专利名称：一种杀线虫生物菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杀线虫生物菌剂及其制备方法和应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
植物线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类达70多种，危害3000多种植物，每年造成损失巨大。据联合国粮农组织统计，每年全球因线虫造成的损失高达1000多亿美元，2001年我国作物受线虫危害造成的损失高达233亿元。松材线虫被称为无烟森林火灾，在江苏、浙江、广东、山东、安徽、湖北、上海、台湾、香港等部份地区严重发生，有向全国漫延的趋势。更严重的是由于根结线虫侵染后造成作物伤口，致使作物根部病害严重发生。
目前对线虫防治仍以化学杀线虫剂为主。长期以来，化学杀线虫剂在保障农业生产，防治线虫病中发挥了重要作用。但随着科学技术的进步，发现许多化学杀线虫剂均有副作用，不仅产生抗药性，更造成环境污染，危害人体健康，相继有不少被禁用或即将禁用。如美国已经禁止使用溴甲烷，二溴甲烷。化学杀线虫剂在防治线虫危害，保障农业生产的同时，给人类健康和环境带来了一定的负面影响，开发高效低毒杀线虫剂和生物杀线虫剂已经迫在眉睫。
轮枝菌是一类非常重要的生防真菌，其中很多都是重要的昆虫和线虫的病原真菌，能有效的防治多种有害昆虫和线虫，在植物的病原昆虫和线虫的生物防治中起着非常重要的作用。其中，蜡蚧轮枝菌和厚孢普可尼亚菌已经应用于生物杀虫剂的开发，而有关刀孢轮枝菌对昆虫和线虫的作用目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是通过对一株产生胞外酶并能够有效分解线虫体壁结构的内寄生真菌刀孢轮枝菌的研究，开发杀线虫生物菌剂。
本发明人筛选到一株对植物寄生线虫具有很好毒杀效果的内寄生真菌-刀孢轮枝菌Lecanicillium psalliotae，YMF1.00112。YMF1.00112菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2005年1月27日；保藏登记入册的编号CGMCC No.1312。
刀孢轮枝菌Lecanicillium psalliotae，YMF1.00112系本发明人从线虫体表分离的一株内寄生真菌，主要形态特征为在PDA培养基上生长较快，培养7天后菌落直径达到3～6cm，菌丝生长致密，菌落颜色呈白色，背面浅黄至棕色；分生孢子梗轮状着生，基部宽13～29μm，顶部宽0.2～0.5μm，分生孢子头状着生，椭圆形，镰刀形，0.6～2.2×2.0～9.0μm，未见厚垣孢子。
本发明采用常规方法将刀孢轮枝菌扩大培养后，提取杀线虫有效成分，测定其对腐生线虫(Panagrellus redivivus)和松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的杀虫效果。
本发明是这样实现的YMF1.00112菌株培养方法1.试管种培养试管种采用常规方法培养，将YMF1.00112菌丝体接种到PDA培养基上，20-25℃下培养7～10天，获得试管种。
2.液体扩大培养液体培养基配方为8-15g葡萄糖；0.8-1.5g硫酸铵；0.4-0.6g硫酸镁；0.01-0.02g硫酸亚铁；1000ml土豆浸出汁(100g土豆加1200ml水煮沸过滤，用水补足至1000ml)，pH6.5。用250ml三角瓶，每个装60ml培养液，121℃灭菌20分钟后接入试管种，26℃，200rpm下摇床培养6天。
提取杀线虫活性成分将前述液体扩大培养好的菌液过滤后，用5KDa孔径的超滤膜进行浓缩。浓缩液透析处理以后用阳离子交换柱进行纯化，分别收集穿透峰和洗脱峰，生物活性测定表明大部分蛋白酶活性在洗脱峰，合并洗脱峰再用疏水柱进一步的纯化，收集洗脱峰并用蒸馏水透析处理，电泳分析已达到电泳纯。冷冻干燥把样品冻干并溶解于2ml的蒸馏水中，-20℃保存，经过超滤膜浓缩以后的制剂即为杀线虫制剂。
杀线虫活性试验1.制备试验用药剂和对照用药剂1)制备试验用药剂按前述YMF1.00112菌株培养方法获得菌液，按前述提取杀线虫活性成份的方法制备试验用药剂。
2)制备对照用药剂对照1按制备试验用药方法制备，不同的是，培养液中不接入YMF1.00112菌株；对照2将制备供试药剂100℃煮沸30分钟后作为对照，以证明杀线虫有效成份是蛋白酶。
2.制备试验用线虫1)制备Panagrellus redivivus线虫将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μl的线虫悬浮液。
2)制备松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)
在100ml三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高压灭菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培养4至7天。待菌丝铺满三角瓶后，接种经0.25％次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15至20天。用无菌水将线虫洗下，制成含量为15条/μl的线虫悬浮液。
3.试验方法1)药效试验方法取试验用药剂200μl于1.5ml离心管中，加入活线虫60条，离心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus线虫分别于12小时、20小时；松材线虫分别于12小时、20小时检查并计算线虫的死亡率。鉴定死亡的方法为在处理离心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
分别用2种对照药剂进行对照实验。
试验设三个平行，两次重复。
2)纯化样品的杀线虫作用和对线虫体壁的分解实验方法同上，用光学显微镜观察纯化的样品对线虫体壁的分解作用。
4.试验结果表1YMF1.001 12对Panagrellus redivivus线虫杀虫效果
表2YMF1.00112对松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)的杀虫效果 结果表明，从YMF1.00112菌株液体发酵产物中提取的试验用药剂对Panagrellusredivivus线虫和松材线虫均具较好的杀线虫效果。用5倍浓缩的样品作为药液处理线虫，12小时后Panagrellus redivivus线虫100％死亡并且线虫完全被分解，松材线虫死亡率也达到60％以上(表2)，20小时以后松材线虫的死亡率也达到100％，但松材线虫的体壁结构完整，没有被分解。实验结果同时表明，经阳离子柱纯化的样品的杀线虫活性低于粗的浓缩样品，说明有其它成分参与了杀线虫的过程。
从处理线虫的变化来看，经历了从部份体壁分解到虫体全部降解的过程，说明活性成份主为要分解线虫的酶类。而将同批提取的试验用药剂经过煮沸处理，导致蛋白质变性后，其杀线虫活性非常小，且线虫体壁不出现溶解现象，这也证明了YMF1.00112菌株对线虫的活性成份主要为酶类。
本发明刀孢轮枝菌YMF1.00112是一种对线虫具有较好毒杀作用功能的真菌，其主要作用成份是胞外酶，对线虫特别是松材线虫的毒力显著高于或同等于以前报道的厚孢普可尼亚菌，具备了很好的应用开发前景。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一
将YMF1.00112菌株接种到PDA斜面上，20-25℃下培养8天，获得试管种。
将试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中，每瓶装60ml，液体培养基配方为10g葡萄糖，1g硫酸铵，0.5g硫酸镁，0.015g硫酸亚铁，1000ml土豆浸出汁，pH6.5。每个250ml三角瓶分装60ml培养液，121℃灭菌20分钟后接入试管种，26℃，200rpm下摇床培养6天后，将菌液过滤，用5KDa孔径的超滤膜进行浓缩。浓缩液透析处理以后用阳离子交换柱进行纯化，分别收集穿透峰和洗脱峰，生物活性测定表明大部分蛋白酶活性在洗脱峰，合并洗脱峰再用疏水柱进一步的纯化，收集洗脱峰并用蒸馏水透析处理，电泳分析已达到电泳纯。冷冻干燥把样品冻干并溶解于2ml的蒸馏水中，-20℃保存。经过超滤膜浓缩以后的制剂即为杀线虫制剂。
实施例二基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方为8g葡萄糖；1.5g硫酸铵；0.6g硫酸镁；0.01g硫酸亚铁。
实施例三基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方为15g葡萄糖；0.8g硫酸铵；0.4g硫酸镁；0.02g硫酸亚铁。
本发明的使用效果详见表1和表2。
权利要求
1.一种杀线虫生物菌剂，该菌剂由生产菌株和辅料经试管种培养、液体扩大培养及提取杀线虫活性成份工序后得到，其特征在于该生物菌剂的生产菌株为刀孢轮枝菌(Lecanicillium psalliotae)YMF1.00112，YMF1.00112菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期2005年1月27日；保藏号CGMCC No.1312。
2.权利要求1所述生物菌剂的制备方法，包括试管种培养、液体扩大培养及提取杀线虫活性成分工序，其特征在于液体扩大培养基的配方为8-15g葡萄糖；0.8-1.5g硫酸铵；0.4-0.6g硫酸镁；0.01-0.02g硫酸亚铁；1000ml土豆浸出汁，pH6.5。
3.权利要求1所说的生物制剂，其特征在于该制剂对Panagrellus redivivus线虫和松材线虫具有毒杀作用，可用于植物寄生线虫生防。
全文摘要
本发明涉及一种杀线虫生物菌剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。本发明的生物菌剂由生产菌株经试管种培养、液体扩大培养及提取杀线虫活性成分的常规方法制备，其生产菌株为Lecanicillium psalliotae YMF1.00112，保藏号CGMCC No.1312。本发明制备方法中液体扩大培养基的配方为10g葡萄糖，1g硫酸铵，0.5g硫酸镁，0.015g硫酸亚铁，1000ml土豆浸出汁，pH6.5。本发明的杀线虫生物菌剂对松材线虫和Panagrellus redivivus线虫具有毒杀作用，可用于植物寄生线虫生防。本发明具有毒杀力高、有利于人体健康和环境保护等优点。
文档编号A01N63/04GK1663394SQ20051001069
公开日2005年9月7日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者张克勤, 杨金奎, 周薇 申请人:云南大学