型分析。在一些实施方式中，该4企测步骤包括使用PCR,优选结合DNA阵列和/或结合单核苷酸多态性数据和图谱进行单个细月包的全基因组扩增。采用荧光标签或其它方法的体内过程还可用于确定活干细胞的倍数性(例如，Kaushal等人，J脸w冊c/.23:5599-5606(2003))。由于基因由染色体表达，因而可能通过可测基因产物的定性或定量表达鉴定非整倍体的一些形式，从而允许使用非整倍体的替代或相关的标记。该技术可结合标准细胞分类纟支术(例如FACS),从而可通过其它方法鉴定非整倍体的不同形式。在一些实施方式中，本发明提供了根据细胞核型在细月包群(例如，干和/或—且细月包)中分选和分离不同细月包的方法，该方法可从超倍体核型中选走(或分离)整倍体或亚倍体核型。在一些实施方式中，所选的亚倍体(例如，至少一个染色体l或染色体1的部分缺失)细胞也可能在另一染色体或其部分为超倍体。然而，该选择和分类将针对特定的亚倍体(例如，在上述实施例中为染色体1)。替代性地，可从具有亚倍体核型的细胞中选走(或分离)具有整倍体或超倍体核型的细胞。括但不限于，FACS分选。这些分选方法可用于，例如，特别在需要去除潜在癌症超倍体细胞时，对干细胞和祖细胞群的常规质量维持和质量控制。III.干细胞选4奪后的使用本发明才是供了干细胞或祖细胞培养，生长和/或选择或是使用干细胞或祖细胞的方法，其中该方法包括监测和选择性维持特定非整倍体嵌合体的步骤。对特定非整倍体嵌合体的选择，即，测定，步骤和方法中的4吏用。其包括，^旦不限于，用于以下用途的干细胞或祖细胞移植，生成生物制剂(抗体，siRNA等)，筛选药物制剂(例如，干扰或加强干细胞增殖或分化的分子)，筛选毒素和/或其作用，检测生物防御制剂从而使指定的嵌合体具有允许药剂检测的确定性质，通过具有能允许适当抗原提呈或促进/抑制免疫应答的功能的干或纟且细力包^H古用于癌症治疗，纟且织生成，纟且织再生，接种疫苗的新药剂，同时为预后和诊断目的进行干或祖细胞基因分型(包括正常和病理标本)，遗传紊乱的治疗，非遗传紊乱的治疗，生物传感器(其中干或祖细胞经选才奪可对不同的刺激进4亍应答，/人而可以在导入有机体后或作为独立4全测器对内部或外部刺激进行应答)，损伤的治疗，整形手术，和/或生长因子，抗凋亡蛋白或其它蛋白的生成。所选一奪的非整倍体嵌合体的特定类型取决于所采用的干或-且细月包类型。在一些实施方式中，选择和/或维才寺具有净亚佶-体嵌合体的细胞群。在一些实施方式中，选4奪和/或维持具有净超倍体嵌合体的细月包群。在一些实施方式中，选择和/或维持具有特定核型组合(例如，易位和/或具有不同亚倍体和/或超倍体和/或整倍体的细"包的混合物)的细力包群。目标非整倍体嵌合体的特定类型可通过对细月包群中核型分布的监测以及确定目标表型或能力与特定核型分布之间的关联进行简单测定。该过程的范例可参见实施例。实施例中的步骤包括确定干细胞的核型分布，确定至少两个不同干细胞群之间的核型差异，以及确定目标表型与该核型分布之一的关联(例如，具有干细胞已在多种疾病，症状以及残障的治疗中引起了极大的兴趣，因为它们才是供了细胞和组织的可再生来源。骨髓中称为造血干细胞(HSCs)的血液形成干细胞是常用的干细胞类型。HSCs目前用于治疗白血病，淋巴瘤以及多种遗传性血液病症。然而，HSCs和其它干细月包具有相当大的潜力可用于治疗多种其它疾病。一系列报导提示特定的成体干细胞类型有能力分化成为多种细月包类型。例如，造血干细l包可分化成为脑细月包(神经元，少突细月包和星形细月包)(Hao等人，H.Hematother.5Ve淤Ce〃ie从12:23-32(2003);Zhao等人，iVw/.jc^/.Sc/,USA100:2426-2431(2003);Bonilla等人，A^/royc/.15:575-582(2002)),骨骼月几细月包(Ferrari等人，5We"ce279:1528-1530(1998);Gussoni等人，A^&"401:390-394(1999)),心月几细月包(Jackson等人，乂C/,"./"ve"107:1395-1402(2001》以及肝纟田月包(Lagasse等人，6:1229-1234,2000)。干细胞可用于治疗任何类型的需要进行组织替换或再生的有机体问题，包括，但不限于，发育性障碍，感染，退行性疾病，物理或化学损伤(包括外伤引起的损伤)。外伤相关的症状的范例包括中枢神经系统(CNS)损伤(包括对脑部，脊髓和CNS周边组织的损伤)，对外周神经系统(PNS)的损伤，或是对身体4壬意其它部分的损伤。该种外伤可能由意外引起，或是手术或血管成形术等医疗过程的正常或异常结果。该外伤可与如中风或静脉炎中的血管石皮裂或堵塞有关。在特定的实施方式中，该细月包可用于自体或异体组织替换或再生治疗或方案，包括，^旦不限于角膜上皮缺损治疗，软骨修复，面部皮肤磨削，粘膜，鼓膜，肠道内膜，神经结构(例如，一见网月莫，基底月莫中的听觉神经元，嗅上皮的嗅觉神经元)，皮肤的烧伤和创伤性损伤创面修复，或其它损伤或患病器官或组织的再建。引起损伤的特定症状或紊乱包括，但不限于，心肌梗死，癲痫发作，多发性石更化，中风，低血压，心脏停搏，缺血，炎症，与年龄有关的i人知功能损失，辐射损伤，大脑性瘫痪，神经退4亍性疾病，阿尔茨海默病，帕金才架氏病，Leigh疾病，ADDS痴呆症，记忆力损失，月几萎缩侧索硬化症(ALS),缺血性肾脏疾病，脑或脊髓外伤，心肺转流，青光眼，一见网月莫缺血，浮见网膜创伤，先天性代谢错误，肾上腺脑白质营养不良，嚢性纤维化，糖原贮积症，曱习大&泉功能减退症，镰习犬细i包血症，Pearson综合;f正，Pompe疾病，苯丙酮尿症(PKU)，吟啉病，4风糖尿症，高胱胺酸尿症，粘多lt病，'f曼性肉芽肺病和酪氨酸血症，Tay-Sachs疾病，癌症，肿瘤或其他病变或肿瘤症习大。干细胞可选#^生包含其数量足以引导目标基因在患者体内表达的外源性核酸载体或生物载体。常规重组核酸载体的构建和表达已为本4页i或7^知并包4舌在Sambrook等人，Mo/ecw/arC7o"/"gzj丄a6ora/or少Mawwa/,Vols1-3(2ded.1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress中所包含的l支术。该种4亥酉吏载体可包含在病毒和细菌等生物载体中，优选包含在非病原性或减毒樣i生物(包4舌减毒病毒，细菌，寄生虫以及病毒才羊颗4立)中。核酸载体或生物载体可通过体外体内基因治疗方案导入细胞，该方案包括从患者体内摘耳又细胞或组织，将核酸载体或生物载体导入摘耳又的细月包或组织，并3夺该细月包或组织重新移才直进入患者体内(例如，参见K羅ll等人，為.//e禍，尸/7"環.55:899-904(1998);Raymon等人，7Ve"ra/.144:82-91(1997);Culver等人，//w附.77zw.1:399-410(1990);Kasid等人，A^/.爿c^/.Sc/.U.S.A.87:473-477(1990))。该核酸载体或生物载体可通过如磷酸钓介导转染等方法导入摘取的细胞或组织(Wigler等人,Ce//14:725(1978》Corsaro及Pearson,5b附加'cCe〃Ge"e"'c5"7:603(1981》Graham及VanderEb,Wra/，52:456(1973))。也可采用如电穿孔(Neumann等人，五MBO乂1:841-845(1982))等其它4支术一^fe酸载体导入宿主细月包。本发明的细月包还可与其它药剂(例如其它细i包类型，生长因子和抗生素)耳关合施用。其它药剂可由本领域普通寺支术人员所决定。特定的干细力包类型可通过采用对干细力包的目标类型具有特异性的细胞标记进行鉴定。细胞标记可以是细胞系标记，代i射才示i己，通i凡才示i己，生长因子，净争录因子等。在净争定的实施方式中，特异性的细胞标记与具体的目标干细胞相关联。细胞标记可通过本领域已知的方法(例如免疫组化或流式细月包术)4全测。流式细胞术可允许快速测量由适当光照的细胞或颗粒产生的光散射和荧光发射。该细力包或颗粒在单独通过光束时生成信号。每个颗粒或细胞被单独测量，该结果代表了单个细胞特征的累计。对细胞标记具有特异性的抗体可釆用荧光染料标记，乂人而可通过流式细胞仪进行4企测。熟练的技术人员将了解如何测定一种或多种适用细胞标记。在特定的实施方式中，对于人类胚胎干细月包，适用的标"i己包括Oct4,TRA-1-60,TRA-1-81,SSEA-4。4十对造血干细月包的示范性细月包标记包4舌CD34+,Sca-l+，AA4.1+和cKit+,且在特定的实施方式中这些标记表示鼠造血干细胞。在替代性的实施方式中，人造血干细月包可以是CD34+或CD34-，CD38+,CD38(-)，ckit+,Thy110,ClFR+或其组合。针对神经干细胞的示范性标记包括嵌套蛋白，CD133+，BIM1和Sox2等。心脏干细月包的示范性标i己包4舌如干细胞抗原-1，CD45(-)，CD34(-)，Scal+或其组合。肠干细胞标记包括如A33+,cFMS+，c-myb+,CD45(-)或其组合。皮月夫干细月包标i己包4舌角蛋白19。在一些实施方式中，可对干细胞筛选特定的非整倍体嵌合体(即，核型分布)以确认存在特定的非整倍体嵌合体(或选才奪性筛选特定的嵌合体)，然后移才直进入动物体内(例如，人或其它哺乳动物)。通过调节干细胞的培养条件，可(选才奪在移植前)将干细胞诱导分化为预期的细胞类型(例如，血细胞，神经元，肌肉细"包或其它细力包类型)。该过禾呈可确〗呆由导入的干细月包^寻到最佳分化和功能。在一些实施方式中，可在细胞增殖前，增殖后和/或增殖时测定核型分布。在这些实施方式中，该干细胞可在细胞群的非整倍体嵌合性的^r测前，检测后或在4企测前后同时分裂。在一些实施方式中，可通过在细胞增殖期间和增殖后以及贮存后对非整倍体嵌合体的检测来确认和/或选择保留了与预期表型(例如，分化成为预期细胞类型的能力)相关的预期非整倍体嵌合体的细胞群。增殖可包括1,2,5,10,50或更多个细胞分裂周期。非整倍体嵌合体的水平和形式可通过定义对预期细胞类型和预期结果最佳的生长条件进行改变。如本实施例所述，细月包群内核型分布的4企测可允i午乂于保留或不保留分化能力的细胞群进行鉴别。本领域的技术人员可以利用该发现来鉴别和/或^吏用具有不同核型分布的细胞群以筛选与其它具有不同核型分布的细胞群相比优先改变表型，抑制，杀死或i秀导某种细胞群增殖的分子。不希望受限于本发明的特定实施方式，作为一个实施例，可采用具有与分化成为预期细胞类型的能力相关的净亚〗咅体嵌合核型的第一干细"包群和具有与分化成为预期细胞类型的能力缺失相关的净超倍体嵌合核型的第二干细胞群在药剂库(小有机分子，或生物药剂，例如抗体，siRNAs,核酸，肽等。)中进行筛选，并选择能抑制超倍体群生长的药剂。由于人们相信干细胞存在于肿瘤或癌症群中，这同样也是通过着眼癌症干细l包的细l包增殖来鉴定抗癌药剂的方法。这些药剂可通过进一步选择以鉴定不明显抑制净亚倍体细胞群生长的药剂，从而鉴定可用于维持具有按照预期进行分化的能力的细胞的药剂。替代性地，为预期细胞类型的能力。在前述部分实施方式中，鉴定了抑制净亚倍体细胞群同时不明显影响净超倍体细胞群的药剂。具体实施例方式由人胚胎干细胞(HESCs)的延续传代产生的染色体不稳定性4气表了它们在安全和有效的治疗应用中的潜在问题。最近，有才艮导显示在HESC系中通过传统细月包遗传冲支术测得了核型异常。为确定在延续传代后在当前HESCs中异常的范围，我们对早代和晚代H7和H9HESCs以及鼠ESCs联合采用了"光谱核型分析技术"和对染色体增加或减少的定量。除了对H7和H9夕卜，对每个HESC或鼠ESC以及包括非NIHHESCs的4企测获得了类似的结果(数据未显示)。与显示了原代克隆超倍性的晚代细胞不同，早代细胞显示了亚倍性。对嵌合非整倍体和整倍体哺乳动物ESC培养物分化成为神经元的能力进4于了评估，超〗咅体细月包显示了明显减少的分化潜能。这些^t据确定了哺乳动物ESC非整倍体的生理后果，并支持了对ESCs不同的非整倍体形式的常规监测。导言对H7和H9HESC系(来自于WiCellResearchInstitute,Madison,WI)在36-44代(早^)和77-884义(晚4戈)之间进4亍分才斤。采用SKY,结合染色体增加和减少的广泛定量对染色体互补和组织进行才企测。对所有可4妄受的中期分裂相的染色体减少或增加的翁:量进4亍定量并用这些值制图，而非^f又对当前在传统细月包遗传过禾呈中所用的非整倍体细胞的代表性或保守形式进行鉴定和汇报。所观察的非整倍体的显著性可通过对非整倍体哺乳动物ESCs分化成为特定细胞类型(例如神经元)的能力的评估进4于测定。在此我们报导HESC系可显示包括超倍性以及之前未有记录的亚倍性形式在内的一系列非整倍性。结果HESCs显示出随才几的染色体增加和减少以前采用传统细胞遗传学的研究曾才艮导HESCs在低代时基本上为整倍体(Thomson等人，1998;Amit等人，2000;Draper等人，2004a;Draper等人，2004b;Rosier等人，2004)。最近，Draper及其同事才艮导了在60代后，HI亚克隆H1.1A和Hl.lB出现了特别以染色体12或17的增加为特征的染色体变化(Draper等人，2004b)。为检测该非整倍体基因型在延长传代后的保留，参照已有的描述(Draper等人，20(Mb)培养H7和H9细月包系，并在不同的培养传代后进行比较(图1-2)。87代后显示H7细月包染色体1和12的增力o,这与前述报导相一致。这些晚代H7细胞中的大部分均表征为特定染色体的超倍性，显示非整倍体细胞的体外克隆扩增。定量后仅10%的细胞为整倍体(图1)。78代后，H9中75%的细胞显示了染色体12的i曾力口。通过比较，超过75%的仅扩增43代的早代细胞为数值整倍体(图1)。群内其余均为非整倍体，^旦与晚代H7细胞不同的是，其主要由不具有明显克隆性的亚倍体细胞组成(图1)。这些结果显示HESCs重复传代后可产生不同形式的染色体不稳定性，并对整倍体子群具有明显不同的影响。在所有其它经斥企测的HESCs中均可观察到类似的结果。为比较G显带和更具体的核型分析技术，我们同时采用了G显带和SKY-PK来分析两个在早代时为100°/。整4咅体的hESC系(H7和H9)。通过标准方案(Barch,1997)收集相对低代(H743^(p43)，H9p37)和高^f义(H7p87,H9p78)的细月包。将才羊本送至细胞遗传实验室，通过G显带进行核型分析。在我们的实验室对来自相同原始hESCs断裂的样本通过SKY-PK进行处理。对每个样本，分别由两个独立的观察者分析四十个中期分裂相。以表格形式记录单个核型(表I)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>对于早代样本，G显带研究才艮导了始终一致的100%整倍体率。与之截然不同的是，经SKY-PK鉴定介于72.5-80%的hESCs为整倍体。SKY-PK显示早代嵌合非整倍体群为非克隆性且主要4旦不完全是亚倍体(具体核型参见表I)。相反地，对于晚代hESCs,G显带和SKY-PK产生了尽管不完全一致〗旦是类似的结果，大部分细胞显示了克隆性染色体增加，而SKY-PK鉴定到了较少的嵌合非整倍体组成。由于多种原因，所观察到能解释多凄史嵌合体的染色体减少并非由技术误差引起l)晚代hESC系中未见类似水平的随机染色体损失；2)与现有分析(Rehen等人，2001，2005)—致，通过SKY-PK平行分析的人淋巴细胞>97%为整倍体；3)此处和已有研究中也检测到了超倍体。此外，我们由hESCs得到的数据与鼠ESCs中观察到的各种非整倍性程度相一致(Eggan，2002)。与神经元分化抑制相关的染色体增加HESCs的关4建贡献在于它们分化成为普通，成熟细胞的最终能力。大量证据显示可对ES细胞的分化进行调节以获得神经元细胞富集群。在作为饲养细胞时，间质PA6细胞通过i秀导小鼠ES集落成为Tuj-l阳性促进神经分化并具有强神经突生长性(Kawasaki等人，2000)。为4企查非整〗咅体相对整4咅体细力包的分化潜力，对经过(非整倍体)或未经(整倍体)紫杉醇处理的哺乳动物ESCs;险查其在与PA6细胞共培养时分化成为神经元的能力。1周的分化后，55%的紫杉醇处理细月包增加了染色体(图3)。此外，在对细胞进行固定和针对tuj1染色后，紫杉醇处理培养中的神经元分化集落数量明显减少。这些结果显示不同的非整倍体水平和形式可改变i咅养ESCs的神经元分化潜能。讨论干细力包研究的长远目的在于开发衰竭'1"生疾病治疗的朝-疗法。为实现这一目的，需要得到即使在延续传代后依然显示可再生能力的HESC系。HESC系中染色体不稳定性的存在可以改变HESCs的生理功能。通过SKY结合对HESCs中非整倍体形式的定量可观察到许多不同形式的普遍非整倍体。哺乳动物ESCs中非整倍体的功能后果未曾得到过检查，其令人惊奇的是，至少非整倍体的两种形式(超倍体和亚倍体)并不等同超倍体而非亚倍体与分化抑制(至少对于神经元系)相关。与过去的研究中更为传统的细月包遗传学4支术不同，采用SKY在HESCs上鉴定非整倍体形式未曾得到广泛才艮导。SKY允许对染色体一致性和易位进行明确的鉴定，并曾广泛用于癌症的研究(Schrock等人，1996;Difilippantonio等人，2000)。除SKY夕卜，对中期分裂相值而非相对少量的样本分裂相值的定量(Amit等人,2000;Buzzard等人，2004;Draper等人，2004b;Mitalipova等人，2005)可在HESCs中鉴定令人惊奇的大量和多样的染色体增加和减少，并区分早代和晚代之间的一般区别(亚倍体相对超倍体)。这些才支术方法揭示了染色体不稳、定性并非必然在HESCs中形成非整倍体的保守模式。87代后，90%的H7细胞为非整倍体，且大部分细胞显示了染色体1和12的增加。在所有晚代哺乳动物ESCs中均观察到了染色体增加的趋势，特别是我们检测的HESCs(包括来自非NTH来源的HESCs)。HESC非整倍体涉及何种生理意义或治疗风险？非整倍体(特别是超倍体)曾与癌症形成相关联(Lengauer等人，1997,1998;Rajagopalan等人,2003;Lengauer和Wang,2004;Rajagopalan和Lengauer，2004)，至今仍是与"f吏用HESCs有关的一种可能的风险因子。其它的可能性包括可能干扰目标突变体的胚系传递核型异常(Liu等人，1997),并且是无法对成熟小鼠嵌合体所有组织获得贡献的主要原因(Longo等人，1997)。这些小鼠中的结果提示染色体不稳定性(特别是超倍体和易位)可能导致HESC多能性的减少。与该观点一致，超倍体ESCs细胞无法明显分化为神经元系。通过比较，亚倍体与分化的常^见水平相容。这与小鼠神经祖纟田胞(Rehen等人，2001;Kaushal等人，2003;Yang等人,2003;McConnell等人，2004,Kingsbury等人，2005)和小鼠ES细月包(Eggan等人，2002)中观察到的正常发育性非整倍体相呼应。在神经细胞中存在的亚倍体已显示与小鼠和人神经元的正常分化相容(Kaushal等人，2003;Rehen等人，2005)。在非整倍体神经元中还可能存在其它表型或功能性差异，然而这些差异可能4艮好地代表了在正常中才区系统中所，见察到的情况(Kingsbmy等人，2005)。综上所述，这些结果将超倍体区分为一种对哺乳动物ESCs的正常分化有害的基因型，尽管该种细胞可能具有其它有用的功能。通过比4交，亚倍体不干护C正常分化，且其存在似乎反映了发育阶段组织中正常观察到的情况。应当着重指出，这些区别是通过<吏用与现今多婆t临床细胞遗传学实-验室釆用的有限采样标准所不同的灵每丈:技术如SKY和染色体减少和增加定量所鉴定得到。最近据显示当前的NIH-资助的HESC系受到了Neu5Gc的污染(许多人具有针对它的循环抗体)(Martin等人，2005)。非生理非整倍体可代表在评估HESC系的治疗有用性时需考虑的另一种可变因素。同时对现有的和新型的HESC系导入常^见的、壽文感核型，通过基于HESC研究和治疗中所使用的染色体嵌合体来定义理想的细胞系，从而才是高成功4吏用HESCs的可能性。方法HESC培养H7HESCs(WiCellResearchInstitute,Inc.,Madison，WI)在有丝分裂失活(丝裂霉素C处理)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF,Specialtymedia,Phillipsburg，NJ)上于DMEM/F12Glutamax(Gibco，Carlsbad，CA),20%"敲除"血清替代品(Gibco),0.1mM非必需氨基酸(Gibco)，0.1mM卩-巯基乙醇(Gibco)和4ng/mLFGF-2(R&Dsystems,Minneapolis,MN)中进4亍i咅养。每5—6天以月交原酶/月夷蛋白酶(Gibco)对集落进行传代。将细胞与包括Oct4，SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81的未分化标记进行免疫反应。此夕卜，超过90%的集落显示出碱性磷酸酶活性。细胞对鼠胚胎标记SSEA-1和神经标记如嵌套蛋白(神经前体标记)；不成熟神经元标^己Tuj-1和Map2(a+b);成熟一申经元标记NeuN;星形细月包标i己GFAP和slOO-卩以及少突细胞标记04,GST兀和RIP呈免疫阴性。ESC的神经元分化将小鼠ESC与PA6纟田胞在分化条件(DMEM/F12Glutamax(Gibco，Carlsbad,CA),10。/o"敲除"血清替代品(Gibco)，O.lmM非必需氨基酸(Gibco)以及0.1mMp-巯基乙醇(Gibco))下共培养一周(Kawasaki等人，2002)。以紫杉醇(Sigma)在2.5nM的浓度下处J里细月包。免疫荧光染色免疫荧光染色参照已有描述(Gage等人，1995)采用a-卩-樣i管蛋白-III(Tuj國1;1/1000,Covance)进4亍。二抗乂人JacksonImmunoResearch购得。HESC的光谱核型分析(SKY):HESC染色体相可通过标准方案获取(Barch等人，1997;Rehen等人，2001)。参照生产商说明4吏用4',6-二脒基-2-苯基吲咮(DAPI)(Sigma)和SKYH-10试剂盒(AppliedSpectralImaging,Inc.,Carlsbad,CA)。数据分析对各样本，获取40个中期分裂相并以SKY分析，获取70个以DAPI复染色的中期分裂相进4亍非整4咅体定量。实施例中引用的参考文献AmitM，CarpenterMK，InokumaMS,ChiuCP，HarrisCP,WaknitzMA，Itskovitz誦EldorJ，ThomsonJA(2000)Clonallyderivedhumanembryonicstemcelllinesmaintainpluripotencyandproliferativepotentialforprolongedperiodsofculture.DevBiol227:271-278.BarchMJ，KnutsenT，SpurbeckJL(1997)TheAGTCytogeneticsLaboratoryManual.Lippincott:Philadelphia.BuzzardJJ,GoughNM,CrookJM,ColmanA(2004)KaryotypeofhumanEScellsduringextendedculture.NatBiotechnol22:381-382;authorreply382.CarpenterMK,RosierES，FiskGJ，BrandenbergerR,AresX，MiuraT,LuceroM,RaoMS(2004)Propertiesoffourhumanembryonicstemcelllinesmaintainedinafeeder-freeculturesystem.DevDyn229:243-258.ChengL,HammondH，YeZ,ZhanX，DravidG(2003)Humanadultmarrowcellssupportprolongedexpansionofhumanembryonicstemcellsinculture.StemCells21:131-142.DifilippantonioMJ,ZhuJ，ChenHT,MeffreE,NussenzweigMC,MaxEE,RiedT，NussenzweigA(2000)DNArepairproteinKu80suppresseschromosomalaberrationsandmalignanttransformation.Nature404:510-514.DraperJS,MooreHD,RubanLN,GokhalePJ,AndrewsPW(2004a)Cultureandcharacterizationofhumanembryonicstemcells.StemCellsDev13:325-336.DraperJS,SmithK,GokhaleP,MooreHD，MaltbyE,JohnsonJ,MeisnerL,ZwakaTP,ThomsonJA，AndrewsPW(2004b)Recurrentgainofchromosomes17qand12inculturedhumanembryonicstemcells.NatBiotechnol22:53-54.EgganK,RodeA,JentschI,SamuelC,HennekT,TintmpH，ZevnikB，ErwinJ，LoringJ，Jackson-GrusbyL,SpeicherMR,KuehnR，JaenischR(2002)Maleandfemalemicederivedfromthesameembryonicstemcellclonebytetraploidembryocomplementation.NatBiotechnol20:455-459.GageFH,CoatesPW，PalmerTD,KuhnHG，FisherLJ,SuhonenJO,PetersonDA，SuhrST，RayJ(1995)Survivalanddifferentiationofadultneuronalprogenitorcellstransplantedtotheadultbrain.ProcNatlAcadSciUSA92:11879-11883.KaushalD,ContosJJ,TreunerK,YangAH，KingsburyMA，RehenSK,McCo羅llMJ，OkabeM，BarlowC，ChunJ(2003)Alterationofgeneexpressionbychromosomelossinthepostnatalmousebrain.JNeurosci23:5599-5606.KawasakiH，MizusekiK，NishikawaS,KanekoS,KuwanaY,NakanishiS,NishikawaSI,SasaiY(2000)InductionofmidbraindopaminergicneuronsfromEScellsbystromalcell-derivedinducingactivity.Neuron28:31-40.KawasakiH,SuemoriH,MizusekiK,WatanabeK,UranoF,IchinoseH,HarutaM,TakahashiM,YoshikawaK,NishikawaS,NakatsujiN5SasaiY(2002)GenerationofdopaminergicneuronsandpigmentedepitheliafromprimateEScellsbystromalcell-derivedinducingactivity.ProcNatlAcadSciUSA99:1580-1585.Kingsbury等人,(2005)Aneuploidneuronsarefunctionallyactiveandintegratedintobraincircuitry.Proc.Natl.Acad.Sci.USAinpress.LakshmipathyU,PelachoB,SudoK,LinehanJL,CoucouvanisE，KaufmanDS,VerfaillieCM(2004)Efficienttmnsfectionofembryonicandadultstemcells.StemCells22:531-543.LengauerC,WangZ(2004)Fromspindl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