专利名称：一种百合种球病毒的脱除方法
技术领域：
本发明涉及一种百合种球病毒的脱除方法，特别涉及一种采用热处理脱毒、化学药剂脱毒以及热处理脱毒和化学药剂脱毒综合应用的方法。
背景技术：
席梦利等(席梦利，王节萍，章静娟等.宜兴百合脱毒技术[J].江
苏农业学报，2001,17(1):49~51.28)以宜兴百合为试材，对3种脱毒方法(茎尖培养、热处理结合茎尖培养、花药培养)进行研究，结果表明，珠芽经50。C热水处理40min,培养30d后，切取0.8 1.0mm茎尖培养的脱毒效果最好，成活率为15%，脱毒率达100%，热水处理50min的珠芽全部受热死亡，热空气处理42d后，切取长度0.8 ~ 1.0 mm的茎尖培养,脱毒率可达40%。
郭方其等(郭方其，丁晓瑜，朱金庆，黎侠，林森洪.东方百合热处理茎尖培养及组培快繁技术研究.中国球根花弁年报，2006，101 106.)研究了 "西伯利亚"的热处理茎尖培养，结果表明，鳞茎在50。C下处理80min,在MS培养基上添加0.1 ~0.3g/L活性炭可提高茎尖分化率，试管鳞茎经30 38'C交替变温热处理脱毒60天，鳞茎成活率和茎尖分化率较高。
张艺萍等(张艺萍，屈云慧，王祥宁，吴学尉，熊丽.提高百合茎尖组织培养脱毒效率研究.广东农业科学，2007(1),37~38.)以带有CMV病毒的东方百合栽培品种"西伯利亚"鳞茎为外植体，常规消毒后培养成苗，热处理后剥取较大的茎尖(0.4 ~ 0.6mm )进行培养，待茎尖长成植株后再次剥取较大茎尖进行二次脱毒，经检测脱毒率可达80%，提高了百合茎尖组织培养脱毒效率。陈躯陈颖，王亚斌，罗凤霞.索拉亚百合茎尖组织培养研究[J].辽
宁农业科学，2005(2): 6-8.)以索拉亚百合的茎尖为外植体，成功建
立了快速无性繁殖体系。茎尖愈伤组织诱导培养基为MS+BA3mg/L+NAA3mg/L,芽继代增殖的最佳培养基MS+BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L,KT对芽的增殖效果不如BA，IBA的效果明显好于IAA,IBA的使用浓度以0.05 mg/L左右为宜。
Kim等(KimJY，LeeSY, Choi JK，等.病毒唑对百合植株LSV和CMV病毒脱除的影响.RDA农业科学杂志(韩国出版)，1994，36:370-374.)研究报道了病毒唑对CMV有较强的抑制作用。(Blom-Barnhoorn (1985) Blom-Barnhoorn, G. J.和J. V. Aartrijk. 1985.The regeneration of plants free of LSV and TBV from infected liliumbulb-scale explants in the presence of virazole. Acta Hort. 164: 163-168 )釆用不同的病毒唑浓度(20和100mg/L)，分别获得了两个百合品种"Georgia"和"Connecticut King"的无毒苗。
Xu-PinSan(1999)在鳞片诱导培养基中加5mg/L的硫尿嘧啶,获得80%脱毒植株。(Xu P S， Niimi Y, 1999. Evaluation of virus—free bulbletsproduction by antiviral and/or heat treatment inin vitroscale cultures ofLilium longiflorum Georgia andL. x . Casablanca JJapan SocHort Sci，68:640~647植物学通报20卷)。
徐品三(徐品三，栾雨时，刘纪文，新美芳二.百合不定芽培养脱毒种球生产的研究.植物学通报.2003， 20(3):313 318.)用10mg/LDHT发现，对植株生长无任何影响，进一步证明了抗病毒剂的种类和浓度对植物的生长阻害作用是不同的。
席梦利(席梦利，王节萍，章静娟等.宜兴百合脱毒技术[J].江苏农业学报，2001,17(1):49~51.28)利用38± 1。C， 6h或25。C8h热空气和50±1。C, 40min恒温水浴结合茎尖培养脱除了宜兴百合的CMV病毒。Blom-Barnhoorn(1985) ( Blom-Barnhoorn, G. J.和J. V. Aartrijk.1985. The regeneration of plants free of LSV and TBV from infectedlilium bulb-scale explants in the presence of virazole. Acta Hort. 164:163-168.)采用茎尖脱毒+病毒唑处理(40mg/L)的方法,将百合品种"Arai"带毒率从61%降为35%。
江洪如(江洪如，余发新，朱祺，高柱.龙牙百合茎尖脱毒快繁及种球培育技术，江西农业大学学报，2007, 29(6).)研究了龙牙百合茎尖脱毒快繁，试验证明鳞茎在58'C温箱中处理10-20min，再在38。C温度下热处理72h,结合0.2-0.4mm大小的茎尖培养，可获得完全脱去4种主要危害百合的病毒粒子，即百合无症病毒、百合花叶病毒、黄瓜花叶病毒和百合班驳病毒。
张明翰(张明翰，潘利军.百合种球脱病毒技术的初步研究.中国球根花丼年报，110-112)将荷兰进口的种球，采用剥茎尖与加热相结合的方法脱除影响百合生产品质的主要病毒，试验结果表明，用42-45。C热水处理茎尖，脱毒率可达90%以上，脱毒时间为25天。
发明内容
本发明的目的是提供一种成活率高，脱毒率高，成本低廉的百合种球病毒的脱除方法。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种百合种球病毒的脱除方法，采用暗培养，对无性繁殖系的组培苗两次剥取茎尖进行消毒并脱毒，茎尖的脱毒方式为l)茎尖热处理脱毒变温处理种球球芯3 5周，茎尖大小在0.4 1.0mm之间，温度范围为25 38'C; 2)茎尖化学药剂脱毒病毒唑浓度5 7mg/ml，茎尖大小在0.5-0.8mm之间，处理25 30天；或3)茎尖热处理结合化学药剂脱毒变温处理种球球芯3 5周，温度范围为25 -38'C，同时施以病毒唑脱毒，浓度为5 7mg/ml，茎尖大小为0.4 ~ 1.2mm。
本发明的目的还可釆用以下技术措施进一步实现。前述百合种球病毒的脱除方法，其是以鳞片为外植体，筛选芽诱导、芽增殖、生根的最佳培养基，并建立快速有效的无性繁殖系。
前述百合种球病毒的脱除方法，其中所述脱毒方法为1)茎尖
热处理脱毒变温处理种球球芯4周，茎尖大小在0.4 1.0mm之间，温度范围为25~38°C; 2)茎尖化学药剂脱毒病毒唑浓度6mg/ml，茎尖大小在0.5 0.8mm之间，处理28天；或3)茎尖热处理结合化学药剂脱毒变温处理种球球芯4周，温度范围为25~38°C,同时用病毒唑脱毒，浓度为6mg/ml，茎尖大小为0.4~ 1.2mm。
前述百合种球病毒的脱除方法，其中一次茎尖培养及消毒的步骤包括1)取经4r处理的抽芽，芽长4 8cm的鳞茎，从茎节处切下，剥除全部外部鳞片，仅留长度2~3cm的球芯；2)用中性洗涤剂洗净后，在流水中冲洗30min,用蒸馏水洗涤3次，每次lmin,投入0.1%升汞中消毒5min，然后用无菌水冲洗5次，每次3min; 3)用灭菌滤纸吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
前述百合种球病毒的脱除方法，其中二次茎尖培养及消毒的步骤包括1)将经过消毒并脱毒后的一次茎尖鳞片培养39 41d,开始出现膨胀，形成愈伤组织，转接到MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基中，于室温24 26。C下进行暗培养；2)培养29 31d，从愈伤组织上分化出不定芽，形成无根苗，剥取无根苗的茎尖即新生芽顶端白、亮的生长点进行消毒；3)消毒方式为2%次氯酸钠15分钟，处理三次，每次5分钟；4)用灭菌滤纸吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果
(1) 百合种球病毒的脱除方法具有高成活率、高脱毒率、低成
本的优点；
(2) 热处理脱毒的优越性在于比现有技术温度范围变幅大，有效降低了高温对种球的伤害；(3) 化学药剂脱毒的优越性在于比现有技术病毒唑浓度低。茎
尖规格大，操作较为简便易行；
(4) 热处理脱毒和化学药剂脱毒综合应用的优越性在于比现有技术病毒唑浓度低。茎尖规格大，温度比现有技术温度范围变幅大，操作十分简便易行。
图l为本发明百合种球病毒的脱除方法较佳实施例茎尖组培图，所示为鳞片产生小鳞茎；
图2为本发明百合种球病毒的脱除方法较佳实施例茎尖组培图，
所示为鳞片诱导出愈伤组织；
图3为本发明百合种球病毒的脱除方法较佳实施例茎尖组培图，所示为愈伤组织诱导产生小鳞茎；
图4为本发明百百合种球病毒的脱除方法的方法较佳实施例茎尖组培图，所示为茎尖诱导产生不定芽；
图5为本发明百合种球病毒的脱除方法的方法较佳实施例茎尖组培图，所示为剥取茎尖接种；
图6为本发明百合种球病毒的脱除方法较佳实施例茎尖组培图，所示为茎尖培养l个月；
图7为本发明百合种球病毒的脱除方法较佳实施例茎尖组培图，所示为茎尖培养2个月；
图8为本发明百合种球病毒的脱除方法较佳实施例茎尖组培图，所示为子鳞茎继代培养；
图9为本发明百合种球病毒的脱除方法较佳实施例茎尖组培图，所示为脱毒组培苗。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1热处理脱毒请参阅图1至图8所示，为本发明较佳实施例茎尖组培图，所示 分别为鳞片产生小鳞茎、鳞片诱导出愈伤组织、愈伤组织诱导产生小 鳞茎、茎尖诱导产生不定芽、剥取茎尖接种、茎尖培养l个月、茎尖 培养2个月、子鳞茎继代培养。
(1) 以鳞片为外植体，筛选芽诱导、芽增殖、生根的最佳培养 基，并建立快速有效的无性繁殖系。
(2) —次茎尖培养体系的建立及消毒，包括步骤1)取经4x: 处理的抽芽，芽长4cm的鳞茎，从茎节处切下，剥除全部外部鳞片， 仅留长度2cm的球芯；2)用中性洗涤剂(金鱼牌洗涤灵)洗净后， 在流水中冲洗30min，用蒸馏水洗涤3次，每次lmin，投入0.1%升 汞中消毒5min,然后用无菌水冲洗5次，每次3min; 3)用灭菌滤纸 吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
一次茎尖的脱毒脱毒方式为茎尖热处理脱毒茎尖大小为 0.7mm，变温处理种球球芯4周，温度范围为25 ~ 38°C 。 脱毒采用暗培养。
(3) 二次茎尖培养体系的建立及消毒，包括步骤l)将经过消 毒并脱毒后的一次茎尖鳞片培养39d，开始出现膨胀，形成愈伤组织， 转接到MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基中，于室温24。C下进 行暗培养；2)培养29d，从愈伤组织上分化出不定芽，形成无根苗， 剥取无根苗的茎尖即新生芽顶端白、亮的生长点进行消毒；3)消毒 方式为2%次氯酸钠15分钟，处理三次，每次5分钟；4)用灭菌滤 纸吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
二次茎尖的脱毒脱毒方式为茎尖热处理脱毒茎尖大小为 0.7mm，变温处理种球球芯4周，温度范围为25 ~ 38°C。 脱毒采用暗培养。
釆用以上方法对东方百合杂种系品种"西伯利亚"(Siberia)进 行了CMV、 LSV及LMoV病毒脱除，脱除率100%。
9请参阅图9所示，为本发明较佳实施例脱毒组培苗。
实施例2化学药剂脱毒
(1) 以鳞片为外植体，筛选芽诱导、芽增殖、生根的最佳培养 基，并建立快速有效的无性繁殖系。
(2) —次茎尖培养体系的建立及消毒，包括步骤1)取经化 处理的抽芽，芽长6cm的鳞茎，从茎节处切下，剥除全部外部鳞片， 仅留长度3cm的球芯；2)用中性洗涤剂(白猫牌洗涤灵)洗净后， 在流水中冲洗30min，用蒸馏水洗涤3次，每次lmin,投入0.1%升 汞中消毒5min，然后用无菌水冲洗5次，每次3min; 3)用灭菌滤纸 吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
一次茎尖的脱毒脱毒方式为茎尖化学药剂脱毒病毒唑浓度 6mg/ml，茎尖大小为0.6mm，处理28天脱毒釆用暗培养。 脱毒采用暗培养。
(3) 二次茎尖培养体系的建立及消毒，包括步骤1)将经过消 毒并脱毒后的一次茎尖鳞片培养40d,开始出现膨胀，形成愈伤组织， 转接到MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基中，于室温25。C下进 行暗培养；2)培养30d,从愈伤组织上分化出不定芽，形成无根苗， 剥取无根苗的茎尖即新生芽顶端白、亮的生长点进行消毒；3)消毒 方式为2%次氯酸钠15分钟，处理三次，每次5分钟；4)用灭菌滤 纸吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
二次茎尖的脱毒脱毒方式为茎尖化学药剂脱毒病毒唑浓度 6mg/ml，茎尖大小为0.6mm，处理28天。 脱毒采用暗培养。
采用以上方法对东方百合杂种系品种"索邦"(Sorbonne)进行 了 CMV、 LSV及LMoV病毒脱除，脱除率100%。 实施例3热处理脱毒和化学药剂脱毒的综合应用
(1)以鳞片为外植体，筛选芽诱导、芽增殖、生根的最佳培养基，并建立快速有效的无性繁殖系。
(2) —次茎尖培养体系的建立及消毒，包括步骤1)取经 处理的抽芽，芽长8cm的鳞茎，从茎节处切下，剥除全部外部鳞片， 仅留长度3cm的球芯；2)用中性洗涤剂(金鱼牌洗涤灵)洗净后， 在流水中冲洗30min，用蒸馏水洗涤3次，每次lmin，投入0.1%升 汞中消毒5min,然后用无菌水冲洗5次，每次3min; 3)用灭菌滤纸 吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
一次茎尖的脱毒脱毒方式为茎尖热处理脱毒结合化学药剂脱 毒变温处理种球球芯4周，温度范围为25 38'C，同时施以病毒唑， 浓度为6mg/ml，茎尖大小为0.8mm。
脱毒采用暗培养。
(3) 二次茎尖培养体系的建立及消毒，包括步骤1)将经过消 毒并脱毒后的一次茎尖鳞片培养41d，开始出现膨胀，形成愈伤组织， 转接到MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基中，于室温26。C下进 行暗培养；2)培养31d，从愈伤组织上分化出不定芽，形成无根苗， 剥取无根苗的茎尖即新生芽顶端白、亮的生长点进行消毒；3)消毒 方式为2%次氯酸钠15分钟，处理三次，每次5分钟；4)用灭菌滤 纸吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
二次茎尖的脱毒脱毒方式为茎尖热处理脱毒结合化学药剂脱 毒变温处理种球球芯4周，温度范围为25 38'C,同时施以病毒唑， 浓度为6mg/ml，茎尖大小为0.8mm。
脱毒采用暗培养。
釆用以上方法对OT百合杂种系品种"耶罗林"(Ydloweed)进 行了CMV、 LSV及LMoV病毒脱除，脱除率100%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种百合种球病毒的脱除方法，其特征在于，采用暗培养，对无性繁殖系的组培苗两次剥取茎尖进行消毒并脱毒，茎尖的脱毒方式为1)茎尖热处理脱毒变温处理种球球芯3～5周，茎尖大小在0.4～1.0mm之间，温度范围为25～38℃；2)茎尖化学药剂脱毒病毒唑浓度5～7mg/ml，茎尖大小在0.5～0.8mm之间，处理25～30天；或3)茎尖热处理结合化学药剂脱毒变温处理种球球芯3～5周，温度范围为25～38℃，同时用病毒唑脱毒，浓度为5～7mg/ml，茎尖大小为0.4～1.2mm。
2. 根据权利要求l所述的百合种球病毒的脱除方法，其特征在 于，所述脱毒方法为l)茎尖热处理脱毒变温处理种球球芯4周， 茎尖大小在0.4 1.0mm之间，温度范围为25 ~ 38°C; 2)茎尖化学药 剂脱毒病毒唑浓度6mg/ml，茎尖大小在0.5 ~ 0.8mm之间，处理28 天；或3)茎尖热处理结合化学药剂脱毒变温处理种球球芯4周，温 度范围为25 38。C，同时用病毒唑脱毒，浓度为6mg/ml，茎尖大小为 0.4- 1.2mm。
3. 根据权利要求1或2所述百合种球病毒的脱除方法，其特征 在于一次茎尖培养及消毒的步骤包括1)取经4"C处理的抽芽，芽长 4-8cm的鳞茎，从茎节处切下，剥除全部外部鳞片，仅留长度2~ 3cm的球芯；2)用中性洗涤剂洗净后，在流水中冲洗30min，用蒸 馏水洗涤3次，每次lmin，投入0.1%升汞中消毒5min,然后用无菌 水冲洗5次，每次3min; 3 )用灭菌滤纸吸干表面水分，为下一步脱
4. 根据权利要求1或2所述百合种球病毒的脱除方法，其特征 在于二次茎尖培养及消毒的步骤包括1)将经过消毒并脱毒后的一 次茎尖鳞片培养39 41d，开始出现膨胀，形成愈伤组织，转接到 MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L培养基中，于室温24 26。C下进行暗培养；2)培养29 31d，从愈伤组织上分化出不定芽，形成无根苗， 剥取无根苗的茎尖即新生芽顶端白、亮的生长点进行消毒；3)消毒 方式为2%次氯酸钠15分钟，处理三次，每次5分钟；4)用灭菌滤 纸吸干表面水分，为下一步脱毒做准备。
全文摘要
本发明提供了一种百合种球病毒的脱除方法，包括茎尖组培及消毒、热处理脱毒、化学药剂脱毒以及热处理脱毒和化学药剂脱毒的综合应用。该百合种球病毒的脱除方法兼具高成活率、高脱毒率、低成本的特征。
文档编号A01H4/00GK101658135SQ20091009197
公开日2010年3月3日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者吕英民, 张启翔, 张强英, 程堂仁, 郑丽娜 申请人:北京林业大学