一种茶花愈伤组织再生植株的方法

专利名称：一种茶花愈伤组织再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及山茶花组织培养方法，属于生物技术领域，是一种茶花愈伤组织再生植株的方法。
背景技术：
山茶花是我国的特色名贵花卉，也是世界闻名的观赏木本植物。茶花是园林绿化的重要 材料，具有花色美，花期长，叶片亮绿，树冠多姿，以及在高大树冠下能良好生长的习性， 被广泛利用于公园绿地、自然风景区和名胜古迹。山茶花亦是盆栽的佳品，某些矮生的灌木 型品种，常被作为盆栽应用。除了观赏价值外，山茶花还具有很高的经济价值，其花、根均 可入药，果实可榨油，金花茶的叶可代茶饮，辅助治疗高血压，花可治便血，花的红、黄色 浸提液可作食用色素。
为保持山茶花品种亲本的优良性状，茶花的繁殖通常不采用实生籽播苗方式，况且玫瑰 重瓣、完全重瓣型等山茶花品种因雌、雄蕊完全退化而不能结实。采用扦插和嫁接方式，对 于一些稀有的山茶花品种來说，其繁殖系数较低，难以进行规模化生产，实现产业化目的。
利用愈伤组织途径再生不定芽可获得大量的无性分株，是茶花快速繁殖及遗传转化的必 要手段。在山茶花中诱导愈伤组织常用的外植体是叶和茎段，也有少数用花瓣和小孢子的。 Pedroso等(1993)以50龄红山茶成年树的叶片为外植体，发现在叶柄和主叶脉处易形成愈 伤组织。Shults等(1996)以红山茶的花瓣为外植体，在含BA和NAA的培养基上愈伤组织 有较好的生长，但未获得其再生植株。隆振雄(1981)将油茶的花粉作为外植体，可在合适 的培养基上获得较高愈伤组织诱导频率，并且获得了绿芽点和根，但因污染而未能获得完整 的再生植株。
目前还未见从茶花愈伤组织中获得不定芽的报道，也未见专利申请。因此本发明为满足 稀有茶花品种的市场需要提供了一条有效的途径，同时也为茶花分子育种奠定基础。

发明内容
本发明的目的是针对山茶花愈伤组织诱导和再生植株十分困难技术瓶颈，提供一种茶花 愈伤组织再生植株的方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现这种茶花愈伤组织再生植株的方法，该方法按以 下歩骤进行(1) 将山茶花果实用自来水冲洗干净，再用洗衣粉浸泡10分钟，自来水冲洗；然后转 移到无菌超净台上去除果皮后，用体积比为75%的乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2遍， 用重量比为0.1X的HgCl2中浸泡15—20分钟，无菌水冲洗5—6遍；
(2) 剥去种子的内外种皮，接种在1/2MS培养基上；
(3) 无菌苗长至3厘米以上时，将小植株幼嫩叶片和茎段接种在愈伤组织诱导培养基上， 愈伤组织诱导培养基为MS+ 0.5mg'L—'6-BA+l,0 mg'L"2，4-D;
(4) 愈伤组织长至直径为1厘米大小时，转移至愈伤组织分化培养基上，愈伤组织分化 培养基为MS+mg'L-l6-BA20 + 0.1 mg'L"IBA+mg.L"KT0.1; '
(5) 不定芽长至0.5cm时进行分离，壮芽培养基为MS+0.2 mg.L"6-BA+0.05 mg丄"NAA;
(6) 当芽条长至4—5cm时，切掉芽条基部，以1000g'L"的IBA浸泡芽条的基部，然 后接种在MW+0.2 mg七"IBA+0.2 mg'L"NAA的培养基上。
作为优选，所述的山茶花果实为9月份采集的成熟果实。
作为优选，所述的培养条件为培养温度为25±2"，光照光强为2500 3000 Lx，光照时 间为12h/d。
本发明的有益效果是目前还没有从山茶花愈伤组织诱导不定芽和植株再生的报道。本
发明培养基配方简单，操作工艺简便，培养时间短，再生频率高，扩繁系数大，有利于大规 模生产珍稀山茶花植株及实现外源基因的遗传转化。
具体实施例方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
本发明所述的这种茶花愈伤组织再生植株的方法，材料为浙江红山茶9月成熟果实。将 采集的果实用自來水冲洗干净，再用洗衣粉浸泡10分钟，自来水冲洗。然后转移到无菌超净 台上去除果皮后，用体积比为75%乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2遍，重量比为0.1%的 HgCl2中浸泡15——20分钟，无菌水冲洗5——6遍。剥去内外种皮后接种在1/2MS培养基 上，培养温度为25±2"，光照光强为2500 3000Lx，光照时间为12h/d，以下的培养条件都 相同。
培养2周后实生苗长至3厘米高，将小植株幼嫩叶片和茎段接种在愈伤组织诱导培养基 上，愈伤组织诱导培养基为MS+0.5mg'L—'6-BA+1.0mg'L—'2,4-D。培养一周后，叶切块开始皱 起，半月后边缘有少量愈伤组织长出，l个月后愈伤组织直径达l厘米左右。愈伤组织在分化培养基培养约半月后形成颗粒状小突起，即生长点，再经培养后分化成 不定芽， 一块愈伤组织上可形成大量不定芽，在切除较大的芽后，还有不定芽不断的分化出 来，最佳的培养基是MS+20mg.L—^-BA+(U mg.L"lBA+0.1 mg丄"KT。
培养半月后，不定芽长至0.5cm即可分离，在壮芽培养基MS+0.2 mg丄"6-BA十 0.05mg丄—'NAA上培养1个月后芽条可长至4——5cm,切掉芽条基部，以1000g丄"的IBA 浸泡芽条的基部，然后接种在MW+0.2 mg丄"IBA十0.2mg，L"NAA的培养基上，培养1个月 后根系较发达，生根率达100%。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技 术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
1、一种茶花愈伤组织再生植株的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行(1)将山茶花果实用自来水冲洗干净，再用洗衣粉浸泡10分钟，自来水冲洗；然后转移到无菌超净台上去除果皮后，用体积比为75％的乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2遍，用重量比为0.1％的HgCl2中浸泡15-20分钟，无菌水冲洗5-6遍；(2)剥去种子的内外种皮，接种在1/2MS培养基上；(3)无菌苗长至3厘米以上时，将小植株幼嫩叶片和茎段接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基为MS+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-12，4-D；(4)愈伤组织长至直径为1厘米大小时，转移至愈伤组织分化培养基上，愈伤组织分化培养基为MS+mg·L-16-BA20+0.1mg·L-1IBA+mg·L-1KT0.1；(5)不定芽长至0.5cm时进行分离，壮芽培养基为MS+0.2mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA；(6)当芽条长至4-5cm时，切掉芽条基部，以1000g·L-1的IBA浸泡芽条的基部，然后接种在MW+0.2mg·L-1IBA+0.2mg·L-1NAA的培养基上。
2、 根据权利要求1所述的茶花愈伤组织再生植株的方法，其特征在于所述的山茶花果 实为9月份采集的成熟果实。
3、 根据权利要求1所述的茶花愈伤组织再生植株的方法，其特征在于所述的培养条件 为培养温度为25±2°C，光照光强为2500 3000Lx，光照时间为12h/d。
全文摘要
本发明主要涉及一种茶花愈伤组织再生植株的方法，按以下步骤进行剥去山茶花果实种子的内外种皮，接种在1/2MS培养基上；无菌苗长至3厘米以上时，将小植株幼嫩叶片和茎段接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基为MS+0.5mg·L^-16-BA+1.0mg·L^-12，4-D；愈伤组织长至直径为1厘米大小时，转移至愈伤组织分化培养基上，愈伤组织分化培养基为MS+mg·L^-16-BA20+0.1mg·L^-1IBA+mg·L^-1KT0.1；不定芽长至0.5cm时进行分离，壮芽培养基为MS+0.2mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA；当芽条长至4-5cm时，切掉芽条基部，以1000g·L^-1的IBA浸泡芽条的基部，然后接种在MW+0.2mg·L^-1IBA+0.2mg·L^-1NAA的培养基上。本发明的有益效果是本发明培养基配方简单，操作工艺简便，培养时间短，再生频率高，扩繁系数大，有利于大规模生产珍稀山茶花植株及实现外源基因的遗传转化。
文档编号A01H4/00GK101558742SQ200910098398
公开日2009年10月21日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者李纪元, 李辛雷, 敏 田, 范正琪 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所