专利名称：大黄鱼雌核发育的诱导方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类雌核发育诱导方法，尤其是涉及一种用遗传失活的黄姑鱼(AWe" <3/&y ora)精子诱导大黄鱼(i^eMdasc/ae"acrocea)雌核发育的方法。
背景技术：
在海水鱼类种苗生产中，通过对大黄鱼雌核发育进行人工诱导，其产生后代只有母本基 因，可快速纯化种质，加快育种速度，实现单性养殖。公告号为CN1586430的发明专利提供 一种石首鱼类精子激发大黄鱼雌核发育二倍体的诱导方法，将精卵混合后，用海水激活，将 受精卵用静水压休克实现染色体组加倍。该发明提供了6个实施例，分别采用了浅色黄姑鱼 和眼斑拟石首鱼2种石首鱼类精子激活了大黄鱼卵，结合静水压休克得到了大黄鱼雌核发育 二倍体。该方法的不足之处在于培育出来的雌核发育二倍体常常带有父本物种基因。研究 发现，按该方法将黄姑鱼精子与大黄鱼卵子混合海水激活后，施以静水压处理，结果全部仔 鱼都含有整个的黄姑鱼基因组，为异源三倍体。
许建和等([2]许建和，尤锋，吴雄飞，等.大黄鱼雌核发育二倍体的人工诱导[J].海洋 科学，2006, 30(12): 37 42)分别于2006年和2007年(5] Xu J H， You F， Yan B L， W a/. Effects of ultra violet irradiation on sperm motility and diploid gynogenesis induction in large yellow croaker(/^eMfi/losrz'aeMa crocea) undergoing cold shock[J]. Aquae Int， 2007， 15: 371 382.)报道了
应用同种精子诱导大黄鱼雌核发育的方法先用紫外线失活大黄鱼精子染色体，再用冷休克 的方法诱导雌核发育卵染色体组加倍。应用同种精子诱导雌核发育，常常会混有普通二倍体。 即少量精子未被遗传失活，导致卵子正常受精，产生两性融合的普通二倍体。例如，王晓清 等([4]王晓清，王志勇，柳小春，等.大黄鱼人工诱导雌核发育后代的微卫星标记分析[J].遗 传，2006， 28(7): 831 837; [7]王晓清，王志勇，柳小春，等.人工雌核发育大黄鱼 (i^ew^wdae"flcrace")的APLP分析[J].海洋与湖沼，2007, 38(1): 22 28.)发现，在所分析的 两个大黄鱼异质雌核发育家系中，有一个家系混有12.5%的普通二倍体。因此，用同种精子 诱导大黄鱼雌核发育的不足之处在于诱导产物必须逐尾进行复杂且工作量巨大的遗传鉴定， 鉴别出雌核发育二倍体和混杂在其中的普通二倍体。 发明内容本发明的目的在于提供一种可以排除异种基因污染，产物鉴定简便的大黄鱼雌核发育的 诱导方法。
本发明包括以下步骤
1) 黄姑鱼精子的遗传失活取黄姑鱼精液经稀释液稀释后，调整厚度至0.5 lmm，置 于紫外灯下照射；
2) 卵子雌核发育的启动取大黄鱼卵子及经步骤l)遗传失活的黄姑鱼精液混合后，加 入海水，启动大黄鱼卵的雌核发育；
3) 雌核发育单倍体的染色体组加倍。
所述稀释液最好为NaC17.5g、 KC10,2g、 CaCl2 0.2g、 NaHC03 0.2g，加水定容至1L， 稀释的倍数最好为20 35倍；紫外线照射的剂量最好为50000 600000 nW/cm2。
所述经步骤1)遗传失活的黄姑鱼精液的加入量最好为每克大黄鱼卵加入0.05 0.5 ml 遗传失活黄姑鱼精液。
所述海水的温度最好为18 28'C。
所述雌核发育单倍体的染色体组加倍可采用以下方法
用冷休克处理抑制激活卵子的第2次减数分裂；或
用冷休克处理抑制第1次有丝分裂；或
用静水压休克处理抑制激活卵子的第2次减数分裂；或
用静水压休克处理抑制激活卵子的第1次有丝分裂。
所述冷休克处理抑制激活卵子的第2次减数分裂的方法是卵子启动后0.5 6min，转移 到1 5'C海水中，静置5 20min，再转移到室温海水中。
所述冷休克处理抑制第1次有丝分裂的方法是卵子启动后31~65 min，转移到0 5°C 下海水中，静置5 20min，再转移到室温海水中。
所述的静水压休克处理抑制激活卵子的第2次减数分裂的方法是卵子启动后0.5 6 min，施予35 45MPa静水压2 5min，再撤去压力，转移到室温海水中。
所述的静水压休克处理抑制激活卵子的第1次有丝分裂的方法是卵子启动后31 65min，施予35 45MPa静水压2 5min，再撤去压力，转移到室温海水中。
研究发现，黄姑鱼养殖产业化程度高，取材方便；黄姑鱼与大黄鱼繁殖季节重叠，增养 殖技术成熟，易于同时取得大黄鱼卵子与黄姑鱼精子；大黄鱼(？)与黄姑鱼(3)杂交受精 率很高，与大黄鱼同种自繁相当，不存在配子不亲和现象；大黄鱼(？)与黄姑鱼(c )杂交 F,初孵仔鱼没有出现单倍体综合症，经分子遗传标记分析证明大黄鱼(？)与黄姑鱼(3)杂交Fi初孵仔鱼同时含有双亲基因，为异源二倍体；这些异源二倍体在l月龄全部死亡。
本发明首先用紫外线辐射黄姑鱼精液，失活黄姑鱼精子的遗传物质，再用冷休克或静水 压休克抑制激活卵子的第2次减数分裂或第1次有丝分裂，产生雌核发育二倍体。与现有大 黄鱼雌核发育诱导方法相比，本发明的突出优点在于
1) 使用紫外线对黄姑鱼精液进行遗传失活，排除了异源精子遗传物质的污染，提高诱导 雌核发育的效率。
2) 诱导产物遗传鉴定简便。大黄鱼与黄姑鱼杂交所得异源二倍体无法存活，在养殖过程 中会被自然淘汰。杂交经过加倍所得异源三倍体适合度极低，即使有少量存活，仅需要使用 种间标记或倍性分析即可鉴别雌核发育二倍体和异源三倍体，简化了诱导产物遗传鉴定程序。
具体实施方式
实施例1
1、 黄姑鱼精子的遗传失活。取黄姑鱼精液经稀释液稀释30倍后，将精液厚度调整为 0.5mm后，置于紫外灯下照射，紫外线照射剂量达到25380(HiW/cn^停止照射。
2、 卵子雌核发育的启动。取100g大黄鱼卵子，加入10 ml步骤1所述的遗传失活黄姑 鱼精液混匀，加入22'C的海水，启动大黄鱼卵子雌核发育，并开始计时。对照组按王军提供 方法实施取100g大黄鱼卵子，加入10ml未经遗传失活的普通黄姑鱼精液混合，加入22'C 的海水，启动大黄鱼卵子发育，并开始计时。
3、 染色体组加倍。步骤2所计时间至3min时，将步骤2所得的大黄鱼已启动发育卵子 转移到3'C的海水中，静置10min,然后转移到室温海水中充气培育至孵化。初孵仔鱼期，取 样经倍性分析仪分析和AFLP标记分析，结果表明，黄姑鱼精子经紫外线失活后，后代全部 为雌核发育二倍体，不含有黄姑鱼基因。而按王军等提供方法培育的对照组，全部个体都含 有黄姑鱼基因，且含有3个基因组，为异源三倍体。
实施例2
1、 黄姑鱼精子的遗传失活。取黄姑鱼精液经稀释液稀释35倍后，将精液厚度调整为 0.6mm后，置于紫外灯下照射，紫外线照射剂量达到50000nW/ci^停止照射。
2、 卵子雌核发育的启动。取100g大黄鱼卵子，加入50 ml步骤1所述的遗传失活黄姑 鱼精液混匀，加入18'C的海水，启动大黄鱼卵子雌核发育，并开始计时。
3、 染色体组加倍。步骤2所计时间至6min时，将步骤2所得的大黄鱼已启动发育卵子 转移到5。C的海水中，静置20min，然后转移到室温海水中充气培育至孵化。初孵仔鱼期，取 样经倍性分析仪分析和微卫星标记分析结果表明，全部样品为雌核发育二倍体，不含有黄姑鱼基因。
实施例4
按实施例l方法操作，仅将步骤3中所述的3'C海水处理起始时间更改为卵子启动46min。 初孵仔鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记分析结果表明，全部样品为雌核发育二倍 体，不含有黄姑鱼基因。
实施例5
按实施例l方法操作，仅将步骤3中所述的3'C海水处理起始时间更改为卵子启动31min。 初孵仔鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记分析结果表明，全部样品为雌核发育二倍 体，不含有黄姑鱼基因。
实施例6
按实施例1方法操作，仅将步骤3中所述的3'C海水处理起始时间更改为卵子启动65 min。 初孵仔鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记分析结果表明，全部样品为雌核发育二倍 体，不含有黄姑鱼基因。
实施例7
按实施例1中步骤1和步骤2操作得到大黄鱼雌核发育单倍体卵，在卵子启动0.5 min， 施予40MPa静水压3min，再撤去压力。初孵仔鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记 分析结果表明，全部样品为雌核发育二倍体，不含有黄姑鱼基因。
实施例8
按实施例1中步骤1和歩骤2操作得到大黄鱼雌核发育单倍体卵，在卵子启动6 min，施 予35 MPa静水压5min，再撤去压力。初孵仔鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记分 析结果表明，全部样品为雌核发育二倍体，不含有黄姑鱼基因。
实施例9
按实施例1中步骤1和步骤2操作得到大黄鱼雌核发育单倍体卵，在卵子启动3 min，施 予45 MPa静水压2min，再撤去压力。初孵仔鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记分 析结果表明，全部样品为雌核发育二倍体，不含有黄姑鱼基因。
实施例10
按实施例7方法操作，仅将步骤3中所述施压起始时间更改为卵子启动46min，初孵仔 鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记分析结果表明，全部样品为雌核发育二倍体，不 含有黄姑鱼基因。
实施例11按实施例8方法操作，仅将步骤3中所述施压起始时间更改为卵子启动32min，初孵仔 鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记分析结果表明，全部样品为雌核发育二倍体，不 含有黄姑鱼基因。
实施例12
按实施例9方法操作，仅将步骤3中所述施压起始时间更改为卵子启动65 min，初孵仔 鱼期，取样经倍性分析仪分析和微卫星标记分析结果表明，全部样品为雌核发育二倍体，不 含有黄姑鱼基因。
权利要求
1.大黄鱼雌核发育的诱导方法，其特征在于包括以下步骤1)黄姑鱼精子的遗传失活取黄姑鱼精液经稀释液稀释后，调整厚度至0.5～1mm，置于紫外灯下照射；2)卵子雌核发育的启动取大黄鱼卵子及经步骤1)遗传失活的黄姑鱼精液混合后，加入海水，启动大黄鱼卵的雌核发育；3)雌核发育单倍体的染色体组加倍。
2. 如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育的诱导方法，其特征在于所述稀释液为NaCl 7.5 g、 KC1 0.2 g、 CaCl2 0.2g、 NaHC03 0.2g，加水定容至1L。
3. 如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育的诱导方法，其特征在于所述稀释的倍数为20 35倍。
4. 如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育的诱导方法，其特征在于所述紫外线照射的剂量 为50000 600000 nW/cm2。
5. 如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育的诱导方法，其特征在于所述经步骤l)遗传失 活的黄姑鱼精液的加入量为每克大黄鱼卵加入0.05 0.5 ml遗传失活黄姑鱼精液。
6. 如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育的诱导方法，其特征在于所述海水的温度为18 28。C。
7. 如权利要求1所述的大黄鱼雌核发育的诱导方法，其特征在于所述雌核发育单倍体的 染色体组加倍采用以下方法用冷休克处理抑制激活卵子的第2次减数分裂；或 用冷休克处理抑制第1次有丝分裂；或 用静水压休克处理抑制激活卵子的第2次减数分裂；或 用静水压休克处理抑制激活卵子的第1次有丝分裂。
8. 如权利要求7所述的大黄鱼雌核发育的诱导方法，其特征在于所述冷休克处理抑制激 活卵子的第2次减数分裂的方法是卵子启动后0.5 61^11，转移到1 5'C海水中，静置5 20min，再转移到室温海水中；所述冷休克处理抑制第1次有丝分裂的方法是卵子启动后31 65 min，转移到0 5°C 下海水中，静置5 20min，再转移到室温海水中；所述的静水压休克处理抑制激活卵子的第2次减数分裂的方法是卵子启动后0.5 6min,施予35 45MPa静水压2 5min，再撤去压力，转移到室温海水中；所述的静水压休克处理抑制激活卵子的第1次有丝分裂的方法是卵子启动后31 65min，施予35 45MPa静水压2 5min，再撤去压力，转移到室温海水中。
全文摘要
大黄鱼雌核发育的诱导方法，涉及一种鱼类雌核发育诱导方法。提供一种可排除异种基因污染，产物鉴定简便的大黄鱼雌核发育的诱导方法。取黄姑鱼精液稀释后，调整厚度，置于紫外灯下照射；取大黄鱼卵子和遗传失活的黄姑鱼精液混合后加入海水，启动大黄鱼卵的雌核发育；雌核发育单倍体的染色体组加倍。使用紫外线对黄姑鱼精液进行遗传失活，排除异源精子遗传物质的污染，提高诱导雌核发育的效率。诱导产物遗传鉴定简便。大黄鱼与黄姑鱼杂交所得异源二倍体无法存活，在养殖过程中会被自然淘汰。杂交经过加倍所得异源三倍体适合度极低，即使有少量存活，仅需要使用种间标记或倍性分析即可鉴别雌核发育二倍体和异源三倍体，简化了诱导产物遗传鉴定程序。
文档编号A01K61/00GK101574069SQ20091011198
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者王志勇, 蔡明夷 申请人:集美大学