藻培养物生产、收获和加工的制作方法

专利名称：藻培养物生产、收获和加工的制作方法
藻培养物生产、收获和加工
本申请要求2008年1月25日提交的美国临时专利申请61/023，572的优先权，将 其整体并入。
背景技术：
日益增长的全球性需求和环境问题已经导致寻找燃料、动物饲料、药物、营养制 品、多不饱和脂肪酸、植物营养物、矿物质、维生素和其它产品的替代性的且更绿色的来源。 这些产品的一种环境来源是藻。藻是一种特别有吸引力的来源，因为藻可以使用通常不能 用于食品生产或其它目的的陆地来生长。但是，从藻生产这些产品存在几个障碍，包括选择 合适的藻、为最佳的脂质产量开发合适的生长条件、和预防不希望的藻物种及其它生物的 污染。当追求在户外场所大规模培养藻时，天气和污染是恒定的威胁，这些障碍会倍增。因 此，强烈需要新的藻生产技术。发明内容
本发明提供了选择性地培养目标藻的方法。该方法包含，在第一个水塘中培养目 标藻；在第一个水塘中稀释目标藻；给第一个水塘供应营养物组合物；和在第一个水塘中 维持培养选择性。该方法和本发明的其它方法可以用于生产生物燃料(例如生物柴油)用 的脂质和多不饱和脂肪酸(例如ω-3脂肪酸)用的脂质。该方法和本发明的其它方法也 可以用于生产原料例如动物饲料和水产养殖饲料。该方法和本发明的其它方法可以用于生 产植物营养物例如胡萝卜素和虾青素。
本发明提供了选择性地培养栅藻属(kenedesmus)的目标藻的方法。该方法包 含，在第一个水塘中培养目标藻；在第一个水塘中稀释目标藻；给第一个水塘供应营养物 组合物；和在第一个水塘中维持培养选择性。
本发明提供了选择性地培养目标藻斜生栅藻(kenedesmus obliquus)的方法。该 方法包含，在第一个水塘中培养目标藻；在第一个水塘中稀释目标藻；给第一个水塘供应 营养物组合物；和在第一个水塘中维持培养选择性。
本发明提供了选择性地培养目标藻斜生栅藻的方法。该方法包含下述步骤。在 管道水塘中培养目标藻。如果达到约8. 5或更高的pH，给管道水塘添加二氧化碳。如果达 到33°C或更高的温度，给管道水塘添加冷却液。大约每20小时，将管道水塘中的藻稀释约 60%。在几乎与稀释步骤同时，给管道水塘供应营养物组合物，其中所述营养物组合物包含 碳酸氢钠、尿素、磷酸三钠和氯化亚铁，碳酸氢钠浓度是至少2mM，氮磷比是至少约15 1。 将在稀释步骤中得到的藻体积排入缺乏氮的应激水塘。从应激水塘收获藻，并脱水。从藻 提取脂质。
本发明提供了生物燃料、原料、多不饱和脂肪酸、植物营养物、和通过本发明的任 意方法生产的任何其它有用的产物。
本发明提供了包含目标藻的选择性的户外水塘藻培养物。所述目标藻可以是绿 藻。所述绿藻可以属于栅藻属。所述目标藻可以是硅藻。所述水塘可以是管道水塘。
具体实施方式
根据本发明提供了选择性地培养用于脂质生产的目标藻的方法。该方法和本发明 的其它方法可以用于生产生物燃料(例如生物柴油)用的脂质和多不饱和脂肪酸(例如 ω-3脂肪酸)用的脂质。该方法和本发明的其它方法可以用于生产原料例如动物饲料和水 产养殖饲料。该方法和本发明的其它方法可以用于生产植物营养物例如胡萝卜素和虾青素。
目标藻可以是任意合适的藻物种或其一个或多个株。也就是说，尽管目标藻通常 是单一的藻物种，在有些实施方案中，它可以是两个或多个藻物种和/或其株的组合。目标 藻优选包含在合适条件下能生产高水平的脂质的藻。
目标藻可以包含至少一种绿藻。在有些实施方案中，目标藻是硅藻。从任意天然 的或人造的来源，可以得到、分离和驯化目标藻。在有些实施方案中，从藻培养物生产位置 当地的来源得到藻。在有些实施方案中，从美国路易斯安那州得到目标藻。在有些实施方 案中，在路易斯安那州查尔斯湖中或其附近得到目标藻。目标藻可以是集群的藻。目标藻 的分离和纯化可以通过吸量管、培养基、光和温度方法来进行。在有些实施方案中，分离的 和纯化的目标藻株可以在更低的温度(例如10°c以下)存活几天。目标藻株的驯化可以包 括，在更低的温度处理该株，更少的光源和最小营养培养基。可以在5ml培养基中培养纯化 的藻株，然后放大到数千升培养基、天然水或处理过的水。从清洁水例如反渗透(RO)或蒸 馏水，可以制备纯种培养物。然后可以将目标藻株引入过滤的或未过滤的源水或处理过的 水，进行驯化。可以将纯种培养物的等分试样维持在清洁水中作为储用培养物。
在有些实施方案中，目标藻包含栅藻属的一种或多种绿藻或其任意组合。在有 些实施方案中，绿藻包含斜生栅藻。在有些实施方案中，绿藻选自斜生栅藻，四尾栅藻 (Scenedesmus quadricauda)，最大栅藻(Scenedesmus maximus)，被甲栅藻(Scenedesmus aramatus)，奥波莱栅藻(Scenedesmus opoliensis)，二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)， 及其任意组合。可以使用这些物种的变种。例如，可以采用四尾栅藻最大变种(kenedesmus quadricauda maximus)。斜生栅藻可以例如包含斜生栅藻德克萨斯大学(UTEX)株1450。
根据本发明也可以采用非栅藻的藻和其它水产养殖微生物。在有些实施方案中， 目标藻包含小球藻属的一种或多种绿藻例如微小小球藻(Chlorellaminutissima)或其任 意组合。在有些实施方案中，目标藻包含葡萄藻属(Botryococcus)的一种或多种绿藻例如 布朗葡萄藻(Botryococcus braunii),苏韦迪葡萄藻(Botryococcus sueditica),或其任 意组合。在有些实施方案中，目标藻包含衣藻属(Chlamydomonas)的一种或多种绿藻或其 任意组合。在有些实施方案中，目标藻包含新月藻属(Closterium)的一种或多种绿藻或其 任意组合。在有些实施方案中，目标藻包含盘星藻属(Pediastrum)的一种或多种绿藻或其 任意组合。在有些实施方案中，目标藻包含直链藻属(Melosira)的一种或多种绿藻或其任 意组合。在有些实施方案中，目标藻包含鞘藻属(Oedogonium)的一种或多种绿藻或其任意 组合。在有些实施方案中，目标藻包含红球藻属(Haematococcus)的一种或多种绿藻例如 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)或其任意组合。在有些实施方案中，目标藻包含杜 氏藻属(Dunaliella)的一种或多种绿藻例如杜氏盐藻(Dunaliella salina)，杜氏帕尔藻 (Dunealiella parva)，杜氏绿藻(Dunealiella viridis)或其任意组合。在有些实施方案中，目标藻包含金藻属(Isochrysis)的一种或多种定鞭(Prymnesiophycean)绿藻例如球 等鞭金藻(Isochrysis galpana)或其任意组合。在有些实施方案中，目标藻包含四鞭藻属 (Tetraselmis)白勺—禾中$$禾中#參录(Prasinophycean) UMiMU^t^jmM (Tetraselmis suecica)或其任意组合。在有些实施方案中，目标藻包含一种或多种硅藻。硅藻的实例包 括、但不限于，骨条藻属(Skeletonema)的那些例如中肋骨条藻(Skeletonema costatum)， 角毛藻属(Chaetoceros)的那些例如钙质角毛藻(Chaetoceros calcitrans)，或其任意组 合。通过替换或添加其它本文所述的或其他方式已知的藻，也可以使用本文针对一种特定 藻所述的本发明的方法。
在有些实施方案中，从基本上纯的培养物生产目标藻。在有些实施方案中，从一群 藻培养物选择目标藻。第一个水塘中的目标藻可以在第一个水塘中维持任意合适的时间。 通过放大目标藻的种子培养物，在第一个水塘中培养目标藻，可以达到第一个水塘中的藻 培养物体积。在有些实施方案中，放大步骤包含两步或多步连续更大体积的目标藻。
根据本发明的培养选择性不需要单种培养目标藻。培养选择性的维持包含，使目 标藻作为优势藻维持在第一个水塘的藻培养物中。可以存在暂时的培养选择性丧失，例如， 当放大藻培养物时，或在天气或其它事件过程中或之后。在有些实施方案中，使目标藻维持 在总藻的至少50%。在有些实施方案中，使目标藻维持在总藻的至少75%。在有些实施方 案中，使目标藻维持在总藻的至少90%。在有些实施方案中，使目标藻维持在总藻的至少 95%。在有些实施方案中，使目标藻维持在总藻的至少99%。开放的水塘培养物可以包含 100%纯的目标藻株，或可以是至少90%纯的。在有些实施方案中，开放的水塘培养物可以 是至少50%纯的。在有些实施方案中，为了研究或一般的生产目的，与目标藻一起培养其它 藻物种。
选择性地培养目标藻的方法包含，在第一个水塘中培养目标藻；在第一个水塘中 稀释目标藻；给第一个水塘供应营养物组合物；和在第一个水塘中维持培养选择性。在有 些实施方案中，供应营养物组合物步骤几乎与稀释步骤同时进行。在有些实施方案中，使培 养物的PH维持在约pH 6至约pH 8。该方法可以另外包含下述步骤如果达到约8. 5或更 高的pH，给第一个水塘添加二氧化碳。添加二氧化碳来维持pH，可以联合或独立于使用二 氧化碳作为营养物来源来进行。
该方法可以另外包含下述步骤如果达到33°C或更高的温度，给第一个水塘添加 冷却液。在有些实施方案中，冷却液包含新鲜的培养基。当提及“培养基”时，可以采用任 意合适的一种或多种培养基，除非另有说明。例如，可以使用含有5mM碳酸氢钠、ImM尿素 (或硝酸钠或氨水)、30_磷酸三钠和2-氯化亚铁的培养基。在有些实施方案中，使用反渗 透水来制备培养基。
本发明可以采用任意合适的营养物组合物。在有些实施方案中，营养物组合物包 含浓度为至少约0. 6mM的碳酸氢钠，这是在向水塘加入营养物组合物后测得。在有些实施 方案中，营养物组合物包含浓度为至少约2mM的碳酸氢钠，这是在向水塘加入营养物组合 物后测得。营养物组合物可以包含铁源。在有些实施方案中，铁源包含氯化亚铁。营养物 组合物可以包含氮源和磷源。在有些实施方案中，氮源包含尿素，磷源包含磷酸三钠。在有 些实施方案中，氮磷比是至少约15 1。在有些实施方案中，该比例是至少约四1。在 有些实施方案中，该比例是约30 1。8
任意合适的结构或结构的组合可以用于第一个水塘。第一个水塘可以是管道水 塘。管道水塘提供了管壳，其允许培养的目标藻在回路中移动。可以采用任意合适的回路 几何形状。例如，管道水塘的形状可以接近赛车道或跑道的形状。水塘可以包含平行矩形 通道，在任一端用半圆形或足够弯曲的通道连接平行矩形通道的相邻端，形成连续的通道。 管道水塘可以包含一个或多个相同或不同尺寸的通道。在有些实施方案中，将水塘均勻地 分成2个通道，每个通道的宽度在整个水塘行程中保持恒定。
第一个水塘可以包含透明的管壳。管壳可以是完全或部分透明的。在有些实施方 案中，透明的管壳包含丙烯酸聚合物。但是，允许光透过的任意合适的材料可以用于透明的管壳。
第一个水塘的大小可以是任意合适的大小。提供至少能容纳藻培养物体积的水塘 体积(容量)。水塘的体积可以包含另外的体积，以便允许沉淀和其它液体进入，使溢流最 小化或消除溢流。例如，22升容量的水塘可以合适地容纳约18升的藻培养物体积。在有些 实施方案中，第一个水塘的藻培养物体积是约18升或更多。在有些实施方案中，第一个水 塘的藻培养物体积是约600升或更多。在有些实施方案中，第一个水塘的藻培养物体积是 约14，000升或更多。
第一个水塘中藻培养物的深度是任意合适的深度。提供能使藻量与藻接近阳光相 平衡的深度。在有些实施方案中，第一个水塘包含约13至20厘米的平均藻培养物深度。在 有些实施方案中，平均藻培养物深度是约18厘米。
可以在任意合适的速度混合第一个水塘中的目标藻。合适的速度可以是允许藻细 胞接近阳光和营养物的速度。在有些实施方案中，在约12cm/秒、约15cm/秒或约18cm/秒 的速度混合目标藻。混合可以由任意合适的装置来提供。在有些实施方案中，使用一个或 多个明轮，提供混合。新鲜的培养物和培养基紧挨着明轮在其前面加入。在有些实施方案 中，明轮具有至少6个桨和在每个桨的末端之间的支柱。可以这样放置明轮，使它跨水塘壁 的中间分界线并在其外面。在有些实施方案中，这样放置明轮，使它能在通道曲线之前推动 培养物最大的距离。采用的明轮的数目可以依赖于水塘的宽度。在有些实施方案中，采用1 至3个明轮。如果使用超过一个明轮，可以平行地放置它们。明轮的数目和定位可以随制 备明轮所用的材料和其强度而变化。
可以以任意合适的频率，将第一个水塘中的目标藻稀释至任意合适的程度。稀释 可以是连续的、基本上连续的或间断的。在有些实施方案中，相对不频繁地取出相对大体积 的藻培养物。在有些实施方案中，相对频繁地取出相对小体积的藻培养物。目标藻可以用 任意合适的装置来稀释。可以加入培养基来稀释藻培养物，可以取出藻细胞，或可以通过其 组合进行稀释。藻培养物的取出和培养基的添加不需要是同时的。可以在任意合适的数量 稀释目标藻，以维持藻在第一个水塘中基本上稳定的生长，以及利用第一个水塘的藻用于 其它用途。在有些实施方案中，在第一个水塘中度过的时间的至少一部分，藻的生长是对数 的。在有些实施方案中，稀释步骤包含，在第一个水塘中稀释目标藻，稀释度从约35%至约 60%。在有些实施方案中，稀释度是约50%。在有些实施方案中，大约每20小时进行稀释。 使用任意合适的方法，可以测量藻浓度。在有些实施方案中，当透明度(黑色和白色)板读 数是5-6cm时(当该板不再可见时)，进行稀释。在有些实施方案中，第一个水塘中的藻浓 度维持在约2百万至约3百万藻/ml的范围。从第一个水塘取出的藻培养物的体积可以依赖于稀释度百分比和培养物体积。该体积可以是第一个水塘总培养物体积的超过约20%且 小于约60%。取出体积的藻浓度可以依赖于稀释是连续的还是间断的。细胞数目可以从约 2. 5百万细胞/ml至约5百万或约6百万细胞/ml。可以调节稀释数量和频率来补偿阳光 的差异。例如，基于年份、季节、半球和/或纬度，可以作出调节。目标藻的具体物种和株也 可以随这些参数而变化。例如，在冬天或寒冷的季节，可以使用一株，在夏天或温暖的季节， 使用另一株。
稀释步骤可以包含，从第一个水塘取出一定体积的目标藻。在有些实施方案中，将 来自第一个水塘的目标藻体积排进第二个水塘。在有些实施方案中，从第一个水塘取出目 标藻体积和它排进第二个水塘是基本上同时的。在其它实施方案中，从第一个水塘取出和 排进第二个水塘间隔合适的时间段。
第二个水塘的藻深度可以是任意合适的深度。在有些实施方案中，第二个水塘的 藻深度是约18厘米至约30厘米。一旦排进第二个水塘后目标藻的停留时间可以是任意合 适的时间段。在有些实施方案中，停留时间是约3天。第二个水塘在停留时段会提供足够 的容量来容纳排进第二个水塘的藻培养物体积。例如，当停留时间是约3天时，且每天向第 二个水塘加入藻培养物，水塘应当容纳3天的“流动的”(添加的)培养物，体积是每批流动 的培养物的3倍。在有些实施方案中，第二个水塘中的浓度范围是5百万至1千万细胞/ ml ο
第二个水塘可以包含任意合适的结构或结构的组合。在第二个水塘中可以维持任 意合适的条件集合。第二个水塘可以是应激水塘。第二个水塘可以是沉降水塘。在有些实 施方案中，第二个水塘既是应激水塘又是沉降水塘。应激水塘会提供造成目标藻增加生产 脂质(其可以收获用于生物燃料生产)的环境。应激水塘环境可以以许多不同的方式来实 现。例如，通常可以使目标藻饥饿营养物或剥夺一种或多种营养物。在有些实施方案中，应 激水塘是氮缺乏的。氮缺乏可以是完全的或部分的。除了氮以外，可以将其它营养物(包 括二氧化碳)加入第二个水塘中的藻培养物。可以在第二个水塘中提供使目标藻对脂质或 其它希望的产物的生产最大化的条件。在有些实施方案中，在第二个水塘中维持培养选择 性。在有些实施方案中，第二个水塘是应激水塘，且类似于第一个水塘的设计，例如，管道水 塘，只是更深。沉降水塘允许目标藻沉降。在有些实施方案中，沉降水塘是漏斗形状。在应 激水塘和沉降水塘不是同一个水塘的实施方案中，第二个水塘可以是应激水塘，采用第三 个水塘作为沉降水塘。
可以从第二个水塘收获目标藻，用于下游加工，例如脂质提取和最终的生物燃料 生产。可以使用任意合适的装置，以任意合适的量，以任意合适的频率，收获目标藻。在有 些实施方案中，在将目标藻体积排进第二个水塘后约52小时至约M小时，进行收获。在有 些实施方案中，在将目标藻体积排进第二个水塘后约72小时，进行收获。在有些实施方案 中，一旦脂质浓度达到细胞群的至少约25%，进行收获。使用任意合适的测量法，可以测定 脂质含量。在有些实施方案中，使用荧光计测量脂质含量。荧光计的目标读数可以依赖于 选择的孔径和样品的浓度。可以采用任意合适的荧光染料。实例包括尼罗红，尼罗蓝和印 度蓝。
可以使目标藻脱水。脱水可以作为收获步骤的一部分或作为一个单独的步骤来进 行。在有些实施方案中，脱水步骤包含，采用带式压榨机和脱水仪(dehydrogenator)中的至少一个。在有些实施方案中，收获步骤包含，通过从第二个水塘抽吸沉降的目标藻，实现 目标藻脱水。硫酸铝(例如50-100ppm)，或氯化铁(例如10-30ppm)可以用于帮助藻沉降。 聚合物(例如0.5%的藻生物量)可以用于在使用带式压榨机之前促进藻聚沉。可以采用 任意合适的聚合物或聚合物的组合。在有些实施方案中，使用乳状液聚合物。乳状液聚合 物的实例包括Flopam EM 640, Flopam EM 840，及其组合。在有些实施方案中，采用溶液聚 合物。可能需要比采用乳状液聚合物时更多的溶液聚合物。另外，或者在替代方案中，聚沉 促进剂可以包括粘土、PH调节(例如pH升高)、营养物缺乏和带电的电极中的一种或多种。
在有些实施方案中，在达到3百万细胞/毫升和以上的密度后，收获户外水塘中的 藻，并穿过30微米或更高筛号的过滤器，这依赖于滤过率。该过滤的产物是藻糊，其可以用 溶剂(如甲醇、氯仿、丙酮、乙醇、己烷等)处理来提取脂质，并纯化得到生物燃料。ω-3脂 肪酸提取物、动物饲料例如水产养殖饲料、β-胡萝卜素、维生素等，也可以从不同的藻物种 (包括微藻)提取。通过紫外荧光暴露60分钟或更久，可以处理过滤藻物质后的水塘水。 在有些实施方案中，延长持续时间最高达3小时或更多。紫外处理过的水可以泵回水塘，并 添加不同的营养物，例如氮、磷酸盐和二氧化碳。可以将新鲜的接种物泵入水塘，用于藻生 长。在有些实施方案中，加入碳、氮、磷、矿物质、维生素的营养物。在有些实施方案中，主要 的营养物单独加入培养物水塘。
可以从目标藻提取脂质。可以采用任意合适的脂质提取装置。在有些实施方案 中，提取步骤包含氯仿甲醇提取和己烷提取中的至少一种。可以用溶剂处理藻物质，例如 Bligh和Dyer的方法，Fajardo和超临界(X)2过程，以提取脂质。使用例如Holup和Skeaff 所述的使用碱的转酯方法，可以将脂质加工成生物柴油。另外或在替代方案中，可以生产生 物乙醇、生物氢、生物甲醇和其它产物。
从藻糊提取生物柴油生产过程的副产品，例如ω-3脂肪酸和其它组的多不饱和 脂肪酸(PUFAs)。即使不生产生物柴油，也可以得到这些希望的脂质，所以不必视作副产品。 主要的ω-3脂肪酸包括α-亚麻酸(ALA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。 ω-3脂肪酸和PUFAs可以用于药物和营养制品用途。通过在不同温度加工下处理脂质，可 以得到ω-3脂肪酸作为脂质提取过程的副产品。在有些实施方案中，所有这些反应在缺氧 环境中进行。在有些实施方案中，目标藻株生产大约大于22%的ω-3、大于的PUFAs、 大于20 %的单不饱和脂肪和大于27 %的饱和脂肪。在有些实施方案中，藻脂质产物可以 包括约沈.1% ω C18-3脂肪、20%单不饱和脂肪、26. 4%多不饱和脂肪、25%饱和脂肪、和 2. 5%反式脂肪。碳链可以包括、但不限于，不同百分比的C12至CM链。实际的脂质谱可 以随一种或多种组分的增加或减少而变化，这依赖于藻生长条件。也可以采用其它方法。 ω-3脂肪酸可以用于多种健康用途，例如预防或治疗心脏和循环系统常见的医学病症、炎 性疾病和癌症。藻也具有维生素资源，包括:Α，C，Ε，它们可以使用维生素提取方法从微藻 得到。
藻餐原料的生产可以包括下述步骤。用抗溶剂处理和洗涤提取后得到的藻糊，用 去离子水洗涤，风干，并在约60°C消毒约12小时。然后可以粉碎生物量，并根据供应商的要 求，包装进合适的容器中。在有些实施方案中，藻餐产品包含3%粗纤维、0. 钙、39%蛋 白、0. 2%单不饱和脂肪、0. 2% ω-3脂肪、0. 2%多不饱和脂肪、0. 2%饱和脂肪、0. 反式 脂肪、和其它脂肪。
该生物量也可以用于生产乙醇。从生物量的厌氧消化，可以生产沼气。本发明的 原料可以含有不同量的蛋白、脂质、碳水化合物、纤维、矿物质、维生素和其它营养物。可以 调节本发明的方法来生产这些不同的量。
脂质含量可以等于或大于藻糊的10%、20%、25%、30%、35%、40%、或50%。在 有些实施方案中，脂质含量是藻糊的沈.3%。原料(餐)可以等于或大于藻糊的10%、 20%、25%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%。蛋白含量可以等于或大 于原料(餐)的10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%。在有些实施方案中，蛋 白含量是39%蛋白。
根据本发明提供了选择性地培养栅藻属的目标藻的方法。该方法包含，在第一个 水塘中培养目标藻；在第一个水塘中稀释目标藻；给第一个水塘供应营养物组合物；和在 第一个水塘中维持培养选择性。
本发明提供了培养目标藻斜生栅藻的方法。该方法包含，在第一个水塘中培养目 标藻；在第一个水塘中稀释目标藻；给第一个水塘供应营养物组合物；和在第一个水塘中 维持培养选择性。
本发明提供了选择性地培养目标藻斜生栅藻的方法。该方法包含下述步骤。在 管道水塘中培养目标藻。如果达到约8. 5或更高的pH，给管道水塘添加二氧化碳。如果达 到33°C或更高的温度，给管道水塘添加冷却液。大约每20小时，将管道水塘中的目标藻 稀释约60%。在几乎与稀释步骤同时，给管道水塘供应营养物组合物，其中所述营养物组 合物包含碳酸氢钠、尿素、磷酸三钠和氯化亚铁，碳酸氢钠浓度是至少2mM，氮磷比是至少约 15 1。将在稀释步骤中得到的目标藻体积排入缺乏氮的应激水塘。从应激水塘收获目标 藻，并脱水。从目标藻提取脂质。
本发明的任意方法可以另外包含下述步骤从由目标藻生产的脂质，生产生物燃 料。可以采用任意合适的方法。例如，可以采用转酯作用。在有些实施方案中，生物燃料是 生物柴油。在有些实施方案中，生物燃料是生物煤精(bio-jet)。通过本发明的任意方法生 产的生物燃料也是本发明的一个方面。
本发明提供了通过本发明的任意方法生产的生物燃料。
本发明的任意方法可以另外包含下述步骤从目标藻生产多不饱和脂肪酸。在有 些实施方案中，多不饱和脂肪酸包括ω-3脂肪酸。在有些实施方案中，ω-3脂肪酸包括 α-亚麻酸(ALA)，二十二碳六烯酸(DHA)，二十碳五烯酸(EPA)，或其任意组合。本发明提 供了通过本发明的任意方法生产的多不饱和酸。
本发明的任意方法可以另外包含下述步骤从目标藻生产原料。原料可以是动物 饲料，水产养殖饲料，或其任意组合。本发明提供了通过本发明的任意方法生产的原料。
本发明的任意方法可以另外包含下述步骤从目标藻生产植物营养物。植物营养 物可以是类胡萝卜素。在有些实施方案中，类胡萝卜素是虾青素，胡萝卜素，或其任意 组合。本发明提供了通过本发明的任意方法生产的植物营养物。
根据本发明提供了选择性的户外水塘藻培养物，其包含栅藻属的目标藻。培养物 可以是在水塘中。水塘可以是管道水塘。如上面关于本发明的方法所述，选择性的藻培养 物不需要是单种培养。在有些实施方案中，目标藻是总藻的至少50%。在有些实施方案中， 目标藻是总藻的至少75%。在有些实施方案中，目标藻是总藻的至少90%。在有些实施方12案中，目标藻是总藻的至少95%。在有些实施方案中，目标藻是总藻的至少99%。选择性 的户外水塘藻培养物可以包含斜生栅藻。目标藻可以选自斜生栅藻，四尾栅藻，最大栅藻， 奥波莱栅藻，被甲栅藻，二形栅藻和其任意组合。可以使用这些物种的变种。例如，可以采 用四尾栅藻最大变种。在有些实施方案中，斜生栅藻包含斜生栅藻UTEX株1450。
根据本发明也可以采用包含非栅藻的目标藻和/或其它水产养殖微生物的选择 性的户外水塘藻培养物。在有些实施方案中，培养物包含小球藻属的一种或多种绿藻例如 微小小球藻或其任意组合。在有些实施方案中，培养物包含葡萄藻属的一种或多种绿藻例 如布朗葡萄藻，苏韦迪葡萄藻，或其任意组合。在有些实施方案中，培养物包含衣藻属的一 种或多种绿藻或其任意组合。在有些实施方案中，培养物包含新月藻属的一种或多种绿藻 或其任意组合。在有些实施方案中，培养物包含盘星藻属的一种或多种绿藻或其任意组合。 在有些实施方案中，培养物包含直链藻属的一种或多种绿藻或其任意组合。在有些实施方 案中，培养物包含鞘藻属的一种或多种绿藻或其任意组合。在有些实施方案中，培养物包含 红球藻属的一种或多种绿藻例如雨生红球藻或其任意组合。在有些实施方案中，培养物包 含杜氏藻属的一种或多种绿藻例如杜氏盐藻，杜氏帕尔藻，杜氏绿藻或其任意组合。在有些 实施方案中，培养物包含金藻属的一种或多种定鞭绿藻例如球等鞭金藻或其任意组合。在 有些实施方案中，培养物包含四鞭藻属的一种或多种青绿绿藻例如亚心形扁藻或其任意组 合。在有些实施方案中，硅藻是目标藻，或与一种或多种绿藻组合地用于培养。硅藻的实例 包括、但不限于，骨条藻属的那些例如中肋骨条藻，角毛藻属的那些例如钙质角毛藻，或其 任意组合。培养物可以是在水塘中。水塘可以是管道水塘。在有些实施方案中，目标藻是 总藻的至少50%。在有些实施方案中，目标藻是总藻的至少75%。在有些实施方案中，目 标藻是总藻的至少90%。在有些实施方案中，目标藻是总藻的至少95%。在有些实施方案 中，目标藻是总藻的至少99%。
下面的实施例进一步解释本发明，但是，当然，不应理解为以任何方式限制它的范围。
实施例1
本实施例证实根据本发明培养绿藻培养物同时维持培养选择性。采用斜生栅藻培 养物(德克萨斯大学)。为了增加体积，将斜面培养物(20mL，50万细胞/mL)传代培养进 6个试管(50mL培养物，直到达到100万细胞/mL的浓度)，其中使用UTEX营养培养基，尽 管可以使用其它合适的培养基。UTEX营养培养基是Bristol培养基的蛋白胨培养基，含有 lg/L 蛋白胨。Bristol 培养基是 2. 94mM NaNO3,0. 17mM CaCl2 · 2Η20，0· 3mM MgSO4 · 7H20, 0. 43mM K2HPO4,1. 29mM KH2PO4,和0. 43mM NaCl。一旦建立生长，将培养物转移至250ml锥形 瓶，营养物浓度从该时刻开始，这些浓度在下面予以描述。当细胞密度增加(至1百万细胞 /ml的浓度，在200ml培养物中)时，将培养物转移至1. 5升鼓泡塔(1. 25L培养物生长，直 到2百万细胞/ml)，继续相同的营养物处理。接着将培养物转移进户外管道水塘(每个水 塘具有约22升的容量，容纳约18升藻培养物)。水塘中细胞的浓度维持在2百万至3百万 细胞/ml。采用丙烯酸水塘来确保足够的光，混合速度是约15cm/s。
如上所述采用的用于维持水塘培养物的营养物浓度包含碳酸氢钠、尿素、磷酸三 钠和氯化亚铁。表述的浓度是向水塘中加入营养物后得到的浓度。在2mM的浓度使用碳酸 氢钠。在0. 75mM N和20 μ MP，使用约30 1的氮磷比(N P)。在约2 μ M使用氯化亚铁。斜生栅藻在PH6-8范围内生长良好。为此，一旦pH达到8. 5，在全天内定期吹入二氧化碳。
斜生栅藻具有约20小时的倍增速率。通过使细胞停留时间保持在约20小时，藻 能维持一致生长，而具有更长停留时间的其它生物会被洗出。为了达到该停留时间，每天稀 释培养物60%。
斜生栅藻最佳生长的温度范围是20°C至30°C。但是，在35°C，生长急剧衰退。为 了使温度保持在最佳范围，使水塘维持在18厘米的最小深度，混合速度是15cm/s。每小时 监视温度，当超过33°C时，用新鲜的培养基稀释培养物。
为了增加脂质含量，将来自每天稀释的多余生物量转入更深的应激水塘，一培养 物在这里生长至耗尽基本上所有的氮。因为在管道水塘中提供的营养物浓度是足够生长对 小时的氮，应激培养物在约4-6小时内耗尽氮。再使培养物保持氮应激48小时，然后收获。
使用荧光和总脂质提取，进行脂质分析。荧光可以是脂质测量方法。染料尼罗红 在有脂质存在下是高度荧光的，用于实现读数。采用具有F4T5/d灯的Turner 110型荧光 计。采用的发射滤光片是420-470nm，采用的激发滤光片是> 520nm。为此操作，将培养物 稀释至3ppm的生物量。然后在Ippm的浓度加入染料。使用涡旋混合器将该溶液混合5分 钟，然后以5分钟间隔读出结果，持续1小时。将结果与Ippm三油精(具有Ippm尼罗红) 的标准溶液进行对比。
使用改良的Bligh和Dyer方法，进行总脂质提取。以1 1比例使用氯仿和甲醇， 提取可用于生物柴油生产的脂质。首先将目标藻脱水，然后使用台式脱水设备，将料浆干燥 过夜。然后将藻片称重，加入等量的氯仿甲醇溶液。然后使用涡旋，混合该料浆。30分钟 后，去掉试管帽，使溶剂蒸发。蒸发结束后，过滤内容物，并测量。
收获斜生栅藻的方法可以变化。为了生产生物柴油，使藻浆脱水，且不充分干燥。 一种廉价的且相当有效的脱水方法是使用沉降水塘，它也用作应激水塘。该两用水塘允许 藻蓄积脂质，同时为收获提供储存场地。在生长阶段，斜生栅藻在细胞壁周围保持负电荷。 该电荷造成细胞彼此排斥。细胞变老后，不再迅速地进行光合作用，它丧失电荷，能够与其 它细胞聚集。这些团块变大，最终沉到水塘底部，允许抽出更稠的浆。在应激水塘中，细胞 达到该静止期。随着细胞蓄积脂质，它们也开始凝块和沉降。
实施例2
本实施例证实根据本发明培养用于生产β -胡萝卜素的目标藻培养物。β -胡萝 卜素是一种脂和油溶性的产物，它具有抗氧化、捕获自由基的性质和预防癌症的活性。可以培养不同的藻物种，以得到胡萝卜素小球。例如，可以在基础培养基中采用海水，有时 采用淡水，杜氏藻属的藻，例如杜氏盐藻，杜氏帕尔藻(D.parva)，杜氏绿藻(D. viridis)和 它们的任意组合。杜氏藻是单细胞的、具有双鞭毛的裸绿藻。杜氏帕尔藻(D.parva)和杜 氏盐藻可以蓄积大量β-胡萝卜素。这些藻可以在20至40°C的范围内生长，但是也可以耐 受低得多的温度。
下述物质可以用于制备用于藻β-胡萝卜素生产的培养基2. 14Μ NaCl, 4. 81 μ MFeCl3,1.82 μ M MnCl2,0. 13mM NaH2PO4,和 1. 18mM NaNO3，也可以采用海水和其它矿 物质。可以达到30-40gm干重/m2/天的生产能力。使用硅藻土作为过滤材料，通过高压过 滤装置进行收获。也可以干燥收获的生物量，且可以为消费而进行销售。在有些情况下，将 藻物质离心或过滤，添加NaCl，然后离心几个周期。可以用渗透压法破碎细胞，但是β-胡萝卜素保持与膜结合。在该步骤中，β-胡萝卜素小球从膜释放至上清液，作为悬浮液存在。 将悬浮液与含有50%蔗糖和Tris HCl的溶液相混合，并将制品离心。从上层收集纯化的 β -胡萝卜素小球，同时含有叶绿素的膜沉淀在底部。
实施例3
本实施例证实根据本发明培养用于水产养殖饲料的硅藻或绿藻培养物。可以 在户外水塘中培养硅藻、中肋骨条藻、钙质角毛藻、定鞭球等鞭金藻(Prymnesiophycean Isochrysis galpana)禾口胄(PrasinophyceanTetraselmis suecica)，L^i,^fezfe 水产养殖饲料。储藏培养物维持在2000勒克司(Iux)的恒定光照、22-M°C的温度。在含 有NaNo3、NaH2P04、Na2SI03、FeCl3和Na2EDTA的海水培养基中培养硅藻。对于绿藻，省略硅酸 盐溶液。在实验室中维持储藏培养物，将培养物接种进户外水塘。最佳温度是20至33°C。 使用20微米的过滤器收获藻，将生物量风干，作为饲料供应虾苗、蛘和其它鱼苗。产物不仅 包括水产养殖饲料，而且通常包括蛋白和纤维。
实施例4
本实施例证实根据本发明培养目标藻培养物来生产虾青素。在实验室中培养雨生 红球藻，并测试虾青素含量。虾青素是一种类胡萝卜素色素，用于不同的药物和营养制品目 的。该藻最初是一个绿色的具有双鞭毛的绿藻成员，通常生长在淡水环境中。每个细胞具 有一个单独的杯状叶绿体，后者含有许多淀粉核。当细胞受到如高光强度、营养物耗尽、直 接暴露于阳光等因素的应激时，它们形成孢囊，显示为红色，这会使它们长时间存活。在它 们的细胞中孢囊蓄积大量的红色素虾青素，它可以达到它干重的4%。实验室培养的雨生红 球藻受到高温和营养物缺乏的应激。使孢囊通过重力进行沉降，并用超临界(X)2处理，以破 碎它们的细胞。破裂的细胞释放蓄积的虾青素，在室温温和地干燥它们，并包装。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都通过参考在此并入， 其程度如同将每篇参考文献单独地且特别地指出通过参考并入并在本文中整体予以阐述。
在描述本发明的上下文中(特别在所附权利要求书的相上下文中)术语"一个" 和"一种"和"所述"和类似指示的使用，应当理解为覆盖单数和复数，除非本文另有指 明或上下文明显抵触。术语〃包含〃、“具有〃、“包括〃和〃含有〃应当理解为开放式 术语(即，表示"包括，但不限于")，除非另有指出。本文对数值范围的列举，仅仅意在用 作个别指示落入该范围的每个单独值的速记方法，除非本文另有说明，每个单独值并入本 说明书中，如同在本文中个别列举。可以以任意合适的次序执行本文所述的所有方法，除非 本文另有说明或上下文明显抵触。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(例如，“ 例如")的使用，仅仅意在更好地解释本发明，不对本发明的范围构成限制，除非另有声 明。说明书中的语言都不应理解为表示任何未声明的要素是实现本发明所必需的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实现本发明的最佳方式。 阅读前面的描述后，本领域普通技术人员会明白这些优选实施方案的变体。发明人预见到 技术人员会在适当时采用这样的变体，发明人预见到不同于本文特别说明地实现本发明。 因此，本发明包括适用的法律所允许的所附权利要求书列出的主题的所有改进和等同方 案。此外，本发明包括在其所有可能的变体中上述元素的任意组合，除非本文另有说明或上 下文明显抵触。
权利要求
1.选择性地培养目标藻的方法，该方法包含 在第一个水塘中培养目标藻；在第一个水塘中稀释目标藻； 给第一个水塘供应营养物组合物；和 在第一个水塘中维持培养选择性。
2.权利要求1的方法，其中所述方法另外包含下述步骤如果达到约8.5或更高的pH， 给第一个水塘添加二氧化碳。
3.权利要求1的方法，其中所述方法另外包含下述步骤如果达到33°C或更高的温度， 给第一个水塘添加冷却液。
4.权利要求3的方法，其中所述冷却液是新鲜的培养基。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在几乎与稀释步骤同时进行供应营养物组合物步骤。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述营养物组合物包含浓度为至少约0.6mM的 碳酸氢钠，这是在向水塘加入营养物组合物后测得。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述营养物组合物包含浓度为至少约2mM的碳 酸氢钠，这是在向水塘加入营养物组合物后测得。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述营养物组合物包含铁源。
9.权利要求8的方法，其中所述铁源包含氯化亚铁。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述营养物组合物包含氮源和磷源。
11.权利要求10的方法，其中所述氮源包含尿素，磷源包含磷酸三钠。
12.权利要求10或11的方法，其中所述氮磷比是至少约15 1。
13.权利要求12的方法，其中所述比例是约四1。
14.权利要求12的方法，其中所述比例是约30 1。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述第一个水塘是管道水塘。
16.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述第一个水塘包含透明的管壳。
17.权利要求15的方法，其中所述透明的管壳包含丙烯酸聚合物。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中第一个水塘的藻培养物体积是约18升或更多。
19.权利要求1-17中任一项的方法，其中第一个水塘的藻培养物体积是约600升或更多。
20.权利要求1-17中任一项的方法，其中第一个水塘的藻培养物体积是约14，000升或更多。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述第一个水塘包含约13-20厘米的平均藻培养物深度。
22.权利要求21的方法，其中所述平均藻培养物深度是约18厘米。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中在约12cm/秒、约15cm/秒或约18cm/秒的速 度混合目标藻。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述稀释步骤包含在第一个水塘中稀释目标 藻，稀释度从约35 %至约60 %。
25.权利要求1-25中任一项的方法，其中大约每20小时进行稀释。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中当透明度板读数达到5-6cm时进行稀释。
27.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述稀释是连续的。
28.权利要求27的方法，其中第一个水塘中的藻浓度维持在从约2百万至约3百万藻 /ml的范围。
29.权利要求118中任一项的方法，其中所述稀释步骤包含从第一个水塘取出一定体 积的目标藻。
30.权利要求四的方法，其中所述方法另外包含 将来自第一个水塘的目标藻体积排进第二个水塘。
31.权利要求30的方法，其中第二个水塘的藻深度是约18至约30厘米。
32.权利要求30或31的方法，其中所述第二个水塘是应激水塘。
33.权利要求32的方法，其中所述应激水塘是氮缺乏的。
34.权利要求30-33中任一项的方法，其中所述方法另外包含 从第二个水塘收获目标藻。
35.权利要求34的方法，其中在将目标藻体积排进第二个水塘后约52小时至约M小 时，进行收获。
36.权利要求34的方法，其中在将目标藻体积排进第二个水塘后约72小时，进行收获。
37.权利要求34的方法，其中一旦脂质浓度达到细胞群的至少约25%，进行收获。
38.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述方法另外包含 将从第二个水塘收获的目标藻脱水。
39.权利要求38的方法，其中所述脱水步骤包含，采用带式压榨机和脱水仪中的至少一个。
40.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述收获步骤包含，通过从第二个水塘抽吸 沉降的目标藻，实现目标藻脱水。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述方法另外包含 从目标藻提取脂质。
42.权利要求41的方法，其中所述提取步骤包含下述的至少一种氯仿甲醇提取和 己烷提取。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中所述方法另外包含 放大目标藻的种子培养物，实现在第一个水塘中培养目标藻。
44.权利要求42的方法，其中所述放大步骤包含两个或多个连续更大体积目标藻的步骤。
45.权利要求1-44中任一项的方法，其中所述目标藻是至少一种绿藻。
46.权利要求45的方法，其中所述绿藻是栅藻属的藻。
47.权利要求45或46的方法，其中所述绿藻是斜生栅藻。
48.权利要求45或46的方法，其中所述绿藻选自斜生栅藻，四尾栅藻，最大栅藻，奥 波莱栅藻，被甲栅藻，二形栅藻和其任意组合。
49.权利要求46-48中任一项的方法，其中所述斜生栅藻是斜生栅藻UTEX株1450。
50.权利要求45的方法，其中所述绿藻属于选自下述的属栅藻属，小球藻属，葡萄藻属，衣藻属，新月藻属，盘星藻属，直链藻属，鞘藻属，红球藻属，杜氏藻属，金藻属，四鞭藻 属，及其任意组合。
51.权利要求1-44中任一项的方法，其中所述目标藻是至少一种硅藻。
52.权利要求52的培养物，其中所述硅藻属于选自下述的属骨条藻，角毛藻，及其任思组合。
53.选择性地培养栅藻属的目标藻的方法，该方法包含 在第一个水塘中培养目标藻；在第一个水塘中稀释目标藻； 给第一个水塘供应营养物组合物；和 在第一个水塘中维持培养选择性。
54.权利要求53的方法，其中所述绿藻选自斜生栅藻，四尾栅藻，最大栅藻，奥波莱栅 藻，被甲栅藻，二形栅藻和其任意组合。
55.选择性地培养目标藻斜生栅藻的方法，该方法包含 在第一个水塘中培养目标藻；在第一个水塘中稀释目标藻； 给第一个水塘供应营养物组合物；和 在第一个水塘中维持培养选择性。
56.选择性地培养目标藻斜生栅藻的方法，该方法包含 在管道水塘中培养藻；如果达到约8. 5或更高的pH，给管道水塘添加二氧化碳； 如果达到33°C或更高的温度，给管道水塘添加冷却液； 大约每20小时，将管道水塘中的藻稀释约60% ；在几乎与稀释步骤同时，给管道水塘添加营养物组合物，其中所述营养物组合物包含 碳酸氢钠、尿素、磷酸三钠和氯化亚铁，碳酸氢钠浓度是至少2mM，氮磷比是至少约15 1 ； 将在稀释步骤中得到的藻体积排进氮缺乏的应激水塘； 从应激水塘收获藻，并脱水；和 从藻提取脂质。
57.权利要求1-56中任一项的方法，其中所述目标藻维持在总藻的至少50%。
58.权利要求1-56中任一项的方法，其中所述目标藻维持在总藻的至少75%。
59.权利要求1-56中任一项的方法，其中所述目标藻维持在总藻的至少90%。
60.权利要求1-56中任一项的方法，其中所述目标藻维持在总藻的至少95%。
61.权利要求1-56中任一项的方法，其中所述目标藻维持在总藻的至少99%。
62.权利要求1-61中任一项的方法，该方法另外包含 使用从目标藻生产的脂质，生产生物燃料。
63.权利要求62的方法，其中所述生物燃料是生物柴油。
64.权利要求62的方法，其中所述生物燃料是生物煤精。
65.通过权利要求1-64中任一项的方法生产的生物燃料。
66.权利要求1-59中任一项的方法，该方法另外包含 从目标藻生产多不饱和脂肪酸。
67.权利要求66的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是ω-3脂肪酸。
68.权利要求67的方法，其中所述ω-3脂肪酸选自α-亚麻酸(ALA)，二十二碳六烯 酸(DHA)，二十碳五烯酸(EPA)，及其任意组合。
69.通过权利要求1-59或66-68中任一项的方法生产的多不饱和酸。
70.权利要求1-59中任一项的方法，该方法另外包含 从目标藻生产原料。
71.权利要求70的方法，其中所述原料选自动物饲料，水产养殖饲料，及其任意组合。
72.通过权利要求1-59、70或71中任一项的方法生产的原料。
73.权利要求1-59中任一项的方法，该方法另外包含 从目标藻生产植物营养物。
74.权利要求73的方法，其中所述植物营养物是类胡萝卜素。
75.权利要求74的方法，其中所述类胡萝卜素选自虾青素，β-胡萝卜素，及其任意组合 ο
76.通过权利要求1-59或73-75中任一项的方法生产的植物营养物。
77.选择性的户外管道水塘藻培养物，其包含栅藻属的目标藻。
78.权利要求77的培养物，其中所述目标藻是总藻的至少50%。
79.权利要求77的培养物，其中所述目标藻是总藻的至少75%。
80.权利要求77的培养物，其中所述目标藻是总藻的至少90%。
81.权利要求77的培养物，其中所述目标藻是总藻的至少95%。
82.权利要求77的培养物，其中所述目标藻是总藻的至少99%。
83.权利要求77-82中任一项的培养物，其中所述目标藻是斜生栅藻。
84.权利要求77-82的培养物，其中所述目标藻选自斜生栅藻，四尾栅藻，最大栅藻， 奥波莱栅藻，被甲栅藻，二形栅藻和其任意组合。
85.权利要求83或84的培养物，其中所述斜生栅藻是斜生栅藻UTEX株1450。
86.权利要求77-82的培养物，其中所述目标藻属于选自下述的属栅藻属，小球藻属， 葡萄藻属，衣藻属，新月藻属，盘星藻属，直链藻属，鞘藻属，红球藻属，杜氏藻属，金藻属，四 鞭藻属，及其任意组合。
87.权利要求75-80的培养物，其中所述目标藻包含一种或多种硅藻。
88.权利要求87的培养物，其中所述硅藻属于选自下述的属骨条藻，角毛藻，及其任 思组合。
全文摘要
本发明提供了用于培养藻同时维持培养选择性的材料和方法。可以培养的藻包括，例如，绿藻，例如栅藻属的那些。从藻得到的脂质可以用于生产生物燃料例如生物柴油或多不饱和脂肪酸例如ω-3脂肪酸。也可以生产原料例如动物饲料和水产养殖饲料，还可以生产植物营养物例如虾青素和β-胡萝卜素。
文档编号A01K63/06GK102036551SQ200980107931
公开日2011年4月27日 申请日期2009年1月22日 优先权日2008年1月25日
发明者拉曼努金·拉维库马尔, 普里西利亚·拜耳·德马里斯, 菲利普·旺德维尔 申请人:水产能源有限责任公司