单胞绿藻的培养及食品制造技术方法

专利名称：单胞绿藻的培养及食品制造技术方法
技术领域：
本发明是提供一种单胞绿藻的培养及食品制造技术方法，尤指其可提供营养价值高且具经济价值的食物，以解决世界上粮荒的问题。
人类有史以来人口的成长本来很缓慢，至近年来由于生长速度逐渐形成人口爆炸的趋势，根据联合国的人口调查，至今人口已超过五十亿，而年增加率为1.9%，按此比例增加结果2001年的人口将达到70亿之多。联合国人口调查机构的报告指出，目前全世界人口的10～15%陷入营养不良，而其中半数是饥饿状态，原因之一是人口分布及粮食生产的不平衡。就如1985年在印度、埃塞俄比亚的大饥荒即引起数十万甚至数百万人以上的死亡。而且亚洲地区的人口占世界的50%，然而其粮食生产量却仅有28%，除了欧洲及北美洲以外的地方，现有粮食都无法自给自足，日本粮食的自给率为70～75%，其余是依赖换算约75万吨的蛋白质输入补足其数，实际输入相当于85万吨的粮食，我国除稻米外也必须由国外进口粮食以补不足。
粮食生产足够与否归因于利用太阳能生产的绿色农作物(植物)的光合成量，人类以及所有动物的粮食，来自绿色植物的光合成作用将太阳能转换成植物性粮食，再将这些粮食饲养家畜转变成蛋白质源，因此所有的粮食来源均来自于太阳能。利用单胞绿藻为粮食的来源供给东南亚地区慢性饥饿的方法值得考虑。最近也有利用石油来合成蛋白的研究正在发展，但石油本身只能供应今后30～40年就逐渐枯竭，为解决蛋白质源的缺乏，培养单胞绿藻是最值得研究的。
单胞绿藻是属于绿藻类的一种单细胞藻类，因其叶绿体含有叶绿素a及b，且其光合作用的方式与高等植物相同，所以在植物生理学的研究上，早在二十世纪初叶已有以单胞绿藻做光合作用的研究，其体积非常微小(直径约为2～8μm)，非肉眼所能见，外表呈圆球状，必须在放大600倍以上的显微镜下才能看见，因此在单胞绿藻繁殖旺盛的地方，只是呈现着一片混浊的绿色液体而已。由于其个体如此微小，所以它的名称是由希腊语的Chloras(意为绿色)，附加拉丁语的ela(意为微小)为接尾词合并而成，意为绿色的小东西。单胞绿藻种类很多，分布亦很广，在淡水池塘、水溜、沟中均可发现，常见的种类有Chlorella vulgaris，C.pyrenoidosa，C.ellipsoidea等种，在海边亦有单胞绿藻的存在，如C.pyrenoidosa，C.minu-tissima等。
单胞绿藻是以无性分裂生殖繁衍，具体地说，即当单胞绿藻的细胞成熟时，其内部的细胞质便会分裂形成四个或八个子细胞(autospores)，待其生长成熟，外部细胞膜便破裂而成为独立的单胞绿藻，而且只要在有水、阳光和植物生长所必须的养分如碳、氧、磷、钾、镁、硫和铁等，便能不断地增殖，在适宜的环境下，自子细胞成熟以至再分裂，所需要的时间约二十个小时即可完成。若以每天分裂一次成四个子细胞来计算，十天后可达106个，三十天后则可增加至1018个之多，然而实际上，在水中的细胞浓度愈高则阳光被水中细胞吸收遮蔽而无法达到水面表面积3/4倍的锥形底部分，故增殖比率与阳光照射的面积成正比，此与细菌的繁殖不同。
由于单胞绿藻不仅具有快速的增殖能力，且早在第一次世界大战时德国学者已开始研究，认为可以把它作为今后粮食与饮料来源，以解决世界人口不断增加而造成农产品不足及缺乏蛋白质的厄运。然而此项工作却因战争而受挫，直到第二次世界大战后才开始设置试验工厂，从事大量培养的研究。
基于此，为了提供人类充足且具经济价值的食物，本发明人不断地积极研究、试验，今终开发成功了本发明，用以在具有经济条件下获致高营养价值的食物。
本发明的主要目的是提供一种单胞绿藻的培养及食品制造技术方法，选取最佳的藻菌后于常温下经试管培养，至一定程度后接种至瓶子内并加入培养剂作室内培养，室内培养至一定程度后再转移至室外的培养池作室外培养以形成单胞绿藻，而后分离杂质，将分离出来的纯单胞绿藻置于贮存槽内，以离心机清洗、再以高速分离机分离浓缩单胞绿藻，并利用高速远心喷雾干燥机作干燥处理，并检查其粒度分布情形，同时再检查各营养成分及卫生状况，达到标准后即予真空包装成产品。
本发明所提供的培养技术及制造方法，经配合下列附图予以作进一步的说明后，便有更详细的了解，但以下所述的仅用以解释本发明的较佳实施例，并非企图对本发明作任何形式上的限制，凡有在相同的发明精神下所作有关本发明的任何修饰或变更，仍应包括在发明意图保护的范畴。


图1为显示显微镜下的绿藻(X600倍)，右下角为绿藻单一细胞的结构图;
图2为显示单胞绿藻生活史图;
图3为显示本发明制造流程图。
图号说明(1)试管中选种(5)脱水处理(2)室内培养(6)杀菌处理(3)室外培养(7)喷雾干燥处理(4)收集液(8)真空包装成产品单胞绿藻为一种最简单的单细胞植物，体积非常微小，需用显微镜放大600倍才可看到，如图1所示，外形呈球状、椭圆形或菱形等，常单独或集合成群生活;但不能游动，外有细胞壁，内含细胞质包藏一核及杯状的叶绿体，在叶绿体内有一个明显的淀粉核(如图1右下角所示)。
单胞绿藻(unicellular Chlorella)在地球上分布很广，庭院中的养鱼池或是金鱼缸内、池沼、贮水池内，只要水色呈青绿色者，几乎是单胞绿藻的大族群，也有些繁殖于畜舍边或阴湿地面、石头、树木表面及冰雪寒冷地区等，普通生活如淡水中，目前已发现的约有十余种，其中较普遍的有C.pyrenoidosa，C.ellipsoidea，C.vulgaris，C.miniarta等。在近海的河口的海水中，亦有一些种类的单胞绿藻生于其中，通常称为海洋绿藻，有时亦可在海岸边发现其存在，就字义上而言，生长混有盐份的水中的单胞绿藻并不能算是海洋绿藻，但是有些十分适应海水者也可适应于盐水中，在海湾中经常可以发现有C.pyrenoidosa，C.ellipsoidea及C.minutissima等三种，而其它则较少见。
绿藻纲的植物体内含有的植物色素与高等植物相同，如叶绿素a及b，叶红素(胡萝卜素)(carotene)、叶黄素(花青素)(xanthophyll)等，并可营光合作用，因此很早即被利用于研究光合作用实验植物，其球形单细胞的藻体被纤维素及半纤维素所形成的细胞膜所包覆。
培养单胞绿藻可称之为园艺无土栽培(水耕栽培)的一种高经济价值的作物，于适当的生长环境中，其对太阳能的利用率达10%，乃其它作物所不及，况且其为单细胞植物，整个藻体皆可供食用，毫无浪费之处，又其所含蛋白质高达55%以上，比黄豆20～30%多，且其氨基酸组成及含量都较联合国人口调查机构的标准为高;又其维生素及叶绿素的含量亦极高，更含有生长素(Chlorella Growth Factor简称C G F)，具有促进微生物及动植物发育乃至帮助人体抗溃疡性的效果;是开发潜力极高的蛋白质资源之一。单胞绿藻浮生于水层中，与干苔、水绵、石莼等同属于绿藻类，只要有空气、水及二氧化碳与一些必须的化学元素，藉光合作用就能迅速地繁殖。然而因其营养需求及生长条件较为简单即能迅速地繁殖而且其营养成份极高，又含有许多特殊成份，故早就为科学家所重视。
如图2所示，单胞绿藻的生活史分为Dn、Da、D～L、L1、L2、L3、L4等七个阶段，图上空白箭头表示需要日光照射称之为明反应，而黑箭头表示不需要日光能的生长称之为暗反应，图的大小为发育过程中细胞容积，黑色圆环表示叶绿藻含有量。
在日光照射下，Da、Dn、D～L细胞在此过程中较难分裂为一个新个体，故分裂Dn细胞需L3细胞置于暗处供给空气才能分裂为Dn细胞。Dn至L2～L3期间细胞容积渐大，此为成长期(growing phase)，当继续成长至L4，细胞内蛋白质增加造成核质并随即分裂为四个子细胞，此为成熟过程(ripening process)，此过程需要日光，L3～L4期间属于暗细胞期并得以成熟，称为成熟期(maturing phase)，成熟的细胞分裂为Dn孢子，称之为分裂期(dividing phase)，进行光合作用的周期乃由Dn开始至L3，而以Da至D～L中间最旺盛。
影响绿藻生长的因素有光线、温度、搅拌、水深及酸碱值。光能在光合作用中转变为化学能的效率，除了温度之外，就光的本身来说有光强度、波长的分布及照射时间等三个因子，对藻体生育有效的光，仅限于波长域400～700mμ的可见光。
绿藻生长于水中，故水温对其生长有很大的影响，影响绿藻生长的温度效果为将温度提高使光饱和现象发生，如此光强度提高则光能利用率也会提高。绿藻可依温度而分为低温种、中温种及高温种等三种，但它们不能很明显地区别，只能在其高温限度下才有区别，本发明在绿藻选种方面尽量希望选定可耐高温的品种，若提高绿藻的培养温度则可提高其增殖(生长)率，但若能量变换效率提高至某一限度时则绿藻会突然死亡，此致死的温度在高温种约为42℃左右。
在培养绿藻的过程中，必须设有搅拌的装置，其主要的作用有三(一)使培养液中氮-磷-钾及其它营养成分均匀分布，以达到充分吸收的效果。(二)可以使绿藻得到间歇性的照射效果以提高光能利用效率。(三)搅拌的最大目的是防止绿藻细胞沉淀，绿藻细胞的比重约为1.02，它的大小只有2～8μm而已。在30分钟至1小时的静置下也不易沉淀，必须长时间的静置才会徐徐的沉降至水底，在沉降状态下细胞互相粘着，不发生光合作用也不产生生氧气，一旦培养液中所存的氧气不够呼吸作用时，藻细胞就会死亡，死细胞当然不会有增殖的现象。因此若缺少搅拌作用时会引起绿藻细胞沉淀而死亡，为了避免此种弊端，本发明在培养过程中设置搅拌装置是必要的。
培养液的深度与其中绿藻细胞的浓度影响到入射光能否完全被绿藻所吸收利用。入射光若能完全被吸收利用时，在直线增值期的培养下，绿藻的生长量与光线照射面积相等时，则液深不一定有关系。
一般单胞绿藻最适合于生长在pH6微酸性的培养液中，而酸碱值对单胞绿藻的影响又可分为内在与外在两种性质，内因性即藻种本身的性质，而所谓外因性即培养液pH的影响，其对绿藻的生长率影响很大。培养液的酸碱值的高低会影响到二氧化碳的利用率，若培养液是酸性时，一氧化碳以游离的性质存在，则单胞绿藻能在光合作用下充分利用碳素源，若培养液为碱性时，则二氧化碳会形成重碳酸离子，单胞绿藻无法利用。
本发明供给绿藻的碳源可直接加入空气中的二氧化碳，或可用冰醋酸、有机酸、葡萄糖、果糖等单糖类培养，甚至蔗糖的双糖类均可培养，然而以利用有机酸糖类培养二氧化碳的生长更为快速。
如图3所示，本发明所提供的单胞绿藻的培养及食品制造技术方法，包括有下列制造步骤一、试管中选种在常温下生长至一定程度后，隔离光线使之不再生长，保存作为室内培养的种源。
二、室内培养于常温下进行，加入碳源及培养剂，于生长至一定程度后移至室外培养。
三、室外培养将室内培养后的藻菌移至室外培养，定时补足培养剂并予以搅拌以供藻菌充分吸收及防止藻菌沉淀，另加入碳源，并供给适量的阳光及温度、检查藻菌的新鲜度、检查藻菌的生长情况，进一步培养出单胞绿藻。
四、收集液;
五、脱水处理;
六、杀菌处理;
七、喷雾干燥处理;
八、真空包装成产品。
其中选种时是于显微镜下选取圆形或椭圆形的最佳品系藻菌，其大小约2～8μm，于常温下经试管培养；室内培养是将试管培养后的藻菌分装至小瓶子中，加入水、培养剂(以氮、磷、钾混合而成)、空气及二氧化碳并予以搅拌，调整光源对藻菌的照射及温度以作室内培养，初期时以50cc的小瓶盛装，约七天后以500cc的中瓶盛装，再约七天后以2000cc的大瓶盛装，于室内培养时是在15～25℃的室温时生长最适当，且良好的酸碱度为pH7～9，于室内培养生长至一定程度后将藻菌移至室外于直径2～45公尺的水泥培养池继续作室外培养，由室内移至室外培养池时是选择于午后日光渐趋减弱之时，以使绿藻细胞适应醋酸及二氧化碳的混营方式，并经由十二小时以上不受强光直射的调节代谢机能时间，以达到较高的转移成活率;并定时补足培养剂以供藻菌吸收，并供给适量的阳光及温度、检查藻菌的新鲜度、检查藻菌的生长情况，进一步培养出单胞绿藻，所供的阳光量是依据水深情况而定，故必须注意培养池的深度，使阳光得以射入水面以下的藻菌范围供充分吸收;待藻体长成后予以收集，再以离心机脱水处理，同时检查其密度及新鲜度，并施予杀菌处理及喷雾干燥处理，最后再真空包装成产品，本发明所用的喷雾干燥机是借着离心力的回转(约10，000～12，000RPM)所制成，入口温度为145～150℃，出口温度为85～90℃，原液由喷孔进入干燥室中，由浓稠状的液态，自顶部散布而下，约6～10秒即形成粉末。
大量培养单胞绿藻时所需的养分有碳、氮、磷、钾、镁、硫、铁。由于在大量培养绿藻时需要高浓度的碳源，若仅将空气通入培养液中，其效果并不十分理想，因此在本发明中对于室外的异营生长的绿藻必须利用有机酸(如柠檬酸、醋酸等)来作为碳源，并可在光照情况下繁殖得很好，若将异营培养转移至日光下，将导致进入混营生长而且增进了绿藻细胞生长。再者，因为绿藻细胞无法从大气中吸收氮，故必须以氮的化合物补充之，于本发明中是以KNO3或尿素来作为氮源，而尿素会经由CO(NH2)2+H2O→CO2+2NH4以氨的形态而被利用。
通常对绿藻细胞组成，本发明是在培养液中添加少量磷、钾、镁、硫、铁，因为在工业生产中是以地下水来培养，不需要特别再添加微量元素来促进生长。因为磷是以H2PO4-为绿藻所吸收，故采用KH2PO4作为钾与磷的来源。钾是以K的型态供应，如存在于KNO3及KH2PO4;缺少K时细胞尚未发育成熟即行分裂，而这些子细胞将失去其分裂的功能。镁来源则来自MgSO4·7H2O的化合物，其对叶绿素的成份很重要而且对酵素的活性也有关联;缺乏镁虽不致于立即影响绿藻的生长，但细胞中叶绿素会变黄且失去其分裂的功能，当细胞中缺少Mg时，其细胞核仍可分裂，然而细胞数目却不会增加。细胞若缺硫时将停止生长且不再分裂，故生长过程中以添加硫酸镁MgSO4·7H2O与硫酸铁FeSO4·7H2O为硫的来源。一般而言，铁属于微量元素，Fe对色素与酵素的活性极为重要，可以稳定细胞的生长，在大量培养时虽使用含有铁的地下水却嫌不足。以FeSO4·7H2O或FeCl3来做为铁源，并添加了金属络合离子(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid简称E.D.T.A)以固定铁，当其浓度为37ppm时，使铁的相对浓度约为10ppm以适合绿藻的生长。
由以上所述可知，本发明是具有首创新颖性及实用性而有产业上的利用价值，因此已符合了专利法的发明要件，现依法提出申请，并请赐准专利为盼。
权利要求
1.一种单胞绿藻的培养及食品制造技术方法，包括以下的制造步骤一、试管中选种；包含分离、纯化、增殖及品种选择；二、室内培养；于常温下进行，提供培养剂、碳源，于生长至一定程度后移至室外培养；三、室外培养，将室内培养后的藻菌移至室外培养，定时补足培养剂并予以搅拌以供藻菌充分吸收及防止藻菌沉淀，另加入碳源，并供给适量的阳光及温度、检查藻菌的新鲜度、检查藻菌的生长情况，进一步培养出单胞绿藻；四、收集液；五、脱水处理；六、杀菌处理；七、喷雾干燥处理；八、真空包装成产品。
2.依据权利要求1所述的单胞绿藻的培养及食品的制造技术方法，其中该培养剂是以氮、磷、钾、镁、硫所组成，且该培养剂的酸碱值是在pH6为最佳。
3.依据权利要求1所述的单胞绿藻的培养及食品的制造技术方法，其作室内培养时所用的碳源是直接以空气中的二氧化碳加入的，而室外培养所用的碳源是以含二氧化碳的醋酸培养基。
4.依据权利要求1所述的单胞绿藻的培养及食品的制造技术方法，其由室内移至室外培养池时是选择于午后日光渐趋减弱之时，以使绿藻细胞适应醋酸及二氧化碳的混营方式，并经由十二小时以上不受强光直射的调节代谢机能时间，以达到较高的转移成活率。
全文摘要
本发明涉及单胞绿藻的培养及食品制造技术方法，是选取最佳的藻种后于常温下试管培养，至一定程度后接种至瓶子内并加入培养剂及照射人工光线作室内培养，培养至一定程度后再转移至室外的培养池培养以形成充实的单胞绿藻，而后分离杂质，将分离出来的纯单胞绿藻置于贮存槽，以离心机清洗残余培养药量和其它杂质，再浓缩和干燥处理，并检查其粒度分布情形和各营养成分及卫生状况，达到所规定的标准后，真空包装成产品。
文档编号C12N1/12GK1111282SQ9410496
公开日1995年11月8日 申请日期1994年5月3日 优先权日1994年5月3日
发明者谢德源 申请人:台湾绿藻工业股份有限公司