专利名称：鹅观草属植物无菌萌发方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及鹅观草属植物种子无菌萌发与培育方法。
技术背景鹅观草属/toe卵eha是C. Koch于1848年以高加索鹅观草y . caucaw'ca C. Koch为 模式种建立的，是小麦族中最大的属。全世界约有130余种。鹅观草属是一类具温寒特 性的植物，具有广布性，集中在亚洲、欧洲和北美洲，其东界可到达北美北部的巴芬岛， 西界可伸至大西洋海滨，北界已濒临北冰洋沿岸，南界扩展到了我国的滇、桂、台地区 及美国西部的落基山脉。鹅观草属在我国约有70余种，从海平面之下-30米的吐鲁番盆 地到海拔5500米的喜马拉雅山脊均有分布(西北植物学报，2002年22 (4)，鹅观草 属的地理分布，蔡联炳)，个别种类能在比较极端的环境下生存，因此，鹅观草属植物 具有很强的适应能力，加之该属植物营养丰富，质地柔软，茎叶茂盛，适口性好，且具 有多花多粒、耐湿等特性，是各类家畜夏秋放牧，冬春补饲的优良牧草。万永芳等用单 花和多花注射接种法对小麦近缘野生植物16个属80个种276份材料进行了抗赤霉病鉴 定和分析，结果表明鹅观草属对赤霉病既高抗侵入又高抗扩展，抗病性显著最强，该实 验证明鹅观草属植物具有抗赤霉病特性，在随后的研究中，很多作物育种工作者将鹅观 草属植物作为远缘杂交母本以期获得抗赤霉病杂种，近年來，随着染色体工程技术的发 展， 一些鹅观草属植物的优良基因巳成功的导入小麦和大麦中，为麦类作物的改良提供 了优质的中间材料。南京农业大学利用鹅观草、纤毛鹅观草和小麦杂交合成了普通小麦 一鹅观草二体附加系、普通小麦一纤毛鹅观草二体附加系。鹅观草属植物还具有生态功 能，它可以涵养水源，防风固沙，调节小气候，在改善生态环境中起着重要作用(草业 科学，2007， 24巻，4期，小麦族鹅观草属植物研究进展，肖海峻)。总之，无论从饲 用价值、育种价值还是从生态价值考虑，鹅观草属植物都是表现优良的物种，值得引起 人们的重视。在此研究背景下，发明人发现鹅观草属植物种子粒小，营养成分储藏少，休眠度高， 发芽不一致，若想得到整齐一致的无菌苗存在很多困难。目甜，无菌播种、萌发技术已经成功应用于花卉、药材等根茎类植物中，若将现有技术应用在鹅观草属植物中存在很 多不足首先，由于鹅观草属植物种皮结构致密，难点之一就是消毒，按照己有的方法如已经获得专利的兰属植物种子无菌萌发与植株培育方法，专利号200510010764;大 豆转基因中子消毒处理方法，专利号02150780.5，用以上消毒方法都不适合鹅观草属 植物，不是种子消毒不彻底，大量材料被污染，就是消毒剂处理时间太长，会对种子造 成毒害作用，出现畸形苗；其次不能解决萌发不一致的问题，在试验中发现接入到培养 基的种子有好多不萌发，无法得到整齐一致的无菌苗。 发明内容本发明的目的是利用无菌播种技术，获得整齐一致的鹅观草属植物无菌苗材料。本发明目的实现由以下技术方案完成 生产方法的歩骤如下1) 种子预处理选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15-20min后放置在 2-4'C条件下用无菌水浸种12-30h;之后，2) 外植体消毒将上述经过预处理的种子剥掉内外稃，用75%酒精消毒25—40秒， 之后，用无菌水清洗3次，再用O. 1%升汞溶液消毒1--4分钟，再用无菌水清洗5次，再用 无菌滤纸吸干种子表面的水分，随之接种到固体培养基，培养基为MS或1/2MS培养基； 之后，3) 先在暗箱培养，待芽长至卜2厘米时，改用光照培养，之后，4) 壮苗培养待苗长至8-10厘米高时，转置1/2MS培养基，使苗高保持在10土2cm。 在歩骤l)中将选好的种子先用自来水冲洗15-20min后，然后在4"C条件下用无菌水浸种24h;在歩骤2)中，用75%酒精消毒30秒，之后，再用O. 1%升汞溶液消毒3分钟，之 后，在接种到固体培养基接种时种胚朝上方向，种胚面裸露于空气中；在歩骤3)中， 接种后，暗箱培养，待芽长至1-2厘米后，改用每天12小时光照培养，光照培养条件为 温度23-27。C，相对湿度30-50%，每天光照12小时，培养基PH5. 8，琼脂7g/L ;在步骤4) 中，待苗长至8-10厘米高时，转置1/2MS培养基，15天剪苗，使苗高保持在10cm。本发明和现有技术比较具有的优点 一是，消毒方法本发明首先将种子低温浸种 后，再剥掉种皮，这样避免了种皮结构致密复杂导致消毒不彻底这一问题，然后采用O. 1% 升汞溶液进行消毒，升汞有剧毒，消毒时间长对种子有毒害作用，所以本发明剥掉种皮， 使得消毒时间縮短且消毒彻底，升汞的消毒效果好于其他消毒剂如次氯酸钠，本发明中， 鹅观草属种子污染率为O; 二是，萌发能力本发明低温浸种12-30小时，打破其休眠，在接种时注意种胚向上且不把整个种子埋于培养基中，并为不同的鹅观草属植物种子选 择了相应的最佳培养基，这样克服了鹅观草属植物传统萌发存在的发芽不一致问题，提 高了萌发能力，发芽指数从14.48提高到42.06，可以获得整齐一致的无菌苗，满足鹅观 草属植物种子栽培及遗传育种实验的需求；三是，幼苗生长本发明采用暗箱培养诱导 萌发，萌发后待芽长至卜2厘米时(需要一周左右)，采用每天12小时光照培养，待苗长 至8-IO厘米高时(培养2周时间左右)，将培养基换为1/2MS培养基，该培养基有助于鹅 观草属植物种子生根和壮苗，在幼苗培养过程中每半个月左右定期剪苗，使苗高保持在 10cm左右，从而促进其分蘖，克服出现弱苗现象，提高幼苗移栽后的存活率。
图l本发明工艺框图。 ' 具体实施方案以下结合附图通过实施例对本发明技术内容及相关技术做进一步详述，但本发明的 技术并不局限于此。 实施例一材料来源采集于内蒙古呼和浩特市清水河县鹅观草属05-68材料，在资源圃内培 育，种子腊熟期收种。培养方法1、 种子预处理选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15-20min后放置在4 'C条件下用无菌水浸种24h;2、 外植体消毒将上述经过预处理的种子剥掉种皮，先用75%酒精消毒30秒，无菌 水清洗3次，再用O. 1%升汞溶液消毒3分钟，无菌水清洗5次，最后用无菌滤纸吸干种子 表面的水分，接种到固体培养基；培养基MS培养基，将种子种胚朝上方向接种；3、 培养条件在整个培养过程中，种子无菌萌发采用暗箱培养，待芽长至1-2厘米时(需要l周左右)，采用光照培养，培养条件为温度23-27'C，相对湿度30-50%:每 天光照12小时，培养基PH5.8，琼脂7g/L;4、 壮苗培养待苗长至8-10厘米高时(培养2周时间左右)，转置1/2MS培养基，定 期剪苗(半个月左右)，使苗高保持在10cm左右，促使其生根，分蘖并达到壮苗效果。实施例二材料来源采集于山西省偏关鹅观草属05-28材料，在资源圃内培育，种子腊熟期 收种。与实施例l的区别是，在歩骤l，选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15rain 后放置在4'C条件下用无菌水浸种12h;步骤3， 1/2MS培养基，将种子种胚朝上方向接种。实施例三材料来源采集于阿尔山好森沟林场鹅观草属05-ll材料，在资源圃内培育，种子腊熟期收种。与实施例l的区别是，在步骤l，选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15min 后放置在4"C条件下用无菌水浸种20h。 实施例四.-材料来源采集于内蒙古呼伦贝尔盟根河市鹅观草属05-24材料，在资源圃内培育， 种子腊熟期收种。培养方法按实施例1方法进行。虽然以上己经参照附图对按照本发明目的的构思和实施例作了详尽说明，但本领域 普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的甜提条件下，仍然可以对本 发明作出各种改进和变换，而这些改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。
权利要求
1.鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，按照以下步骤1)种子预处理选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15-20min后放置在2-4℃条件下用无菌水浸种12-30h；之后，2)外植体消毒将上述经过预处理的种子剥掉内外稃，用75％酒精消毒25-40秒，之后，用无菌水清洗3次，再用0.1％升汞溶液消毒1--4分钟，再用无菌水清洗5次，再用无菌滤纸吸干种子表面的水分，随之接种到固体培养基，培养基为MS或1/2MS培养基；之后，3)先在暗箱培养，待芽长至1-2厘米时，改用光照培养，之后，4)壮苗培养待苗长至8-10厘米高时，转置1/2MS培养基，使苗高保持在10±2cm。
2. 根据权利要求l所述的鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，在步骤l)中 将选好的种子先用自来水冲洗15-20min后，然后在4"C条件下用无菌水浸种24h。
3. 根据权利要求l所述的鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，在歩骤2)中， 用75%酒精消毒30秒，之后，再用O. 1%升汞溶液消毒3分钟。
4. 根据权利要求l所述的鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，在歩骤2)中， 在接种到固体培养基接种时种胚朝上方向，种胚面裸露于空气中。
5. 根据权利要求l所述的鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，在步骤3)中， 接种后，暗箱培养，待芽长至l-2厘米后，改用每天12小时光照培养，光照培养条件为 温度23-27。C，相对湿度30-50%，每天光照12小时，培养基PH5.8，琼脂7g/L 。
6. 根据权利要求l所述的鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，在步骤4)中， 待苗长至8-10厘米高时，转置1/2MS培养基，15天剪苗，使苗高保持在10cm。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，特别涉及鹅观草属植物种子无菌萌发与培育方法。本发明的生产方法包括种子预处理选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15-20min后放置在2-4℃条件下用无菌水浸种12-30h；之后，外植体消毒将上述经过预处理的种子剥掉内外稃，用75％酒精消毒25-40秒，之后，用无菌水清洗3次，再用0.1％升汞溶液消毒1-4分钟，再用无菌水清洗5次，再用无菌滤纸吸干种子表面的水分，随之接种到固体培养基，培养基为MS或1/2MS培养基；之后，先在暗箱培养，待芽长至1-2厘米时，改用光照培养，之后，壮苗培养待苗长至8-10厘米高时，转置1/2MS培养基，使苗高保持在10±2cm。本发明提高了鹅观草属植物萌发能力，发芽指数从14.48提高到42.06，获得整齐一致的无菌苗，满足鹅观草属植物种子栽培及遗传育种实验的需求。
文档编号A01G31/00GK101606481SQ20091005457
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月9日 优先权日2009年7月9日
发明者于靖怡, 任卫波, 刘雅学, 柱 徐, 戴雅婷, 李临杭, 田青松, 解继红, 陈景芋, 陈立波, 马玉宝, 马邢甲 申请人:中国农业科学院草原研究所