专利名称：：诱导植物胚囊染色体加倍选育三倍体的方法
技术领域：
：本发明涉及一种选育植物多倍体的方法，尤其涉及一种诱导植物胚囊(雌配子体)染色体加倍选育三倍体的方法，属于植物遗传育种领域。
背景技术：
：自然界植物多倍体的发生均来自于细胞核内染色体组的倍数变异，即体细胞分裂过程中偶然发生的染色体加倍以及减数分裂过程中产生未减数配子。人工诱导染色体加倍可采取秋水仙碱溶液等化学诱导方法以及异常温度等物理诱导方法。而人工获得多倍体的途径包括体细胞染色体加倍、不同倍性体间杂交、天然或人工未减数配子杂交、胚乳培养与细胞融合等。康向阳等(2004)对授粉一定时期的银腺杨(尸c^w/wa仿axPg/朋cMosfl)等雌花序进行秋水仙碱溶液处理,获得了一批白杨杂种三倍体植株，三倍体诱导最高得率达57.1%(康向阳、，张平冬，高鹏，等.秋水仙碱诱导白杨三倍体新途径的发现.北京林业大学学报，2004，26(1):1-4)，为三倍体诱导找到了一条新的途径。但是，该研究仅仅指出在当时的时空条件下，银腺杨授粉后24-36h施加秋水仙碱溶液持续处理24h可以获得三倍体，但其中存在诸多关键技术问题值得进一步研究。如白杨授粉后24-36h的雌配子形成与发育时期究竟处于什么阶段？在雌配子形成与发育的哪一个时期处理是三倍体的最佳诱导时期？如何在实际操作中，针对不同植物生物学特点判别诱导三倍体的有效处理时期？此外，因大多植物雌蕊柱头的可授期比较长，不同操作人员对雌蕊柱头是否具有可授性的判断标准不同，导致授粉有早有迟，包括银腺杨在内的一些植物在具体杂交授粉时甚至可以相差l-2d，这种没有一个明确的处理起始参照点，而仅单纯以授粉后24-36h等作为有效处理时期确定的标准也是不符合实际的，存在失败的风险，也需要从技术层面上有针对性地加以解决。由于上述技术问题未能得到有效解决，使该方法的应用受到限制。同样是对银腺杨施加同样的技术处理流程，具体操作人员不同、材料的取样时间不同或培养的环境条件不同时，其处理结果存在显著差异，表明仅仅通过时间控制的风险性较大，更不可能拓展到杨属植物及其以外的植物种。因此，解决授粉后施加秋水仙碱溶液处理诱导植物三倍体的细胞学时期以及相关技术问题，形成有效的三倍体诱导技术支撑体系，对于实现授粉后施加秋水仙碱处理诱导银腺杨三倍体的稳定性和高效率，以及将该方法引入其它杨树或其它植物的三倍体诱导等具有重要的实际价值。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种准确性、稳定性和效率更高的选育植物三倍体的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种诱导植物胚囊染色体加倍选育植物三倍体的方法，包括对发育至适宜时期的植物雌花序进行授粉，对授粉后一定时期的雌花施加秋水仙碱溶液进行处理，用清水冲洗解除处理，果序管理，收获种子，播种育苗，染色体检测等步骤，其中，所述的授粉是指当植物雌花序处于最佳授粉时期进行授粉；所述的处理是指当植物雌配子处于二核与四核胚囊占多数的时期内(更优选为四核胚囊占多数的时期内)，施加0.10.6%的秋水仙碱溶液处理雌花6-30小时。上述选育植物三倍体的方法，所述的植物优选为杨属(尸opw/M)植物。作为本发明一种优选的实施方案，具体如下一种诱导杨树胚囊染色体加倍选育三倍体的方法，包括对发育至适宜时期的杨树雌花序进行授粉，对授粉后一定时期的雌花施加秋水仙碱溶液进行处理，用清水冲洗解除处理，果序管理，收获种子，播种育苗，染色体检测等步骤，其中，所述的授粉是当杨树雌花序符合下述条件时进行授粉在体视显微镜下观察雌蕊柱头表面充分展开，乳突细胞发达；用联苯胺-过氧化氢染色后柱头变蓝并有大量气泡产生；所述的处理是指当杨树雌配子的胚囊发育处于二核与四核胚囊占多数的时期(即距最佳授粉时期时授粉后1296h)内，施加0.10.6%的秋水仙碱溶液处理雌花6-30小时。上述方法中，优选的，所述的处理是指当杨树雌配子的胚囊发育处于四核胚囊为主的时期(即距最佳授粉时期时授粉后5466h)内，施加0.30.5%的秋水仙碱溶液处理雌花6-30小时。其中，所述的四核胚囊为主是指四核胚囊的数量高于单核、二核或八核胚囊的数量。所述的杨树母本优选为毛新杨(尸opw/wtomewtoMfxP^Z/eawa)、银腺杨(i^a〃axPg/(3"c/w/ora)、银毛杨(i3.fl/6ax户,omewtosa)、响叶杨(/!a^few/;70i/wMazim)、小青杨(■P/weMi/o-w'mom'/Kitag.)或哲弓l3号杨(P/we"c/os/mom7xJR-w/gravar.lica)，更优选是哲弓l3号杨(/^wei^/o-w'附o""xp"/gravar.lica)为杨丰对母本；所述的杨树父本优选以毛白杨(Pto附e"to^)、口向卩十杨(Mazim)、北京杨(Ppjra/mV/flfcx/!ca^ay(2"acv.Beijingensis，)、小青杨(/^m^/。-Wm婦YKitag.)等为父本，更优选为北京丰汤(i^yra附zV/afe:x/^c"Aa少""acv.Beijingensis，)为杨丰对父本。对于如何确定植物雌花序是否处于最佳授粉时期，本领域普通技术人员可通过观察柱头的形态再结合一些本领域的常规方法从而可以判定目标植物的雌花序是否处于最佳授粉时期。至于如何确定植物雌配子的胚囊发育是否处于单核胚囊向八核成熟胚囊发育的时期或四核胚囊占多数的时期内，可通过常规切片等方法进行判定或确认，这些方法或技术均为本领域人员所习知或熟练掌握。本发明选育植物三倍体的方法明确设置以最佳授粉时期为实施诱导胚囊染色体加倍处理的起始参照点，在柱头发育到最佳授粉时期时，适时授粉，并进一步确定雌花发育至四核胚囊距最佳授粉时期的时间差，更为精确的控制胚囊染色体加倍的处理时间，可增加授粉后施加秋水仙碱处理诱导植物胚囊染色体加倍的准确性和稳定性，提高三倍体的诱导效率，并且还可以节约处理用的化学试剂和实验材料等。下面通过实施例对本发明作进一步说明。应当指出，这些实施例仅仅是本发明的例证，不应理解为对本发明的限制。具体实施方式实施例用毛新杨(尸o—w,麵e"toyafxPZ)fl〃efl"fl)、银腺杨(尸.fl〃"xpg/朋(/w/o(3)、银毛杨(户.fl/6ax_pto附ewtora)、响叶杨(_Pa^/e"//od"Mazim)、小青杨(P/wei/c/o-Wmom./Kitag.)、哲弓|3号杨(Z^wewJo-w'mo""xPm'gravar.lica)等为母本，以毛白杨(/^omewtosa)、卩向叶杨Mazim)、(北京杨(/!/jram/i/afcx/lca^/a[y朋(2cv.Beijingensis，)、小青杨(尸.戸eiw/o-Wmom'ZKitag.)等为父本，采用对处于最佳授粉时期的雌花序进行授粉后，通过常规切片观察雌配子的胚囊发育，雌配子的胚囊为二核胚囊与四核胚囊占多数的时期内(距最佳授粉时期时授粉后1296h)用0.30.5%秋水仙碱溶液浸泡处理雌花序630h，三倍体得率介于30%70%之间。以哲引3号杨x北京杨为例(表1)，哲引3号杨雌花序的最佳授粉时期为体视显微镜下观察雌蕊柱头表面充分展开，乳突细胞发达，用联苯胺-过氧化氢染色后柱头变蓝并有大量气泡产生等；在哲引3号杨达到最佳授粉时期时授粉，授粉后通过常规切片观察雌配子的胚囊发育，当雌配子的胚囊位于二核胚囊与四核胚囊的时期内(2496h)施加0.30.5%秋水仙碱溶液浸泡处理雌花序630h;由于哲引3号杨胚囊发育的不同步性，实验各处理均能得到了一定数量的三倍体植株，其中尤以距最佳授粉时期授粉后四核胚囊时期为主(距最佳授粉时期时授粉之后5466h)时施加处理诱导三倍体的效果最好，约占获得的三倍体总数的2/3，三倍体得率最高达66.7%。表1授粉后施加秋水仙碱处理诱导哲引3号杨x北京杨三倍体及其与胚囊发育关系统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1、一种诱导植物胚囊染色体加倍选育植物三倍体的方法，包括对发育至适宜时期的植物雌花序进行授粉，对授粉后一定时期的雌花施加秋水仙碱溶液进行处理，用清水冲洗解除处理，果序管理，收获种子，播种育苗，染色体检测等步骤，其特征在于所述的授粉是指当植物雌花序处于最佳授粉时期进行授粉；所述的处理是指当植物雌配子发育处于二核与四核胚囊占多数的时期内，施加0.1～0.6％的秋水仙碱溶液处理雌花6-30小时。2、按照权利要求1的方法，其特征在于所述的处理是指当植物雌配子的发育处于四核胚囊占多数的时期内，施加0.30.5%的秋水仙碱溶液处理雌花6-30小时。3、按照权利要求1的方法，其特征在于所述的植物是杨属(Popw/w)植物。4、一种诱导杨树胚囊染色体加倍选育三倍体的方法，包括对发育至适宜时期的杨树雌花序进行授粉，对授粉后一定时期的雌花施加秋水仙碱溶液进行处理，用清水冲洗解除处理，果序管理，收获种子，播种育苗，染色体检测等步骤，其特征在于所述的授粉是当杨树雌花序符合下述条件时进行授粉在体视显微镜下观察雌蕊柱头表面充分展开，乳突细胞发达；用联苯胺-过氧化氢染色后柱头变蓝并有大量气泡产生；所述的处理是指杨树雌配子的胚囊发育处于二核与四核胚囊占多数的时期内，施加0.10.6%的秋水仙碱溶液处理雌花6-30小时。5、按照权利要求4的方法，其特征在于所述的处理是指当杨树雌配子发育处于四核胚囊占多数的时期内，施加0.30.5%的秋水仙碱溶液处理雌花6-30小时。6、按照权利要求4的方法，其特征在于所述的杨树母本选自毛新杨(Po/^/mZ謹ewtosflxP6a〃e朋a)、银腺杨(尸a〃flx尸g/a"^/w/oya)、银毛杨(i3.a肠xptomewtoya)、响叶杨(Pflcfew/pod"Mazim)、小青杨(P/wet^/o-57,mo""Kitag.)或哲弓l3号杨；所述的杨树父本选自毛白杨(i^ome"towz)、响叶杨(i^tfe"/;(^"Mazim)、北京杨(i^pyraim/c/a/^x^ca^a_yawacv.Beijingensis，)或,J、青丰汤(/^wei^/o-w'wzcwzYKitag.)。7、按照权利要求6的方法，其特征在于所述的杨树母本为哲引3号杨(^P/wet^/cKS7'附o肌7xi^var.lica)，丰汤禾对父本是;l匕京丰汤(/^pyra^mWafo1x_p.cfl^a_yawacv.Beijingensis，)。全文摘要本发明公开了一种诱导植物胚囊染色体加倍选育植物三倍体的方法，包括对植物雌花序授粉，用秋水仙碱进行处理，解除处理，果序管理，收获种子，播种育苗，染色体检测等步骤，其中，所述的授粉是当植物雌花序处于最佳授粉时期进行授粉；所述的处理是植物雌配子的胚囊发育处于由单核向八核发育的时期内，施加秋水仙碱处理雌花。本发明方法明确设置以最佳授粉时期为实施诱导胚囊染色体加倍处理的起始参照点，在柱头发育到最佳授粉时期时适时授粉，并进一步确定雌花发育至四核胚囊距最佳授粉时期的时间差，可以精确的控制胚囊染色体加倍的处理时间，从而增加胚囊染色体加倍的准确性和稳定性，提高三倍体的诱导效率，节约化学试剂和实验材料。文档编号A01H1/06GK101147465SQ20071006471公开日2008年3月26日申请日期2007年3月23日优先权日2007年3月23日发明者康向阳,张平冬,李艳华,君王申请人:北京林业大学