专利名称：利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒的方法
技术领域：
本发明"利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的方法"属于生物工程 领域，利用该方法可以有效的脱除草莓轻型黄边病毒。
(二)
背景技术：
1超低温脱除病毒的原理
超低温脱除植物病毒法是基于超低温保存结合组织培养和病毒检测技术达到脱毒的 目的。超低温保存与茎尖培养相结合是植物脱毒和保存茎尖的一种有效的方法。含有病 毒的顶端细胞较大，液泡也较大，液泡中含有的水分也较多，在超低温保存过程中易被 形成的冰晶破坏致死,而增殖速度较快的分生组织含的水分少，胞质浓，抗冻性强，不易 被冻死。光学显微镜观察显示，液氮中的超低温能杀死含较大液泡的细胞，而保存液泡 小的顶端分生组织细胞(Brison M , Boucaud M T ,Pierronnet A ,Dosba F . Effect of cryopreservation on the sanitary state of a cv Prunus rootstock exprimentally contaminated w他plum pox potyvirus[J ]. Plant Sci ,2002 ，123 :189 - 196.)。这样超低温处理过的植株再 生后可能是无病毒的。 2超低温的生物学效用
一般认为超低温的生物学效应主要用于保存种质资源，对象包括植物、动物和微生 物等。
超低温保存是指在-80 。C以下的环境条件中进行种质资源保存的一套生物学技术。 超低温保存常用的冷源有干冰(-79'C)、深冷冰箱、液氮(-196X:)等。在液氮条件下，活 细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，生物处于相对稳定的生物学状态。被保存材 料可以大大减少甚至终止代谢衰老过程，从而达到长期保存种质的目的。
超低温保存种质资源已经在果树上有了重要的应用，利用超低温保存种质资源的材 料可以是传统的种子、花粉、休眠枝条、原生质体、茎尖分生组织和芽等材料,植物茎尖 己在超低温保存作为主要的材料。另外，利用超低温保存种质资源的方法也已经较为成 熟。
3超低温脱除病毒病在植物中的应用
1997年，BrisonM等用超低温结合茎尖离体培养，成功的去除了李属根状茎上的李 豆病毒，脱毒率达到50% ，比单纯的茎尖培养的脱毒率20%多了近2倍(BrisonM, Boucaud M T ，Pierronnet A ,Dosba F . Effect of cryopreservation on the sanitary state of a cv Prunus rootstock exprimentally contaminated with plum pox potyvirus[J ]. Plant Sci ,2002 ,123 :189- 196.)。随后，HelliotB等人用超低温成功的去除了黄瓜花叶病毒(CMV)和香蕉条斑病毒(BSV)，脱毒率分别为30%和90% ( Helliot B,Panis B,Poumary Y,Swennen R,Lepoivre P,Frison E. Cryopreservation for the elimination of cucumber mosaic and banana streak viruses from banana (Musa spp.) [J] .Plant Cell
Rep .2002 .20:1117 - 1122) 。 Wang等人用包埋玻璃化超低温法成功的去除了葡萄病毒 A(GVA)，成功率高达97%，而单独的分生组织培养脱毒率仅为12% (WangQ,Mawassi M,li P,Gafny R,Sela I，Tanne E. Elimination of grapevine virus A ( GVA) by cryopreservation of in vi加-grown shoot tips of v他由(/fera L[J ] . Plant Sci ，2003 ,165 :321 - 327.)。
4超低温脱除植物病毒法存在的问题和前景展望
超低温脱毒法与茎尖培养脱毒法和热处理脱毒法等传统的脱毒法相比，不仅脱毒率 很高，而且简单易行，便于操作，更不需要昂贵的仪器。随着理论和技术的不断发展和 完善，低温疗法在植物病毒防治方面将发挥重要作用。但该方法的发展历史还很短，许 多问题，如具体材料适用的低温处理方法、低温引起的遗传和表观遗传现象等，尚需进 一步研究，尤其是对更多的植物材料的脱毒效果将是今后研究的重点。
发明内容
技术问题
因为植物病毒具有分布广、防治难、繁殖快等特点，被人们称为植物"癌症"。因 此，解决草莓病毒病的问题已经成为今后研究的重点。本发明的目的是针对目前传统的 脱毒方法在植物病毒脱毒方面脱毒率较低和操作过于烦琐的现状，研究利用超低温脱除 植物病毒的方法。从而为草莓无毒苗的示范推广及其产业化提供强有力的技术支持。 技术方案
利用一种利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒(SMYEV)方法，其特征在于 1)草莓轻型黄边病毒的检测
以草莓栽培品种'明宝'为材料，参考王国平等(中国果树病毒病原色图谱[M].北京: 金盾出版社.2000)描述的草莓轻型黄边病症状，在田间寻找叶片边缘失绿，植株矮縮，叶 片黄化、巻曲的草莓植株。对所取的植株进行总RNA提取，反转录为cDNA，根据的SMYEV 的外壳蛋白序列(登录号D12517)和ndhB基因序列(登录号AJ316582)，参考Thompson 等的研究设计引物(Thompson J R, Wetzel S,Klepks M.M, Va§kovd D, Schoen C.D,Spak J,Jelkmann W.Multiplex RT國PCR detection of four aphid-borne strawberry viruses in Fragfl"'a 5/ / .in combination with a plant mRNA specific internal control[J].Journal of Virological Methods,2003,lll(2):85-93.)，
W^B的引物为
PI: 5'-GGACTCCTGACGTATACGAAGGATC-3' P2: 5'-AAACAACGCTTGTAAGGAGTCC-3'SMYEV的引物为
Yl: 5'-GTGTGCTCAATCCAGCCAG-3'
Y2: 5'-CATGGCACTCATTGGAGCTGGG-3' 利用结合内标的多重RT-PCR进行SMYEV的检测，20iliL的多重RT-PCR反应体系包含 4nL 10xPCR Buffer, 1.5腿ol.L-1 MgCl2， 0.2 mmol丄.1 dNTP，引物P1、 P2、 Yl、 Y2 的浓度均为O.l mmol'L'1， 0.5UrT叫酶;反应程序为94。C， 2min; 94°C， 30s; 57°C， 40s; 66°C， 2min; 35个循环，72"延伸5min;最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物， 部分检测结果如图l，检测到了大约270bp的目的片段，目的片段回收按照琼脂糖凝胶回 收试剂盒说明书进行(大连宝生物工程公司)，回收片段与PMD19-T载体(TaKaRa)连接， 然后转化大肠杆菌DH5oc感受态细胞。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行培养，PCR鉴 定阳性克隆，测序由上海博亚生物技术有限公司完成。登录NCBI，用BLAST分析软件， 与GenBank登录的SMYEV分离物CHl (德国)(登录号为AJ577337)和sy01 (中国沈阳) (登录号为AY955375)序列进行比对，同源性均为98%，证明为SMYEV的特异片段。 同时还扩增到了570bp的ndh B基因的目的片段。
2) 草莓轻型黄边病毒的脱除
将含有SMYEV的植株拨取茎尖，经消毒杀菌后接到初代培养基上，初代培养基为 MS加入0.5mg/L 6-BA、 0.1mg/LNAA、 0.088 mol/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉，pH=5.8。每四 周继代一次；取继代5次的组培苗，取约2mm左右的茎尖，接种于MS加入0.5mol/L蔗糖和 5.0g/L琼脂粉的培养基(pH=5.8)上预培养3天，其中培养基不加任何激素。培养条件 25°C，暗培养。取预培养过的茎尖，放入装载溶液中，装载溶液为MS加入2mol/L甘油和 0.75mol/L蔗糖，pH=5.8，处理温度为25'C，处理时间为60min，装载过程中，发现茎尖 随着时间的延长，慢慢的沉到液体底部。将装载过的茎尖转移到PVS-2溶液中，PVS-2溶 液为MS加入质量体积比30。/。(W/V)甘油、质量体积比15。/。(W/V)聚乙二醇、质量体积 比15。/。(W/V) 二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖，pH=5.8，处理温度为0。C，处理时间为120min。 然后转入10ml冻存管中，直接投入液氮中处理60min (冰冻速率为20(TC/min)。从液氮 中取出冻存管，快速转移到40'C (解冻速率为200。C/min)的水浴锅中，处理2min。然后 取出茎尖放入MS加入1.2mol/L的蔗糖溶液(pH=5.8)中20min，直到茎尖漂浮在液体表 面。将处理过的茎尖转入增殖培养基中，暗培养l周后进行光照培养。 一个月后统计存活 率，并将再生株系转移到增殖培养基上进行扩繁，增殖培养基同初代培养基。
3) 再生株系的病毒检测
利用结合内标的多重RT-PCR技术进行再生株系的SMYEV检测(图2)，具体方法如 1)所述，获得脱除草莓轻型黄边病毒SMYEV的株系。 有益效果
该发明与茎尖培养脱毒法和热处理脱毒法等传统的脱毒法相比，不仅脱毒率很高，而且简单易行，便于操作，更不需要昂贵的仪器。
该发明大大提高了草莓轻型黄边病毒的脱毒率，具有重要的科研和生产意义。 本发明首次将超低温脱毒法用于脱除草莓轻型黄边病毒，大大提高了脱毒效率。草
莓茎尖的存活率为76%，而草莓轻型黄边病毒的脱除率为95%。
四
图1.结合内标的多重RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒；
M: Marker;l.:未加反转录酶对照;2:草莓健康的指示植物UC5;3-6:感染SMYEV的草莓植 株
图2.超低温处理后再生株系的SMYEV的多重RT-PCR检测；
M:DNAMarker; l:无模板对照；2:健康的草莓指示植物UC5; 3:原带病毒的草莓植株对照； 4-6:超低温处理后的草莓株系。
图3.不同蔗糖浓度的预培养对草莓茎尖存活率的影响；
图4.装载时间对草莓茎尖存活率的影响；
图5.玻璃化处理时间对草莓茎尖存活率的影响。
五具体实施例方式
1)以草莓栽培品种'明宝，为材料，参考王国平等(中国果树病毒病原色图銜M].北京:金盾 出版社.2000)描述的草莓轻型黄边病症状，在田间寻找叶片边缘失绿，植株矮縮，叶片黄 化、巻曲的草莓植株。对所取的植株进行总RNA提取，反转录为cDNA，根据的SMYEV 的外壳蛋白序列(登录号D12517)和ndhB基因序列(登录号AJ316582)，参考Thompson 等的研究设计引物(Thompson J R， Wetzel S,Klepks M.M,Va§kov6 D, Schoen C.D,Spak J,Jelkmann W.Multiplex RT-PCR detection of four aphid-borne strawberry viruses in Fragar/ar s/ / .in combination with a plant mRNA specific internal control [J] .Journal of Virological Methods,2003,lll(2):85-93.)。 wWB的引物为
P1: 5 '-GGACTCCTGACGTATACGAAGGATC-3'
P2: 5'-AAACAACGCTTGTAAGGAGTCC-3' SMYEV的引物为
Yl: 5'-GTGTGCTCAATCCAGCCAG-3'
Y2: 5'-CATGGCACTCATTGGAGCTGGG-3' 利用结合内标的多重RT-PCR进行SMYEV的检测，20pL的多重RT-PCR反应体系包含 4pL 10xPCR Buffer, 1.5腿ol.L-1 MgCl2， 0.2腿ol.L-1 dNTP，引物P1、 P2、 Yl、 Y2 的浓度均为O.l mmol七-1， 0.5UrTaq酶;反应程序为94。C， 2min; 94°C， 30s; 57°C， 40s; 66°C， 2min; 35个循环，72'C延伸5min;最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物， 部分检测结果如图l，扩增到了大约270bp的目的片段，目的片段回收按照琼脂糖凝胶回 收试剂盒说明书进行(大连宝生物工程公司)，回收片段与PMD19-T载体(TaKaRa)连接，然后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行培养，PCR鉴 定阳性克隆，测序由上海博亚生物技术有限公司完成。登录NCBI，用BLAST分析软件， 与GenBank登录的SMYEV分离物CHl (德国)(登录号为AJ577337)和sy01 (中国沈阳) (登录号为AY955375)序列进行比对，同源性均为98%，证明为SMYEV的特异片段。 同时还扩增到了570bp的ndhB基因的目的片段。将含有SMYEV的植株拨取茎尖，经消 毒杀菌后接到基本培养基上，初代培养基为MS加入0.5mg/L 6-BA、 0.1mg/LNAA、 0.088 mol/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉，pH=5.8，每四周继代一次。
2) 确定预培养最佳处理的蔗糖浓度
取继代5次的组培苗，拨取约2mm左右的茎尖，接种于MS加入蔗糖和5.0g/L琼脂粉 (pH=5.8)的培养基上预培养3天，蔗糖浓度设不同浓度，分别为0.25mol/L、 0.5mol/L、 0.75mol/L、 1.0mol/L其中培养基不加任何激素。培养条件25°C，暗培养。超低温处理 后，统计成活率，试验中每个处理重复3次，每次重复取21个茎尖。通过SPSS软件对实验 数据进行统计分析。
结果
预培养对提高植物超低温处理后的存活率有很大的影响。本实验以MS为基本培养基 附加不同浓度的蔗糖进行预培养，从图3可以看出，随着蔗糖浓度的升高，超低温处理后， 茎尖的存活率先升高后降低。当蔗糖浓度为0.5mol/L时，超低温处理后茎尖的存活率为 76%。当蔗糖浓度为0.75mol/L和1.0mol/L时，超低温处理后茎尖的存活率显著降低，分别 为27%和4.8%。其原因可能与蔗糖浓度过低时细胞脱水不彻底，过高时又引起渗透胁迫 有关。
3) 确定最佳装载时间
为了降低植物组织及草莓茎尖的细胞含水量，从而可以避免由于渗透压变化过大对 植物细胞造成伤害，本试验在用PVS-2进行快速脱水前，先用高浓度的装载液进行处理， 装载液为MS加入2mol/L甘油和0.75mol/L蔗糖pH=5.8， 25。C处理。结果表明利用装 载液处理60min后，茎尖经过超低温处理的存活率最高，而不处理的茎尖的存活率仅为 34.9% (图4)。另外，在装载液处理过程中发现，装载液处理一段时间后，草莓的茎尖 会沉于溶液的底部。
4) 确定最佳的玻璃化处理时间
PVS-2处理时间是影响超低温试验成败的关键因素。另外，(TC条件下处理可以减轻 冰冻保护剂对材料的毒害。本试验中将预培养和装载处理后的草莓茎尖在(TC的PVS2溶 液中处理分别为Omin、 60min、 120min、 180 min和240 min。试验结果表明(图5)，未 经PVS-2溶液处理的草莓茎尖，经超低温处理后，茎尖的存活率为0。而经过60min、 120min、 180min和240min处理的，草莓茎尖均有存活，其中处理120min的存活率最高，处理时间延长，存活率又迅速下降。其原因是PVS-2溶液中的二甲基亚枫的毒害和过度脱
水对茎尖的伤害。
5)确定脱毒因素
在确定最佳蔗糖浓度的预培养、最佳的装载时间和玻璃化处理时间的基础上，确定 脱毒因素。从表l可以看出，在超低温处理及液氮处理之前，茎尖的存活率均为100%， 通过RT-PCR技术对存活株系进行SMYEV的检测，脱毒率为0%。通过液氮处理之后，茎 尖的存活率下降到76%左右，SMYEV的脱除率可达到95。/。。所以SMYEV的脱除发生在液 氮处理过程中，利用超低温途径可以成功的脱除草莓轻型黄边病毒(SMYEV)。
表1不同处理步骤对存活率及脱毒率的影响
处理存活率％脱毒率％
对照(茎尖培养)1000
预培养1000
玻璃化处理1000
超低温处理76±495±2
6)超低温处理茎尖后的形态发生和植株再生
从液氮中取出冻存管，快速转移到40'C (解冻速率为20(TC/min)的水浴锅中，处理 2min。然后取出茎尖放入MS加入1.2mol/L的蔗糖溶液中20min，在冲洗过程中发现，茎 尖慢慢的浮于液体表面。然后将茎尖接种到再生培养基中，再生培养基为MS加入0.5mg/L 6-BA、 0.1mg/LNAA、 0.088 mol/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉，pH=5.8。暗培养l周后进行光照 培养。暗培养后，草莓茎尖全部褐化，随着培养时间的延长，茎尖长出再生芽，形成再 生植株。
7)再生株系的病毒检测
利用结合内标的多重RT-PCR技术进行草莓再生株系的SMYEV检测，具体方法如 1)所述，部分检测结果如图2，获得脱除草莓轻型黄边病毒SMYEV的植株。序列表
<110>南京农业大学
<120>利用超低温技术脱P
<130>说明书
<140>00
<141>2008-10-18
<160>4
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>ndhB的引物Pl
<222>(1)..(25)
<223>
<400>1
ggactcctga cgtatacgaa gg<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>ndhB的弓l物P2
<222>(" ■(22)
<223>
<400>2
aaacaacgct tgtaaggagt cc<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>SMYEV的引物Y1
<222>(1)..(19)
<223>
<400>3
gtgtgctcaa tccagccag<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>SMYEV的引物Y2
<222>(" (22)
<223>
<400>4
25
22
19
catggcactc attggagctg gg 2权利要求
1、利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒SMYEV的方法，其基本特征在于1)以草莓栽培品种‘明宝’为材料，参考王国平《中国果树病毒病原色图谱》，金盾出版社，2000，描述的草莓轻型黄边病症状，在田间寻找叶片边缘失绿，植株矮缩，叶片黄化、卷曲的草莓植株，对所取的植株进行总RNA提取，反转录为cDNA，根据的登录号D12517的SMYEV的外壳蛋白序列和登录号AJ316582的ndhB基因序列，参考Thompson等的研究设计引物，ndhB的引物为P15＇-GGACTCCTGACGTATACGAAGGATC-3＇P25＇-AAACAACGCTTGTAAGGAGTCC-3＇SMYEV的引物为Y15＇-GTGTGCTCAATCCAGCCAG-3＇Y25＇-CATGGCACTCATTGGAGCTGGG-3＇利用结合内标的多重RT-PCR进行SMYEV的检测，20μL的多重RT-PCR反应体系包含4μL 10×PCRBuffer，1.5mmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTP，引物P1、P2、Y1、Y2的浓度均为0.1mmol·L-1，0.5UrTaq酶；反应程序为94℃，2min；94℃，30s；57℃，40s；66℃，2min；35个循环，72℃延伸5min；最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增到了大约270bp的目的片段，目的片段回收按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行，回收片段与PMD19-T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行培养，PCR鉴定阳性克隆，测序，登录NCBI，用BLAST分析软件，与GenBank登录号为AJ577337的SMYEV分离物CH1和登录号为AY955375的sy01序列进行比对，同源性均为98％，证明为SMYEV的特异片段，同时还扩增到了大约570bp的ndhB基因的目的片段；2)将含有SMYEV的植株拨取茎尖，经消毒杀菌后接到初代培养基上，初代培养基为MS加入0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、0.088mol/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉，pH＝5.8，每四周继代一次，取继代5次的组培苗，取约2mm左右的茎尖，接种于MS加入0.5mol/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉、pH＝5.8的培养基上预培养3天，培养条件25℃，暗培养；取预培养过的茎尖，放入装载溶液中，装载液为MS加入2mol/L甘油和0.75mol/L蔗糖，pH＝5.8，处理温度为25℃，处理时间为60min；装载过程中，发现茎尖随着时间的延长，慢慢的沉到液体底部，将装载过的茎尖转移到PVS-2溶液中，PVS-2溶液为MS加入质量体积比30％甘油、质量体积比15％聚乙二醇、质量体积比15％二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖，pH＝5.8，处理温度为0℃，处理时间为120min；然后转入10ml冻存管中，直接投入液氮中处理60min，冰冻速率为200℃/min，从液氮中取出冻存管，快速转移到40℃、解冻速率为200℃/min的水浴锅中，处理2min；然后取出茎尖放入MS加入1.2mol/L的蔗糖溶液中约20min，直到茎尖漂浮在液体表面，将处理过的茎尖转入增殖培养基中，暗培养1周后进行光照培养，一个月后统计存活率，并将再生株系转移到增殖培养基上进行扩繁，增殖培养基同初代培养基；3)利用结合内标的多重RT-PCR技术进行草莓再生株系的SMYEV检测，具体方法如步骤1)所述，获得脱除草莓轻型黄边病毒SMYEV的株系。
全文摘要
本发明涉及“超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的方法”，属于生物工程领域。在病毒脱除过程中，预培养蔗糖浓度为0.5mol/L，处理3d；装载处理为25℃，60min；玻璃化处理为0℃，120min；液氮处理60min后，进行40℃水浴2min，草莓茎尖的存活率为76％，草莓轻型黄边病毒的脱毒率达到95％。只有通过液氮处理才可以脱除该病毒，液氮处理前的玻璃化处理脱毒率为0％。与茎尖培养脱毒法和热处理脱毒法等传统的脱毒法相比，超低温脱毒法不仅脱毒率很高，而且简单易行，便于操作，更不需要昂贵的仪器。从而为草莓无毒苗的示范推广及其产业化提供强有力的技术支持。
文档编号A01H4/00GK101418350SQ20081015521
公开日2009年4月29日 申请日期2008年10月28日 优先权日2008年10月28日
发明者乔玉山, 张计育, 徐长宝, 渠慎春, 镇 章, 蔡斌华, 陶建敏, 高志红 申请人:南京农业大学