专利名称：兰属植物种子无菌萌发与植株培育方法
技术领域：
本发明涉及植物培植技术领域，具体地说是兰属植物种子无菌萌发与植株培育方法。
背景技术：
沉香虎头兰(Cmbidium tracyanum L castle)、碧玉兰(C.Lowianum)及黄蝉兰(C.iridioides)是兰科兰属植物，花大枝长，观赏价值高，是优异的兰花资源。三种兰花多产于云南、贵州和西藏东南部，是很好的杂交亲本和切花材料。
兰花种子很小，内含一些发育不完全的球形胚，无胚乳，自然状态下很难萌发，需与兰菌共生或无菌条件培养才能获得成功。兰属(Cmbidium)植物种子的萌发，已有人作过研究，但以上三种兰属植物的无菌萌发未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种兰属植物种子无菌萌发与植株培育方法。
本发明对沉香虎头兰(Cmbidium tracyanum L castle)、碧玉兰(C.Lowianum)及黄蝉兰(C.iridioides)三种兰花种子进行了无菌萌发和快速繁殖技术体系研究，成功地培育出大量组培苗，形成杂交育种和规模化生产栽培不可缺少的关键技术。
本发明的具体方法是1)材料来源采得沉香虎头兰兰株、黄蝉兰兰株、碧玉兰兰株在资源圃内培育至兰花果实到九成熟，果皮略显黄色时摘取；2)培养方法①外植体处理将上述90％成熟度果实用75％酒精消毒40秒，转入1％升汞表面消毒8～12分钟，无菌水冲洗3～4次，无菌室取出种子并用纱布包好种子后，以少量无菌水润洗5次，然后用0.1mol/L KOH溶液预处理8分钟，用无菌水冲洗3次，在饱和漂白粉上清液中消毒10～20分钟，无菌水冲洗5次后，接种到固体培养基；②培养基用改良的MS固体培养基(即1/2MS培养基)加入细胞分裂素，和生长素，即1/2MS+6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1培养基，将种子接种在此培养基上培养；③培养条件在整个培养过程中，种子无菌萌发采用暗箱培养，圆球茎成苗的培养、增殖和生根培养均采用光照培养，培养条件为温度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小时，培养基pH5.4，琼脂7g/L，待种子萌发后长出芽和长出带根毛的幼根时，转接培养；④转接对圆球茎进行转接，即从一个培养瓶转到另一个培养瓶的；⑤快速增殖当圆球茎长到1cm左右，再转到增殖培养基1/2MS+6-BA1.5～2.5mg.L-1+NAA0.2～0.5mg.L-1+香蕉泥70～80g/L培养中进行增殖培养；⑥生根培养将增殖培养后的苗培养到5～8cm高，从基部切下，转到生根培养基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中，一个月后即长出新根。
本发明从实验研究中得出如下结论1、种子无菌萌发培养1/2MS培养基外加6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1有利于种子萌发。
2、圆球茎培养改良的培养基培养圆球茎生长的效果最佳。
3、不同激素、培养基对增殖的影响根据不同培养时期加入不同的生长素、细胞分裂素及其他附加物质(香蕉泥)增殖培养效果最好。
4、生根培养把无根兰苗转接到不同活性物质的生根培养基中，培养三个月时的不同活性物质的促根效果不同，在基本培养基加入10-6Y2(生防菌)时，根长、根数、茎粗效果都较其它三组好，且根数较对照高33％；不加激素的对照也长出三条根，说明对外源激素的依赖程度不高，同时NAA为2.0mg/L时对根的生长有抑制作用；加入10-6Y1(生防菌)时，根长、根粗、株高、茎粗都较对照好。说明生根培养以10-6Y2(生防菌)为宜。
本发明与现有技术比较具有的优点1、传统的兰花繁育主要以分株繁殖为主，而分株繁殖系数底，每年老苗与新新生苗的比例只为1∶1～3左右，很难进行规模化生产。组织培养应用于兰花的培养报道较少，这种现代生物技术可用一个芽在一年中繁殖出数十万株兰花，从而满足兰花产业化需求；还可进行脱毒技术操作，生产出无病毒种苗，从而可降低兰花生产的成本和提高产品质量，这都是传统分株技术无法做到的。因此，该技术克服了兰花传统繁殖方法带来的种种弊端，有利于扩大兰花的繁殖系数，能在短期内生产出数量巨大的试管种苗和脱毒苗，有效满足兰花产业化生产的巨大需求。
具体实施例方式
实施例1材料来源自云南山区采得沉香虎头兰兰株，在资源圃内培育至兰花果实到九成熟，果皮略显黄色时摘取。
培养方法1、外植体处理将上述90％成熟度果实用75％酒精消毒40秒，转入1％升汞表面消毒8～12分钟，无菌水冲洗3～4次，无菌室取出种子并用纱布包好种子后，以少量无菌水润洗5次，然后用0.1mol/L KOH(氢氧化钾)溶液预处理8分钟，用无菌水冲洗3次，在饱和漂白粉上清液中消毒10～20分钟，无菌水冲洗5次后，接种到固体培养基；2、培养基用1/2MS+6-BA1.0mg.L-1+NAA1.0mg.L-1培养基，将种子接种在此改良的MS培养基上培养(6-BA即6-苄基腺嘌呤，为细胞分裂素，NAA即奈乙酸，为生长素)；3、培养条件在整个培养过程中，除了种子无菌萌发采用暗箱培养外，圆球茎成苗的培养，增殖和生根培养均采用光照培养。培养条件为温度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小时，培养基pH5.4，琼脂7g/L。接种3个月后发芽率达90％以上。种子萌发后先长出芽，随后长出带根毛的幼根，转接培养3个月后逐渐成苗；4、转接的具体过程转接方法由于兰花种子非常细小，播种时有些种子聚集在一起，致使长出的圆茎球较拥挤，因此对圆球茎进行转接，即从一个培养瓶转到另一个培养瓶的过程；5、快速增殖过程当圆球茎长到1cm左右，再转到增殖培养基1/2MS+6-BA2.5mg.L-1+NAA0.2mgL-1+香蕉泥70g/L培养(香蕉泥是附加物)；6、生根培养将增殖培养后的苗培养到5～8cm高，从基部切下，转到生根培养基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中(Y1、Y2为生防菌，由云南农业大学提供)，一个月后即长出新根。
实施例2材料来源自云南山区采得碧玉兰(C.Lowianum)兰株，在资源圃内培育至兰花果实到九成熟，果皮略显黄色时摘取。
培养方法1、外植体处理按实施例1的方法进行。
2、培养基用1/2MS+6-BA2.0mg.L-1+NAA0.5mg.L-1培养基，将种子接种在此改良的MS培养基上培养；步骤3和4按实施例1的方法进行。
5、快速增殖过程当圆球茎长到1cm左右，再转到增殖培养基1/2MS+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.5mg.L-1+香蕉泥80g/L培养；6 步骤按实施例1的方法进行。
实施例3材料来源自云南山区采得黄蝉兰(C.iridioides)兰株，在资源圃内培育至兰花果实到九成熟，果皮略显黄色时摘取。
培养方法按实施例1或实施例2的方法进行。
权利要求
1.一种兰属植物种子无菌萌发与植株培育方法，其特征在于按以下步骤进行1)材料来源采得沉香虎头兰兰株、黄蝉兰兰株、碧玉兰兰株在资源圃内培育至兰花果实到九成熟，果皮略显黄色时摘取；2)培养方法①外植体处理将上述90％成熟度果实用75％酒精消毒40秒，转入1％升汞表面消毒8～12分钟，无菌水冲洗3～4次，无菌室取出种子并用纱布包好种子后，以少量无菌水润洗5次，然后用0.1mol/L KOH溶液预处理8分钟，用无菌水冲洗3次，在饱和漂白粉上清液中消毒10～20分钟，无菌水冲洗5次后，接种到固体培养基；②培养基用MS+6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1培养基，将种子接种在此培养基上培养；③培养条件在整个培养过程中，种子无菌萌发采用暗箱培养，圆球茎成苗的培养、增殖和生根培养均采用光照培养，培养条件为温度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小时，培养基pH5.4，琼脂7g/L，待种子萌发后长出芽和长出带根毛的幼根时，转接培养；④转接对圆球茎进行转接，即从一个培养瓶转到另一个培养瓶的；⑤快速增殖当圆球茎长到1cm左右，再转到增殖培养基1/2MS+6-BA1.5～2.5mg.L-1+NAA0.2～0.5mg.L-1+香蕉泥70～80g/L培养中进行增殖培养；⑥生根培养将增殖培养后的苗培养到5～8cm高，从基部切下，转到生根培养基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中，一个月后即长出新根。
全文摘要
本发明是一种兰属植物种子无菌萌发与植株培育方法。采得沉香虎头兰兰株、黄蝉兰兰株、碧玉兰兰株在资源圃内培育至兰花果实到九成熟。培养方法经外植体处理，改良的培养基对种子进行培养，待种子萌发后长出芽和长出带根毛的幼根时，转接培养，快速增殖，生根培养，一个月后即长出新根。传统的兰花繁育主要以分株繁殖为主，而分株繁殖系数底，每年老苗与新生苗的比例只为1∶1～3左右，很难进行规模化生产。本发明用现代生物技术可用一个芽在一年中繁殖出数十万株兰花，从而满足兰花产业化需求；还可进行脱毒技术操作，生产出无病毒种苗，从而可降低兰花生产的成本和提高产品质量，有效满足兰花产业化生产的巨大需求。
文档编号A01G7/00GK1729747SQ20051001076
公开日2006年2月8日 申请日期2005年4月22日 优先权日2005年4月22日
发明者李枝林, 余朝秀, 王卜琼, 王玉英, 黄丽萍 申请人:云南农业大学