专利名称：具有杀线虫功能的囊孢单顶孢菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有杀线虫功能的囊孢单顶孢菌剂及其制备方法和应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
植物线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类达70多种，危害3000多种植物，每年造成损失巨大。据联合国粮农组织统计，每年全球因线虫造成的损失高达1000亿美元，2001年我国作物因受线虫危害造成的损失高达233亿元。松材线虫被称为无烟森林火灾，在江苏、浙江、广东、山东、安徽、湖北、上海、台湾、香港等部份地区严重发生，有向全国漫延的趋势。更严重的是由于根结线虫侵染后造成作物伤口，致使作物根部病害严重发生。
目前对线虫防治仍以化学杀线虫剂为主。发明于上个世纪40年代的化学杀线虫剂，长期以来在保障农业生产，防治线虫病中发挥了重要作用。但随着科学技术的进步，发现许多化学杀线虫剂均有副作用，不仅产生抗药性，更造成环境污染，危害人体健康，相继有不少被禁用或即将禁用。如美国已经禁止使用溴甲烷，二溴甲烷只能使用到2005年。化学杀线虫剂在防治线虫危害，保障农业生产的同时，给人类健康和环境带来了严重的负面影响，开发高效低毒杀线虫剂和生物杀线虫剂已经迫在眉睫。
单顶孢是一类非常重要的捕食线虫真菌，它们能够产生三维菌网等捕食器官捕促线虫，是一种非常重要的线虫生防资源。研究表明，囊孢单顶孢不仅能够在CMA平板上产生捕器捕捉线虫，同时在液体培养过程中分泌胞外蛋白酶并通过胞外酶溶解线虫体壁而杀死线虫。
发明内容
本发明的目的是通过对产生胞外酶并能够有效分解线虫体壁杀死线虫的囊孢单顶孢的研究，开发生物杀线虫剂。
本发明筛选到一株对植物寄生线虫具有很好杀虫效果的囊孢单顶孢(Monacrosporium cystosporium)YMF1.00024，YMF 1.00024菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2005年1月27日；保藏登记入册的编号CGMCC No.1309。
囊孢单顶孢(Monacrosporium cystosporium)YMF1.00024的主要形态特征为营养菌丝无色，分隔，分枝；分生孢子梗无色，8-11分隔，直立单生，长60-420μm，基部宽5～7.5μm，向上渐细，顶部宽3～5μm，顶端着生单个分生孢子；分生孢子无色，倒卵形，纺锤形，基部细胞细长，1～3个分隔，以2～3个分隔为主，基细胞细长似尾是该种的典型特征，大小30～52.5×15～22.5μm。具厚垣孢子。捕食器为三维菌网。
本发明按常规方法制备。即将(Monacrosporium cystosporium)YMF1.00024扩大培养后，提取杀线虫有效成分，测定其对腐生线虫(Panagrell redivivus)和松材线虫的毒杀效果。
本发明是这样实现的YMF1.00024菌株培养方法1.试管种培养培养基配方为改良型PDA培养基1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8％琼脂；pH6.5。将YMF1.00024菌丝体接种到培养基上，22℃下培养8天，获得试管种。
2.液体扩大培养(产酶培养)产酶培养基(PL-4)组成如下0.1％葡萄糖，0.1％硫酸铵，0.05％硫酸镁，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亚铁，用水补充体积至1L，pH 6.5。每个250ml三角瓶分装60ml培养液，1L培养基加入2ml(培养方法见制备试验用线虫，每毫升含1000条线虫)腐生线虫作为诱导物，121℃灭菌20分钟，接入菌块，26℃摇床(200rpm)培养6天。
杀线虫活性成分的提取将发酵培养物过滤，收集上清液，按1∶0.56的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清。用50mM磷酸缓冲液(39ml的50mM磷酸二氢钠加61ml的50mM磷酸氢二钠，pH为7.0)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于50mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时，即得杀线虫药液。将药液保存于4℃冰箱中待用。
杀线虫活性试验1、制备试验用药剂和对照用药剂1)制备试验用药剂按前述液体扩大培养方法培养YMF1.00024菌株，按前述提取杀线虫活性成份的方法制备试验用药剂。
2)制备对照用药剂对照1按制备试验用药方法制备，不同的是，培养液中不接入YMF1.00024菌株。
对照2将制备供试药剂100℃煮沸30分钟后作为对照，以证明杀线虫有效成份是蛋白酶。
2、制备试验用线虫1)将P.redivivus线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫。用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μl的线虫悬浮液。
2)制备松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高压灭菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培养4至7天。待菌丝铺满三角瓶后，接种经0.25％次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15至20天。用无菌水将线虫洗下，制成含量为15条/μl的线虫悬浮液。
3、试验方法1)药效试验方法取试验用药剂200μl于1.5ml离心管中，分别加入Panagrellus redivivus线虫和松材线虫60条，离心管平放，置于25℃下，分别于12小时、24小时、36小时检查计算线虫的死亡率。并在光学显微镜下观察，观察线虫体壁变化情况。
鉴定死亡的方法为在处理离心管中加入1-5滴5％NaCl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
分别用三种对照药剂，每处理重复三次。
分别用两种对照药剂进行对照试验。
试验设三个平行，两次重复。
4、试验结果表1YMF1.00024对Panagrellus redivivus线虫毒杀作用
表2囊孢单顶孢YMF1.00024对松材线虫毒杀作用
结果表明，囊孢单顶孢(Monacrosporium custosporium)YMF1.00024菌株液体发酵产物中提取的试验用药剂对Panagrellus redivivus线虫具较好的毒杀作用，线虫36小时的死亡率达90％，体壁大部分降解。从处理线虫的变化来看，经历了从部分体壁溶解到虫体全部溶解的过程，说明活性成份主要为分解线虫的酶类。而将同批提取的试验用药剂经过煮沸，导致蛋白质变性后，其杀线虫活性非常小，且线虫体壁不出现溶解现象，这也证明了囊孢单顶孢YMF1.00024菌株的活性成份主要为酶类。囊孢单顶孢(Monacrosporium cystosporivm)YMF1.00024菌株对松材线虫有一定的毒杀作用，线虫36小时的死亡率达70％，虫体僵直，说明本发明菌株对松材线虫有一定的毒杀作用，但明显低于Panagrellus redivivus线虫。
本发明的囊孢单顶孢菌剂对Panagrellus redivivus线虫和松材线虫具有较好的毒杀作用，可以作为线虫生防菌剂进行开发。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
将YMF1.00024菌株接种到改良PDA斜面上，培养基配方为1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8％琼脂；pH自然。将YMF1.00024菌丝体接种到培养基上，22℃下培养8，获得试管种。
将试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中(每瓶装60ml)，液体培养基配方为0.1％葡萄糖，0.1％硫酸铵，0.05％硫酸镁，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亚铁，用水补充体积至1L，pH6.5。每个250ml三角瓶分装60ml培养液，并加入少量的线虫作为诱导物，121℃灭菌20分钟，接入菌块，26℃摇床(200rpm)培养6天。
按1∶0.56的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清。用50mM磷酸缓冲液(39ml的50mM磷酸二氢钠加61ml的50mM磷酸氢二钠，pH为7.0)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW8，000-14400KDa)于50mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时，即得杀线虫药液。将药液保存于4℃冰箱中待用。
本发明的作用效果详见表1和表。
权利要求
1.一种具有杀线虫功能的囊孢单顶孢菌剂，由生产菌株经常规试管培养、液体发酵及提取杀线虫活性成分获得，其特征在于该菌剂的生产菌株为囊孢单顶孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00024，保藏日期2005年1月27日，保藏号CGMCCNo.1309。
2.权利要求1所述的具有杀线虫功能的囊孢单顶孢菌剂的制备方法，其特征在于2.1液体发酵培养基配方为0.1％葡萄糖，0.1％硫酸铵，0.05％硫酸镁，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亚铁，2ml腐生线虫作为诱导剂，每ml含1000条线虫，用水补充体积至1L，pH6.5；2.2从液体发酵产物中提取杀线虫有效成分的方法是将发酵培养物过滤，收集上清液，按1∶0.56的比例加入硫酸铵，于4℃静置2小时，然后8000rpm/min离心30分钟，弃上清；用50mM磷酸缓冲液重新溶解，磷酸缓冲液为39ml的50mM磷酸二氢钠加61ml的50mM磷酸氢二钠，pH为7.0，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋于50mM磷酸缓冲液中透析3-4次，每次3小时，即得杀线虫药液，将药液保存于4℃冰箱中待用。
3.权利要求1所述的囊孢单顶孢菌剂，其特征在于它对Panagrellus redivivus线虫和松材线虫具有毒杀作用，可以应用于植物寄生线虫生防。
全文摘要
本发明涉及一种具有杀线虫功能的囊孢单顶孢菌剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。本发明的生产菌株为囊孢单顶孢(Monacrosporium cystosporium) YMF1.00024，囊孢单顶孢菌剂采用常规方法制备，其中液体发酵培养基配方为0.1％葡萄糖，0.1％硫酸铵，0.05％硫酸镁，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亚铁，用水补充体积至1L，pH 6.5。从液体发酵产物中提取杀线虫有效成分的方法是，将发酵培养物进行过滤处理，上清液用硫酸铵进行浓缩处理即可做为杀线虫的药液。本发明产品对Panagrellus redivivus线虫具有毒力高的突出优点，具有较好的潜在应用前景。
文档编号A01N63/04GK1683514SQ20051001069
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者张克勤, 杨金奎, 周薇 申请人:云南大学