作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌的制备方法

专利名称：作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌的制备方法
作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种
菌的制备方法
技术领域：
本发明涉及作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌的制备方法。另外，本发明涉及使用上述种菌的包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料的制备方法。
背景技术：
近年，从要构筑循环型社会的观点出发，控制化学肥料的使用，推进有机质肥料的 使用的活动在世界范围内活发地进行。番茄等的蔬菜或花卉等的生产种呈现普遍性的，不使用土壤的‘营养液栽培’中 也，为了活用有机质肥料，期待提高。但是，营养液栽培中以往无法利用有机质肥料。这是由于，向营养液中直接添加有 机物，则发生有害的中间分解产物，及植物的根损伤。所以，以往，营养液栽培中仅一直使用 化学肥料。多个研究者认为在营养液栽培中活用有机质肥料中，必要预先将有机物无机化而 使成为植物容易吸收的物质的技术。作为将有机物无机化的技术，有利用微生物群的排水处理技术(参照例如，专利 文献1)等。但是，这些由于伴随脱氮反应(将硝态氮还原而作为氮气而放出的反应)，对于回 收硝态氮而言不适合，未符合在包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料中利用的目的。从而，作为可从有机物回收硝态氮(作为硝酸根离子)，而作为无机肥料成分而利 用的技术，发明了专利文献2及非专利文献2所述的“并行复式无机化法”。此技术是可抑制脱氮反应之同时分解有机态氮，及将硝态氮的硝酸根离子作为无 机肥料成分而回收的再现性高的方法。所述技术是通过利用进行有机物的分解(氨化作 用)及硝酸根离子的生成(硝化作用)的微生物群在相同反应系统中依次增殖，在相同反 应液中并行而进行氨化作用及硝化作用的技术。此反应与上述排水处理技术等不同，可抑 制脱氮反应。通过用此并行复式无机化法的技术，变得可在营养液栽培中直接添加有机质肥料 而利用，再通过转用此技术，将有机物无机化为硝态氮而制备无机肥料成分成为可能(参 照例如，非专利文献1，非专利文献2)。此专利文献2所述的发明，作为实现活用有机质肥料的营养液栽培的同时，将有 机质资源作为原料，而实现硝态氮等的无机肥料成分的制备的技术而受到关注。因此，作 为新的营养液栽培技术而受到农家或植物工场，计划有机质资源的再资源化的企业等的关 心，集合了颇大的期待。但是，上述专利文献2所述的方法中，作为微生物源而仅利用了土壤或湖沼水等“源于自然的微生物源”。这些微生物源由于算不上对于并行复式无机化反应优化者，以往的并行复式无机 化法中，留下要在使用方面改善的以下的课题。S卩，首先第1课题是至反应结束耗时长。这由于，“源于自然的微生物源(土壤或 湖沼水等)”由于未对于并行复式无机化反应优化，从而每当进行氨化作用反应，然后向硝 化作用反应的反应时，不得不等待进行分别的反应的微生物群依次增殖。具体而言，至反应结束所经的时间必要约2周以上，因此，发生营养液栽培的苗的 定植适期不符合等的问题。接下来第2课题是无法一次大量添加有机物。如上述，“自然界来源的微生物源” 由于未对于并行复式无机化反应优化，这中含的硝化菌(进行硝化作用的微生物)成为弱 于有机成分的曝露的状态，如果接受大量的有机成分的曝露，则死亡。因此，‘培养过程’中 一次大量添加有机物时，不能进行硝化作用反应，无法回收硝态氮。具体而言，对于反应系统的水(溶液)IL而言，每1次添加约2g的有机物是上限。 因此，要回收高浓度的硝态氮时，由于不得不将有机物的添加作业分成数次(优选为每日) 添加，有操作变得烦杂的问题。然后第3课题是微生物源的添加量增大。这由于上述自然界来源的微生物源未成为对于并行复式无机化反应优化者(微 生物生态系统)，成为对于硝化菌有机成分的曝露极其弱的状态，因此，无法避免受由硝化 菌有机成分的曝露的大的损伤，不得不使成为考虑由该损伤的损失的添加量的大小。具体而言，对于反应系统的水(溶液)1L而有必要添加5g左右以上的土壤。如果 是其以下的添加量，则有硝化菌由有机成分的曝露而死亡，无法回收硝态氮的担忧。另外，不得不添加大量微生物源在营养液栽培的现场成为问题。营养液栽培的现 场由于用到吨单位的营养液，预计不得不向营养液投入与数千相当的土壤。但是，如果添加 那样的量的土壤，则使土壤粒子流路浑浊的等的问题产生变得容易。而且，如果达到这投入量，则土块增大，其内部容易成为厌氧性，喜好厌氧条件的 环境的脱氮菌(进行脱氮反应的微生物群)繁殖，及有成为硝态氮氮气而损失等的担忧。另 外，厌氧性微生物被植物摄取而分泌不优选成分(Phytotoxic)，及使植物的生长恶化。因此，要求开发大幅度缩减微生物源的添加量的技术。从而要求开发，为了进行并行复式无机化反应而从有机物生成作为无机肥料成分 的硝态氮，解决上述3个课题，可以适于实用化的水平有效进行的方法。专利文献1 特开2001-300583号公报专利文献2 特开2007-11拟60号公报非专利文献1 研究夕弋一 f ^ 2008年，31 (1) 44-46页非专利文献2 “有機肥料O養液栽培”農業及K園芸，第81卷p. 753-764 (2006 年)

发明内容发明要解决的技术课题本发明为了解决上述的课题，以提供如下方法作为课题从有机物生成作为无机肥料成分的硝态氮的并行复式无机化反应中，可大幅缩短至将有机物无机化为硝态氮的反 应结束的时间，可一次大量添加有机物，其结果，可有效生成高浓度的硝态氮，且，可大幅度 缩减微生物源的添加量。解决课题的技术方案本发明人发现了，在从有机物生成作为无机肥料成分的硝态氮的并行复式无机化 反应中，通过将‘作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌’作为微生物 源使用，可大幅缩短至将有机物无机化为硝态氮的反应结束所经的时间，可一次大量添加 有机物，其结果，可有效生成高浓度的硝态氮，且，可使大幅度缩减微生物源的添加量。再有，作为包括进行氨化作用的微生物群及进行硝化作用的微生物群的微生物 源，已知的有热带鱼饲育用(饲育水的过滤用)的种菌或排水处理场的活性污泥。但是热带鱼饲育用者由于毕竟以整备鱼的生长环境为目的，着力于除去氮，多为 使包括进行脱氮反应的微生物群(脱氮菌)。这样的话由于硝态氮损失，至今未有提供可生 成高浓度的硝态氮者。另外，排水处理场的活性污泥，也由于促进脱氮反应是重要的目的，多含进行脱氮 反应的微生物群(脱氮菌)。因此，这些不认为是‘作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群’。本发明基于这些见解完成。S卩，实施方式1涉及的发明是种菌的制备方法，其特征在于，在可贮存水的容器中 放置水，接种进行并行复式无机化反应的微生物群，及通过维持并行复式无机化反应在上 述水中进行的环境，培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群；及使在与上述水接触 的固体表面形成生物膜，接下来，回收所述生物膜；及将回收的上述生物膜作为种菌，所述 种菌是作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌。实施方式2涉及的发明是实施方式1所述的种菌的制备方法，其中上述进行并行 复式无机化反应的微生物群的接种是将选自下列的1种以上接种土壤，树皮堆肥，及天然 存在的水。实施方式3涉及的发明是实施方式2所述的种菌的制备方法，其中所述并行复式 无机化反应在上述水中进行的环境是每1 7天对于上述水IL添加以干燥重量换算各 0. 05 Ig的有机物的环境。实施方式4涉及的发明是种菌的制备方法是，其特征在于，在可贮存水的容器中 放置水，接种由实施方式1 3中任一项所述的种菌的制备方法得到的种菌，及在并行复式 无机化反应在上述水中进行的环境下，培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群；及 使在与上述水接触的固体表面形成生物膜，接下来，回收所述生物膜；及将回收的上述生物 膜作为种菌，所述种菌是作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌。实施方式5涉及的发明是实施方式4所述的种菌的制备方法，其中所述并行复式 无机化反应在上述水中进行的环境是对于上述水IL添加以干燥重量换算0. 01 IOg的有 机物的环境。实施方式6涉及的发明是实施方式1 5中任一项所述的种菌的制备方法，其中 所述并行复式无机化反应在上述水中进行的环境是将上述水中维持为好氧的条件的环境。实施方式7涉及的发明是实施方式6所述的种菌的制备方法，其中上述好氧的条件通过曝气或者振荡维持。实施方式8涉及的发明是实施方式1 7中任一项所述的种菌的制备方法，其中 所述并行复式无机化反应在上述水中进行的环境是将上述水中维持为15 37°C的水温的 环境。实施方式9涉及的发明是实施方式1 8中任一项所述的种菌的制备方法，其中 与上述水接触的固体表面是上述容器的壁面及/或底面。实施方式10涉及的发明是实施方式3，5 9中任一项所述的种菌的制备方法，其 中，在上述水中培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群时，上述水中生成的硝酸根 离子浓度达到10 30mg/L时，通过停止上述有机物的添加，抑制上述形成的生物膜中进行 脱氮反应的微生物群增殖地培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群。实施方式11涉及的发明是实施方式1 10中任一项所述的种菌的制备方法，其 中上述生物膜的回收是将培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的培养 液的上清废弃，之后回收在上述固体表面上形成的生物膜。实施方式12涉及的发明是实施方式1 11中任一项所述的种菌的制备方法，其 中上述生物膜的回收是作为将以下物质混合的混合液而回收上述固体表面上形成的生物 膜，与培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的培养液的上清。实施方式13涉及的发明是实施方式11或12中任一项所述的种菌的制备方法，其 中，将上述形成的生物膜回收之后，通过离心分离或过滤除去额外的水分。实施方式14涉及的发明是实施方式11所述的种菌的制备方法，其中，将上述培养 液的上清废弃之后进行干燥处理。实施方式15涉及的发明是实施方式13所述的种菌的制备方法，其中，将上述额外 的水分除去之后进行干燥处理。实施方式16涉及的发明是实施方式1 15中任一项所述的种菌的制备方法，其 中上述种菌是在进行50 80°C的加热时不丧失作为种菌的功能的种菌，所述种菌是作为 并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌。实施方式17涉及的发明是实施方式1 16中任一项所述的种菌的制备方法，其 中上述种菌包括进行氨化作用的微生物群，且相对Ig上述种菌包括1万 1亿细胞的进行 硝化作用的微生物群。实施方式18涉及的发明是作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群 的种菌，其由实施方式1 17中任一项所述的种菌的制备方法得到。实施方式19涉及的发明是包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料的制备方法， 其特征在于，在可贮存水的容器中放置水，向其中添加实施方式18所述的上述种菌；及通 过维持作为并行复式无机化反应在上述水中进行的环境来使在上述水中进行并行复式无 机化反应，所述环境是如下环境添加有有机物、且温度维持于15 37°C、且维持为成为好 氧的条件；得到包括100mg/L以上的硝酸根离子的反应液；将得到的上述反应液作为肥料， 所述肥料包括作为无机肥料成分的硝态氮。实施方式20涉及的发明是实施方式19所述的肥料的制备方法，其中，上述有机物 的添加是可一次添加至对于上述水IL而以干燥重量换算不超过IOg的量。实施方式21涉及的发明是实施方式19或20中任一项所述的肥料的制备方法，其
8中，可以不超过8天的天数得到生成有100mg/L以上的硝酸根离子的反应液。实施方式22涉及的发明是实施方式19 21中任一项所述的肥料的制备方法中， 上述种菌的添加是对于上述水IL而添加不低于0. Olg的量。实施方式23涉及的发明是实施方式19 22中任一项所述的肥料的制备方法，其 中，进行并行复式无机化反应时不伴随脱氮反应。实施方式M涉及的发明是包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料，其由实施方 式19 23中任一项所述的肥料的制备方法得到。实施方式25涉及的发明是植物的栽培方法，其使用实施方式M所述的包括作为 无机肥料成分的硝态氮的肥料。实施方式沈涉及的发明是植物的栽培方法，其在实施方式20 25中任一项所述 的上述反应液中直接添加包括有机物的肥料而进行营养液栽培。实施方式27涉及的发明是实施方式25或沈所述的植物的栽培方法，其中，上述 植物是叶菜类的蔬菜，以果实作为收获对象的果菜，果树，树木，或花卉。发明效果本发明可使提供‘作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌’。由此本发明在从有机物生成作为无机肥料成分的硝态氮的并行复式无机化反应 中，可大幅缩短至将有机物无机化为硝态氮的反应结束所经的时间，可一次大量添加有机 物，其结果，可有效生成高浓度的硝态氮，且，可使大幅度缩减微生物源的添加量。另外，本发明可使多含氮的有机质资源，食品废弃物快速分解，而变换为包括硝态 氮的无机肥料。实施方式本发明涉及从有机物生成作为无机肥料成分的硝态氮的并行复式无机化反应中， 作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌的制备方法。另外，本发明涉及使用上述种菌的包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料的制备方法。再有，图1的(a) (c)是示本发明的作为并行复式无机化反应的催化剂而优化 的微生物群的种菌的制备方法的实施方式的说明图。详细而言，图1 (a)是作为微生物群的接种源而用‘自然来源者(土等)’的实施方 式的说明图。另外，图1(b)是作为微生物群的接种源而用‘本发明的种菌’的实施方式的 说明图。另外，图1(c)是作为微生物群的接种源而用‘容器(固体表面)中残留的生物膜’ 的实施方式的说明图。本发明中，作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌的制备如 下进行在可贮存水的容器中放置水，接种进行并行复式无机化反应的微生物群，及通过维 持并行复式无机化反应在上述水中进行的环境，培养上述进行并行复式无机化反应的微生 物群；及与在上述水接触的固体表面上形成生物膜(微生物群集结构)，接下来，回收所述 生物膜。本发明的作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌的制备中 最初的步骤，首先是，‘在可贮存水的容器中放置水，向其中接种进行将有机物无机化而生 成硝态氮的并行复式无机化反应的微生物群，及通过维持并行复式无机化反应在上述水中进行的环境，培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群的’步骤(培养步骤)。再有，本培养步骤可在‘接种上述微生物群之后’，维持进行并行复式无机化反应 的环境，但也可在向‘并行复式无机化反应进行的环境维持的状态的水接种上述微生物群 之后’，维持所述环境。作为本步骤中使用的“可贮存水的容器”，只要是可贮存水的容器，则可用任意者。可举出例如，水槽，罐，桶，箱，贮水槽，浴槽，池，等的可贮存比较大量的水的容器， 三角瓶，烧杯，试管等的可贮存比较少量的水的容器，等。具体地，可用罐，箱，三角瓶。另外，大规模的生产或工业上实用时，可用贮水槽， 池。再有，再优选为，对于体积，与水接触的容器的固体表面的面积大，并且，为使难以 产生厌氧的状态，优选水流停滞的部分少的结构的两全。另外，上述容器中，可通过放入上述微生物群容易定着的固体载质(通过使放置 水时浸渍)，增加上述微生物群的生物膜形成的面积。具体而言，可用竹炭，木炭，珍珠岩，海沙，蛭土，陶瓷，沸石，玻璃，岩棉，氨基甲酸 乙酯，尼龙，蜜胺树脂等的固体载质。另外，上述容器中，通过使板(板状物)或柱状的结构物等的浸渍物浸渍(通过使 放置水时浸渍)，可增加上述微生物群的生物膜形成的面积。作为所述浸渍物，优选脱离容 易，容易从水中拔去的结构者。作为所述浸渍物，具体而言，可用在水中不腐败或腐蚀的材 质的，玻璃，丙烯，塑料，陶器片，陶瓷，等的材质者。作为本步骤中使用的水，可用自来水，蒸留水，蒸留纯水，井水，河川水，湖水，海水寸。作为水的量，只要是对于添加的有机物的干燥重量而50倍量以上就无特别制 限，为了得到充分的量的种菌，具体而言，放置0. 001 10000L，优选为，优选放置0.01 1000L的量的水。本发明中“并行复式无机化反应”是指将有机物无机化而生成硝态氮的反应，从有 机物向氨态氮的分解(氨化作用)和从氨态氮向硝态氮的硝化(硝化作用)在相同的反应 系统中连续进行。详细而言，是指有机物的分解中，有机物中含的有机态氮分解为氨态氮，氨态氮经 由硝化作用的硝化(氧化)而生成硝态氮的反应。再有，本发明中，将有机物无机化而生成的硝态氮是指，硝酸根离子或硝酸盐，具 体而言，假定是硝酸根离子。用本培养步骤“接种”的“进行并行复式无机化反应的微生物群”只要是包括进行 氨化作用的微生物群及进行硝化作用的微生物群，在后述指定的环境下培养时，可进行并 行复式无机化反应者即可。再有，作为构成上述微生物群的微生物群的种类，可举出作为进行氨化作用的 微生物群，例如原生动物或，细菌，绳状菌等的氨化作用菌；作为进行硝化作用的微生物群 (硝化菌)，氨氧化菌(或者亚硝酸生成菌)的亚硝化胆胞菌属，亚硝化球菌属，亚硝化螺菌 属(包括亚硝化叶菌属，亚硝化弧菌属)亚硝酸氧化菌(或者硝酸生成菌)的硝化杆菌属， 硝化螺菌属等。
作为本步骤中进行并行复式无机化反应的微生物群的接种源，具体而言，可通过 添加土壤，树皮堆肥等的堆肥，活性污泥，天然存在的水(具体而言，湖沼水，泉水，井水，河 水，海水等)，等的“自然来源者”来进行。但是，这些自然来源的接种源未必为作为并行复式无机化反应的催化剂而优化 者。所以，将这些作为接种源时，进行并行复式无机化反应的微生物群的培养中，具体而言， 至结束本发明的种菌的制备步骤的全步骤中，有机物的添加量是以对于水IL而Ig以下于 反应温度25°C的情况中，最短也要10天，通常必要15 20天。从而，作为本步骤的上述微生物群的接种源，优选为，适宜接种本发明中得到的 “作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌”。作为所述“种菌”，如以下详述，是所述培养步骤之后回收上述固体表面上形成的 生物膜(微生物群集结构)者，或者，以含有所述生物膜的方式回收。通过将所述种菌作为本步骤的上述微生物群的接种源而添加，可使所述培养步骤 迅速结束。具体而言，至结束本发明的种菌制备的全步骤，有机物的添加量是以对于水IL 而Ig以下于反应温度25°C的情况中，最长也不超过8天的天数，通常可使以4 8天结束。S卩，可将本发明的种菌制备的全步骤所经的时间缩短为约一半，可通过增加运转 次数大幅度提高制备效率。再有，回收所述生物膜之后，对于容器(固体表面)中残留的生物膜，也作为与所 述“种菌”有同样的功能者，可作为本培养步骤的接种源而使用。实际的制备中，在尚未得到本发明的“种菌”的阶段中，将上述“自然来源者”(土 壤，树皮堆肥，天然存在的水等)作为本步骤的上述微生物群的接种源而使用，之后的得到 本发明的种菌后，从如上所述的效率性的观点出发，优选使用所述“种菌”。本培养步骤的所述微生物群的接种中，作为添加上述接种源的量，虽然不特别限 定，但添加“自然来源者”(土壤，树皮堆肥，自然水等)时，有必要对于上述容器中放置的水 而大量添加。具体而言，土壤或树皮堆肥的情况中，对于上述容器中放置的水IL而添加1 10g，及天然存在的水的情况中，可以对于上述容器中放置的水IL而取代100 IOOOml的 方式(对于全量而天然存在的水成为10 100%的方式)添加。对此，将本发明的“种菌”作为上述接种源而添加的情况，可大幅度缩减添加量，对 于上述容器中放置的水1L，而添加以干燥重量换算0. 005 Ig即可。具体而言，对于上述容器中放置的水1L，而干燥菌体物的情况可添加0. 005 lg， 湿润菌体物的情况可添加0. 05 10g。另外，添加生物膜与培养液的上清的混合液的情况 中，可以对于上述容器中放置的水IL而取代1 500ml的形式(对于全量而混合液成为 1 50%的方式)添加。再有，将回收所述生物膜之后容器(固体表面)中残留的生物膜作为上述接种源 而使用时，通过对于所述容器中所述生物膜以干燥重量换算0. 005 lg，而加入水1L，可制 备接种所述微生物群的水。本培养步骤中，“并行复式无机化反应在上述水中进行的环境”是指，具体而言，将 上述水中维持为好氧的条件，上述水中添加有有机物，还有，将上述水中维持为15 37°C 的水温的环境。
可通过维持这样的环境来培养进行并行复式无机化反应的微生物群。本培养步骤中，可通过上述水中“维持为成为好氧的条件”，设为提高上述水中的 溶存氧浓度而适于进行并行复式无机化反应的微生物群的活动的条件。另外，进行脱氮反应的微生物群(脱氮菌)，由于在厌氧条件下变得容易活动，对 于抑制进行脱氮反应的微生物群的增殖也适宜。作为将上述水中维持为成为好氧的条件的方法，可进行曝气，振荡，高浓度氧溶 解，高浓度含氧水的利用等。优选为，可通过曝气，振荡来进行。本培养步骤中，对于进行并行复式无机化反应而言适合的“水温”是指，即，适于进 行并行复式无机化反应的微生物群的生长的水温。具体而言，15 42°C，优选为15 37°C， 再优选为20 37°C，最优选为维持于25°C左右者。再有，温度低于15°c的情况中，由于微生物的增殖迟延，及培养需要时间而不优 选。另外，温度高于42°C的情况中，对于进行并行复式无机化反应的必要的微生物的一部分 死亡，所以不优选。本培养步骤中，作为添加到上述水中的“有机物”，可用比如有机质肥料或，食品残 渣，植物残渣，畜产废弃物，排泄物的有机质资源等，任意者，但使用作为碳与氮的含有比C/ N比11以下，优选为10以下的高氮含有有机物在提高硝态氮的回收效率方面优选。作为上述有机物，优选多包括蛋白，蛋白分解物，氨基酸，等，具体而言，可举出鱼 煮汁，玉米浸渍液，油粕，鱼粉，牛乳，大豆粕，酵母粕，酒粕，烧酒粕，生垃圾等的食品残渣 等。再有，这些是食品制备过程中得到的废弃物，在不含如有毒性的成分的方面优选。另外上述中，再优选使用鱼煮汁，玉米浸渍液，油粕。具体地，作为鱼煮汁，可举出 鲣煮汁。另外，作为玉米浸渍液，可举出玉米浆(CSL 制备玉米淀粉时的副产物的玉米浸渍 液)。另外，作为油粕，可举出菜种油粕。再有，作为所述有机物，可用又可为液体状态又可为粉末状态的有机物，特别是， 鲣煮汁，玉米浆由于容易在作为液体的上述水中均一地扩散的方面优选。本培养步骤中，向上述水中“添加有机物的”方法根据上述微生物群的接种源的种 类变得不同。即，作为上述接种源而添加“自然来源的微生物源”(土壤，树皮堆肥，自然水等) 时，为了防止这中含的硝化菌暴露于有机物而死亡，要对于水IL而将有机物以1天2g以下 ‘一点点’添加(缓慢添加)。具体而言，每1 14天，优选为每1 7天，再优选为连日，对于上述水IL而优选 添加各0. 01 2g(干燥重量换算)，优选为各0. 05 Ig (干燥重量换算)。例如，使用菜 种油粕时可添加0.01 2g。所述有机物是液体状态的情况中，干燥重量换算的值在所述范围即可。例如，使用 鲣煮汁时，可添加以液体重量0. 01 2g(以干燥重量换算0. 007 1. 4g)，使用玉米浆时， 可添加以液体重量0. 01 2g(以干燥重量换算0. 005 Ig)。另外，作为上述接种源而添加本发明的“种菌”时，这中含的硝化菌由于对于有机 成分的曝露抗性升高，可对于水IL而‘一次’添加不超过IOg的量的有机物。具体而言，‘培养初日，对于上述水IL而优选添加0.01 10g(干燥重量换算)， 优选为0. 05 5g(干燥重量换算)。例如，使用菜种油粕时可添加0. 01 10g。
12
另外，所述有机物是液体状态的情况中，干燥重量换算的值在所述范围即可。例 如，使用鲣煮汁时，可添加以液体重量0. 01 IOg (以干燥重量换算0. 007 7g)，使用玉米 浆时，可添加以液体重量0. 01 IOg (以干燥重量换算0. 005 5g)。本培养步骤中，作为上述进行并行复式无机化反应的微生物群的“培养时间”，至 添加的有机物中含的氮中的一半作为硝酸根离子而生成，优选为，进行至培养液的硝酸根 离子的浓度升高达到顶点。再有，作为上述环境下培养的情况(培养至培养液的硝酸根离子的浓度升高达 到顶点的情况)所经的具体的天数，有机物的添加量对于水IL而是Ig以下，反应温度是 25°C，作为上述接种源而添加“自然来源的微生物源”(土壤，树皮堆肥，自然水等)时，最短 也10天，通常是15 20天。另一方面，有机物的添加量对于水IL而是Ig以下，反应温度是25°C，添加本发明 的“种菌”时，最长也不超过8天的天数，通常是4 8天。本培养步骤中，在培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群时，抑制形成的 生物膜中进行脱氮反应的微生物群增殖地培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群。‘脱氮反应’是指，由进行脱氮反应的微生物群(脱氮菌)硝态氮还原为氮气或氧 化亚氮气体等，硝态氮损失的现象，此反应是成为脱氮菌的能源的有机成分存在的条件与 作为脱氮菌的氧供给体的硝态氮生成的条件的二个条件同时成立时容易诱发的反应。从而，本发明中优选，在上述水中硝态氮开始生成前或生成即刻，通过停止上述有 机物的添加，抑制进行脱氮反应的微生物群(脱氮菌)的增殖地，培养上述进行并行复式无 机化反应的微生物群。具体而言，优选上述水中生成的硝态氮，以硝酸根离子换算达到10 50mg/L，优 选达到10 30mg/L时(达到前或达到即刻)，停止上述有机物的添加。再有，进行脱氮反应的微生物群(脱氮菌)由于在厌氧条件下变得容易活动而，优 选将上述水中维持于好氧的条件。通过进行上述培养步骤，在与上述水接触的固体表面形成上述进行并行复式无机 化反应的微生物群的生物膜之后，接下来，进行将上述生物膜回收的步骤(回收步骤)。其中，与上述水接触的”固体表面”是指，具体而言，与上述容器的壁面，底面，容器 不同地在水中浸渍的固体载质的表面，是指与容器不同地在水中浸渍的板的表面。再有，从生物膜回收的操作性的观点出发，使上述微生物群的生物膜形成的固体 表面，在上述容器的壁面及/或底面的情况中，优选有难以滞留水流的结构，水中浸渍的固 体载质或板的情况中，优选脱离容易，从水中拔去容易的结构者。本步骤中，上述“生物膜的回收”是指，回收在上述固体表面上形成的生物膜，或 者，是指以含有所述生物膜的方式回收。具体而言，有(1)将培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的培 养液的上清废弃，之后回收在上述固体表面上形成的生物膜的情况，以及( 作为将上述 固体表面上形成的生物膜与培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的培 养液的上清混合的混合液而回收的情况。再有，图2(c)中示本发明中生物膜的回收方法的 实施方式的模式图。(1)的方法是，将培养液的上清废弃之后，回收固体表面上形成的生物膜的方法。
这时，培养液的上清的废弃可通过从排水口的排水，倾注(倾斜容器而废弃上清 的方法)，吸引废弃，蒸发干燥等进行，通过从排水口的排水，倾注，吸引废弃进行结构在简 易，且处理也容易的方面优选。将培养液的上清废弃之后，具体而言，可通过刮容器表面，浸渍的固体载质，浸渍 的浸渍物等的表面来采取生物膜而回收。如此回收的生物膜作为‘湿润菌体物’回收。另 外，也可在保持附着了生物膜的载质的方式，作为本发明的湿润菌体物而回收。(2)的方法是将上述固体表面上形成的生物膜与培养上述进行并行复式无机化反 应的微生物群之后得到的培养液的上清混合之后，作为‘混合液’而回收的方法。此情况的上述形成的生物膜与上述培养液的上清的混合是指，具体而言，形成的 生物膜可通过用刷具或擦具等刮以物理的方式刮而与培养液的上清充分混合或通过迎着 水流刮生物膜而混合或使容器全体振动而刮生物膜而混合进行。另外，所述混合液中，对于上述生物膜的培养液的上清的量，优选为，对于生物膜 Ig而0. 5 IOOml左右。上述培养步骤中形成的“生物膜”多包括进行并行复式无机化反应的微生物群，多 包括进行氨化作用的微生物群与进行硝化作用的微生物群(硝化菌)。尤其是，对于作为固 体表面定着性的回收进行硝化作用的微生物群(硝化菌)而言适合。再有，培养进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的“培养液的上清”，在 进行并行复式无机化反应的微生物群中虽然包括进行氨化作用的微生物群的，但几乎不含 进行硝化作用的微生物群(硝化菌)。因此，‘仅培养液的上清’中，由于对于硝化反应而几乎无活性，不适于进行并行复 式无机化反应的微生物群的种菌。S卩，本发明中，如上述的(1)或( 的方法，可将固体表面上形成的生物膜回收者， 或者，以含有所述生物膜的方式回收者作为‘作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的 微生物群的种菌’。再有，考虑到种菌的储存，输送的问题，优选利用用容易缩减容积，重量的(1)的 方法采取的生物膜的方法。另外，在不特别以储存，输送为目的的情况中，将生物膜与培养液的上清混合(2) 方法，在操作性最容易的方面优选。通过上述的(1)或O)的方法回收的生物膜可作为本发明的‘作为并行复式无机 化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌’，还有，这些回收的生物膜可通过离心分离或过 滤作为除去额外的水分的‘湿润菌体物’而回收。再有，本处理中，也可进行离心分离与过 滤的两方组合。本处理中，离心分离，可通过以不给微生物应激的离心速度(2000 20000 Xg)离 心来进行。另外，过滤可通过将湿润生物膜或生物膜与培养液培养液的上清的混合液，使用 滤纸，布等过滤来进行。再有，本处理中优选为，作为水分含量90%以下的湿润菌体物而回收。本回收步骤中，可通过进行干燥处理，而将作为并行复式无机化反应的催化剂而 优化的微生物群的种菌以‘干燥菌体物’的形状回收。将本回收步骤通过上述(1)的方法进行时，将上述培养液的上清废弃之后，可进行干燥处理。具体而言，将上述培养液的上清废弃之后，形成的生物膜附着于上述固体表面 的状态下，可进行干燥处理。或，集合形成的湿润状态的生物膜后，也可进行干燥处理。另外，将本回收步骤通过上述(1)或O)的方法进行后，而且，通过离心分离或过 滤除去额外的水分时，回收湿润菌体物之后进行干燥处理，可作为干燥菌体物。作为所述干燥处理，可进行风干，干热处理，减压干燥等。具体而言，可通过在室温 (15 37°C )的温度条件，使进行1小时 一晚左右(6 14小时左右)，优选为一晚左右 (6 14小时左右)风干。再有，本干燥处理中，优选为，水分含量20%以下的干燥菌体物。本发明的“作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌”可通过 经过上述步骤制备。作为所述种菌的形状，可作为湿润菌体物，干燥菌体物(干燥处理后的菌体物)， 液体状(生物膜与培养液的上清的混合液)，保持附着生物膜的固体载质等的形状而制备。优选为，从保存，流通的观点(往别的场所输送·储存的目的)或，具备干燥种菌 耐热性的观点，或减少接种量而使操作性提高的观点等出发，优选以‘干燥菌体物’的形状 制备。另外，要在相同场所再度进行并行复式无机化反应时，由制备所述种菌的步骤的 简易性，优选以‘湿润菌体物’或‘液体状’的形状制备。作为本发明的所述种菌示如下微生物组成包括进行氨化作用的微生物群，且，对 于得到的所述种菌lg，包括1万 1亿细胞的进行硝化作用的微生物群(硝化菌)。作为本发明的所述种菌，不经并行复式无机化反应的经过，不是形成进行氨化作 用的微生物群与进行硝化作用的微生物群的协同时，由于由有机成分的大量曝露，进行硝 化作用的微生物群死亡变得容易，丧失硝化能力而无法进行并行复式无机化反应，从而不 优选。即，本发明的所述种菌中，进行氨化作用的微生物群与进行硝化作用的微生物群 通过协同，及相互作用，在有机成分存在下也维持进行硝化作用的微生物群的硝化能力。作为本发明的所述种菌，即便进行50 80°C，优选为50 60°C，更优选为50°C的 加热，也不丧失作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌作为的功能。 另外，对于所述加热耐受的时间是0. 1 12小时左右，优选为30分钟左右。此耐热性在可避免由假定所述种菌的输送·储存时的车内，或仓库内的高温失活 的方面示有效性。本发明的所述种菌，使用进行并行复式无机化反应的微生物群而从有机物生成作 为无机肥料成分的硝态氮时，可作为“作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物 群”的‘微生物源’使用。本发明中，通过使用‘进行并行复式无机化反应的微生物群而从有机物生成作为 无机肥料成分的硝态氮’，具体而言，可“制备包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料”。本发明中，包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料的制备(肥料制备步骤)如下 进行在可贮存水的容器中放置水，向其中添加本发明的‘上述种菌’；及通过维持作为并行 复式无机化反应在上述水中进行的环境的，”添加有有机物、且温度维持于15 37°C、且维 持为成为好氧的条件的环境”，使在上述水中进行并行复式无机化反应；得到包括100mg/L以上的硝酸根离子的反应液；回收得到的上述反应液。再有，本肥料制备步骤可在‘添加上述种菌之后’维持并行复式无机化反应进行 的环境，但也可在‘向维持并行复式无机化反应进行的环境的状态的水中添加上述种菌之 后’，维持所述环境。作为本步骤中使用的“可贮存水的容器”，只要是可贮存水，具有使溶存的氧容易 扩散的结构的容器，则可用任意者。例如，可举出水槽，罐，桶，箱，贮水槽，浴槽，池，等的可贮存比较大量的水的容器， 三角瓶，烧杯，试管等的可贮存比较少量的水的容器，等。具体而言，可用罐，箱，三角瓶。另外，在大规模的生产或工业上实用时，可用贮水 槽，池。作为本步骤中使用的水，可用自来水，蒸留水，蒸留纯水，井水，河川水，湖水，海水寸。作为水的量，只要是对于添加的有机物的干燥重量而50倍量以上就无特别制限， 为了得到充分的量的肥料，具体而言，放置0. 001 10000L，优选为，放置0. 01 1000L的 量的水。本肥料制备步骤中，作为添加作为‘微生物源’的本发明的所述种菌的量，对于上 述容器中放置的水IL而不低于0. Olg的量，优选为，不低于0. 2g的量。所述种菌仅添加了 低于0. 2g的量时，由于并行复式无机化反应的结束的时间迟延，从而不优选。再有，以往的方法是，将树皮堆肥等作为微生物源而添加时，有必要对于水IL而 添加约5g以上。S卩，通过使用本发明的所述种菌作为微生物源，相比以往方法，可使微生物源的添 加量大幅度缩减至约1/50倍，优选为，约1/25倍。本肥料制备步骤中，为了维持进行并行复式无机化反应的环境，有必要‘维持添加 有有机物、且温度维持于15 37°C、且维持为成为好氧的条件的环境’。通过维持这样的环境，使所述水中的作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的 微生物群增殖，使可迅速进行并行复式无机化反应，还有，可‘不伴随脱氮反应地’生成无机 肥料成分的硝态氮。在本肥料制备步骤中，通过上述水中“维持为成为好氧的条件”，可成为提高上述 水中的溶存氧浓度，适于进行并行复式无机化反应的微生物群的活动的条件。另外，进行脱氮反应的微生物群(脱氮菌)由于在厌氧条件下变得容易活动而，对 于为了抑制进行脱氮反应的微生物群的增殖也适宜。作为将上述水中维持为成为好氧的条件的方法，可进行曝气，振荡，高浓度氧溶 解，高浓度含氧水的利用等。优选可通过曝气，振荡进行。本肥料制备步骤中，对于进行并行复式无机化反应而言适合的“水温”是指，S卩，适 于进行并行复式无机化反应的微生物群的生长的水温。具体而言，15 42°C，优选为15 37°C，再优选为20 37°C，最优选为维持于25°C左右者。再有，温度低于15°C情况中，由于微生物的增殖迟延，及反应需要时间而不优选。 另外，温度高于42°C情况中，由于对于进行并行复式无机化反应的必要的微生物的一部分 死亡而不优选。
本肥料制备步骤中，向上述水中的“有机物的添加”由于所述种菌作为并行复式无 机化反应的催化剂而优化结束，可1次大量添加。具体而言，可一次添加至对于上述水IL而不超过20g(干燥重量换算)的量，优选 为不超过IOg的量。再有，本步骤中有机物的添加可在所述反应开始前添加，也可在反应开始后再添 加。再有，所述有机物可以液体状态又可以粉末状态添加。具体而言，所述有机物为液体状态的情况中，使用鲣煮汁时可添加0. 1 IOg(液 体重量(以干燥重量换算0. 07 7g))，使用玉米浆时可添加0. 1 IOg (液体重量(以 干燥重量换算0. 05 5g))，使用菜种油粕时可添加0. 1 IOgo再有，以往的方法是，将树皮堆肥等作为微生物源而添加时，对于水IL而一次仅 添加至不超过约2g的量。将所述种菌以外者作为‘微生物源’而添加时，每水IL添加超过2g的有机物，则 由于内在的硝化菌由有机成分的大量曝露而死亡，及丧失硝化能力而无法进行并行复式无 机化反应，算不上适于并行复式无机化反应的微生物群。S卩，通过将本发明的所述种菌作为微生物源使用，相比以往方法，可增加可一次添 加的有机物的添加量至约10倍，优选为，约5倍。本肥料制备步骤中，开始培养起，可在不超过8天的天数，优选为4 8天得到包 括100mg/L以上，优选为200mg/L以上的，以硝酸根离子换算的硝态氮的培养液。另外，还有，开始反应起‘至从有机物向硝态氮的无机化结束’所经的时间，在作为 目标的硝酸根离子浓度在400mg/L时，不超过10天的天数，优选为不超过8天的天数，再优 选为可使以4 8天结束。再有，其中‘至从有机物向硝态氮的无机化结束’是指“至生成的硝态氮的浓度达 到顶峰”的时间。再有，以往的方法是，将树皮堆肥等作为‘微生物源’而添加时，开始反应起‘至从 有机物向硝态氮的无机化结束’的时间，最短也10天，通常必要15天以上。S卩，通过将本发明的所述种菌作为‘微生物源’使用，由于可相比以往方法，以约 2倍以上的速度分解，可实现‘至从有机物向硝态氮的无机化结束’的‘反应时间的大幅缩短，。通过本肥料制备步骤，可‘有效’得到所述反应液中包括100mg/L以上，优选为 200mg/L以上，再优选为400mg/L以上的‘高浓度’的硝酸根离子换算的硝态氮的反应液。 通过回收此反应液，可作为包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料。再有，作为所述制备的肥料，可将上述步骤中得到的反应液直接作为原液使用，但 也可作为稀释2 10倍的与液体肥料，化学肥料混合的液体肥料。另外，也可使干燥化而 加工成浓缩液，固态粉末，固态片状。本肥料制备步骤中得到的，包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料可作为蔬菜， 果实，花木，观叶植物等，所有植物的栽培的肥料而使用。特别是，适宜于用于叶菜类的卷心菜，小松菜，莴苣，菠菜等，作为收获果实的蔬菜 的番茄等，果树，树木，花卉，的栽培。再特别是，可适宜于用于卷心菜，小松菜的栽培。
再有，所述包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料也可在营养液栽培，使用通常 的土壤的栽培等，一般进行的植物的栽培中使用。另外，本发明中，通过将上述肥料制备步骤中得到的‘上述反应液’供给到营养液 栽培的营养液中，使以往难的‘直接添加包括有机物的肥料进行的营养液栽培’成为可能。具体而言，通过在营养液栽培的营养液中，直接进行上述步骤的肥料制备，使向营 养液的包括有机物的肥料的直接添加成为可能。另外，通过将进行上述肥料制备步骤的容器(反应槽)，作为进行营养液栽培装 置，包括有机物的肥料的直接添加而进行营养液栽培成为可能。再有，营养液栽培方法中，营养液内的微生物生态系统的构筑中，将以往的树皮堆 肥等作为‘微生物源’时，每添加量IL必要添加约5g以上，有机物的添加是每IL 一次仅可 添加至2g左右，另外，至反应结束(由于营养液内的微生物生态系统的完成需要时间)通 常经15 20天以上的时间。对此，通过将本发明的种菌作为‘微生物源’而添加，使‘微生物源’的添加量成为 以往方法的约1/50倍，优选为约1/25倍，有机物的添加可成为一次添加至10g，会以至反应 结束约一半以下的天数(不超过8天的天数，优选为4 8天)完成。所述营养液栽培方法可进行蔬菜，果实，花木，观叶植物等，所有植物的栽培。特别是，可适宜用于叶菜类的卷心菜，小松菜，莴苣，菠菜等，作为收获果实的的蔬 菜的番茄等，果树，树木，花卉，的栽培。再特别是，可适宜进行卷心菜，小松菜的栽培。
实施例以下，通过实施例再详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例1种菌的制备生物膜形成与回收作为用于制备作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌的步 骤，‘培养’进行并行复式无机化反应的微生物群，及使生物膜形成而‘回收’(培养步骤及 回收步骤)。向华格纳罐(藤原制作所制)放入IOL的水，将树皮堆肥(商品名Golden树皮， 清水港木材产业协同组合制)以对于水IL而添加了 5g。向其中，连日进行将鲣煮汁(鲣节工场的副产物)以对于水IL而添加(少量地添 加)Ig左右，通过用气泵曝气维持为成为好氧的条件的同时，还于水温25°C将进行并行复 式无机化反应的微生物群培养2周。培养后，在容器的壁面观察到了生物膜的形成。然后， 将培养之后得到的培养液的上清通过倾注去除，废弃。粘接，将所述容器的壁面上形成的生物膜风干一晚之后，通过用金属刮刀刮来回 收，及得到干燥菌体物(本发明实施品1-1)。图1的(a)示本实施例中生物膜的形成及回收方法的模式图。另外，图2示本实 施例中生物膜的形成及回收过程的照片。另外，上述步骤中通过倾注去除培养液的上清而废弃之后，不使风干而将所述容 器的壁面上形成的生物膜用刷具刮而与培养液的上清混合，及以混合液形式回收，及离心 分离而除去额外的水分，及得到了作为沉殿的湿润菌体物(本发明实施品1-2)。实施例2种菌的添加量及反应时间
进行了用进行并行复式无机化反应的过程形成的生物膜是否可作为新的进行并 行复式无机化反应的微生物源而利用的检查。向三角瓶QOOml容)中放入50mL的蒸留纯水，作为微生物源而将实施例1中得 到的干燥菌体物(本发明实施品1-1)以每水IL添加了 0. 2g，0. 4g，或1. 0g。向其中，将鲣煮汁(鲣节工场的副产物)以每水IL添加lg，及通过以120rpm浸透 维持为成为好氧的条件地于水温25°C进行反应16天。再有，作为对照实验，也同时进行作为微生物源而将树皮堆肥(商品名Golden树 皮，清水港木材产业协同组合制)以每水IL添加5g而进行反应的实验。结果示于图3。其结果，将实施例1中得到的干燥菌体物(本发明实施品1-1)作为微生物源而添 加时，至从有机物向硝态氮的无机化结束的反应时间(硝酸根离子浓度的顶峰达到至的时 间)示以6 8天结束。对此，作为对照实验的将树皮堆肥作为微生物源而添加时，示需要13天。因此得知，通过将实施例1中得到的干燥菌体物作为微生物源而添加，相比将树 皮堆肥作为微生物源添加时，至从有机物向硝态氮的无机化结束的反应时间可缩短为大致
一半的天数。再有，以往，土壤或树皮堆肥等，用未对于并行复式无机化反应优化的微生物源 时，如果在添加比较多量的有机物的条件，则由于微生物源中含的硝化菌弱于有机成分的 曝露，容易死亡，有必要大量添加微生物源(微生物源的添加量少，则硝化菌死亡，及硝化 作用进行不了)。具体而言，对于水IL而添加Ig左右的有机物时，对于水IL而需要添加5g 左右的微生物源，但是，微生物源的过量添加过度时(具体而言，对于水IL而添加超过IOg 的量的土壤等时)，成为其自体块状而内部成为厌氧性，脱氮菌变得容易繁殖。但是，如本实施例所示，将在进行并行复式无机化反应的过程形成的生物膜作为 微生物源而添加时，对于水IL而添加量0. 2g也可无问题地进行并行复式无机化反应，并 且，相比添加以往的微生物源时，可缩短至反应结束的反应时间(使用本发明实施品1-1 时，缩短为从14天到8天)。即得知，可将微生物源的添加量减至以往的大概4%，反应时间缩短为约一半。由此结果示，本发明实施品1-1的干燥菌体物可作为‘作为并行复式无机化反应 的催化剂而优化的微生物群的种菌’使用。实施例3有机物的大量添加进行通过进行并行复式无机化反应的过程形成的生物膜作为微生物源使用的情 况，是否可‘将有机物一次大量添加’的检查。向三角瓶QOOml)中放入50mL的蒸留纯水，作为微生物源而将实施例1中得到的 湿润菌体物(本发明实施品1-2)以每水IL添加了 5g。向其中，以‘每水IL 10g’添加鲣煮汁(鲣节工场的副产物)，及通过以120rpm浸 透来维持为成为好氧的条件的同时，还水温于25°C进行反应14天。再有，也同时进行作为对照实验，作为微生物源而将树皮堆肥(商品名Golden树 皮，清水港木材产业协同组合制)对于水IL而添加5g而进行反应的实验。结果示于图4。其结果，将实施例1中得到的湿润菌体物(本发明实施品1-2)作为微生物源而添 加时，将鲣煮汁(鲣节工场的副产物)以‘对于水IL而10g’添加(大量添加有机物)时，示作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群也无问题地增殖，及从有机物生成 作为无机肥料成分的硝态氮。对此，将对照实验的树皮堆肥作为微生物源而添加时，确认氨的发生，未检测到硝 酸根离子(硝态氮)的生成。因此，所述对照实验中示，在氨化作用结束阶段反应停止，及 硝化作用反应未进行(并行复式无机化反应未进行至最终产物)。再有，以往，将算不上最适于并行复式无机化反应的，土壤或树皮堆肥等作为微生 物源使用时，采取增加微生物源的添加量等的对策也有机物的添加容许量的限界至‘对于 水IL而2g左右’。但是，如本实施例所示，得知，将在进行并行复式无机化反应的过程形成的生物膜 作为微生物源而添加时，即便添加大量的有机物(以往的大概5倍量)，也可无问题地进行 并行复式无机化反应而，并从有机物生成作为无机肥料成分的硝态氮。实施例4由湿润菌体物的并行复式无机化反应及该反应速度进行将在进行并行复式无机化反应的过程形成的生物膜的‘湿润菌体物’作为微 生物源而使用而，以什么速度进行并行复式无机化反应的检查。向三角瓶QOOml容)中放入50mL的蒸留纯水，作为微生物源而以对于水IL而5g 添加了实施例1中得到的湿润菌体物(本发明实施品1-2)。向其中以每水IL Ig添加鲣煮汁(鲣节工场的副产物)，及通过以120rpm浸透维 持为成为好氧的条件的同时，还于水温25°C进行反应16天。再有，也同时进行了作为对照实验，作为微生物源而将树皮堆肥(商品名Golden 树皮，清水港木材产业协同组合制)以每水IL 5g添加而进行反应的实验。结果示于图5。其结果，实施例1中得到的，将湿润菌体物(本发明实施品1-2)作为微生物源而 添加时，示至从有机物向硝态氮的无机化结束的反应时间(硝酸根离子浓度的顶峰达到至 的时间)以4天结束。对此，将对照实验的树皮堆肥作为微生物源而添加时，示需要11天。因此，由本实施例的结果，将作为对于并行复式无机化反应优化的微生物源的生 物膜以‘湿润菌体物’的形状添加时，相比利用如树皮堆肥的算不上对于并行复式无机化反 应最适的微生物源时，得知可将至从有机物向硝态氮的无机化结束的反应时间缩短为大致 1/3的天数。比较例1培养液的上清不适于种菌进行了将培养进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的‘培养液的上清’ 作为微生物源而使用而，是否可进行并行复式无机化反应的检查。首先，作为有机物，除了每水IL添加IgCSL(商品名“有机的液肥”，Sakata的种子 制)之外，与实施例1同样地培养了进行并行复式无机化反应的微生物群。然后，培养之后 得到的培养液的上清用移液器吸吐温和回收到(比较制备品1)。接下来，准备向6个三角瓶中添加0. 5g竹炭，珍珠岩，海沙，树皮堆肥，园艺培土 (苗一番)的任何的固体载质者及未添加固体载质者，及加入50ml的蒸留水而高压灭菌。然后，在分别的三角瓶中，作为微生物源而添加了上述培养后的上清(比较制备 品 1) 0. 5ml (对于水 IL 而 IOml)。向其中添加0.5g(每水IL 10g)CSL(商品名“有机的液肥”，Mkata的种子制)，及
20通过以120rpm振荡维持为成为好氧的条件的同时，还于水温25°C进行反应17天。结果示 于图6。其结果，尽管添加了被认为进行硝化作用的微生物群(硝化菌)容易定着的固体 载质，但任何瓶中也仅进行氨化作用，观察不到硝酸根离子(硝态氮)的生成。因此，培养进行并行复式无机化反应的微生物之后得到的培养液的上清中，进行 硝化作用的微生物群(硝化菌)几乎不浮游，即便认为存在也由于极其微少，被认为由于添 加的有机成分的曝露而死亡。因此得知，培养进行并行复式无机化反应的微生物之后得到的培养液的上清不适 合作为催化并行复式无机化反应的微生物群的种菌而利用。实施例5将培养后的培养液的上清与生物膜的混合液作为种菌的方法，及种菌 制备时的有机物的种类将培养进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的培养液的上清与形成的 生物膜混合的‘混合液’作为微生物源而使用来进行并行复式无机化反应。另外，同时检查 了，添加‘鲣煮汁以外的有机物’而进行并行复式无机化反应时，与使用时鲣煮汁同样，可制 备作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌。首先，作为有机物，除了将菜种油粕(Rinoru油脂株式会社制)以对于水IL而添 加Ig左右之外，与实施例1同样地培养了进行并行复式无机化反应的微生物群。然后，将 壁面上形成的生物膜通过用刷具刮以物理的方式刮而与培养液的上清充分混合，及回收了 混合液(本发明实施品5)。接下来，向华格纳罐(藤原制作所制)放入9L的水，作为微生物源而添加了上述 步骤(培养步骤及回收步骤)中得到的IL混合液(本发明实施品5)。向其中添加菜种油粕(Rinoru油脂株式会社制)的粉末IOg (对于水IL而Ig)，及 通过用气泵曝气维持为成为好氧的条件的同时，还于水温25°C进行反应10天。结果示于图 7。其结果示，将上述混合液(本发明实施品5)作为微生物源而添加时，至从有机物 向硝态氮的无机化结束的反应时间(至达到硝酸根离子浓度的顶峰的时间)以6天结束。 另外，此反应结束后的反应液中，生成了超过350mg/L的硝酸根离子。因此示，培养后得到的培养液的上清与形成的生物膜的混合液可作为‘作为催化 并行复式无机化反应的微生物源而优化的种菌’使用。另外示，鲣煮汁以外的生物膜也同样可作为种菌而利用。实施例6培养后的培养液的上清与生物膜的混合液的过滤通过将培养进行并行复式无机化反应的微生物群之后形成的生物膜与得到的培 养液的上清的混合液过滤而得到的湿润菌体物作为微生物源而使用，而进行并行复式无机 化反应。接下来，将此干燥菌体物(本发明实施品7)用200ml的蒸留纯水悬浊，及其中的 50mL(对于水IL而包括37. 5mg的湿润菌体物)放入三角瓶。向其中添加0. 05g(对于水IL而Ig)鲣煮汁(枕崎渔协制)，及通过以120rpm振 荡维持为成为好氧的条件的同时，还于水温25°C进行反应6天。结果示于图8。其结果，将上述步骤中得到的，培养液的上清与生物膜的混合液过滤而将得到的干燥菌体物(本发明实施品7)作为微生物源而添加时，反应开始6天后观察到硝酸根离子 (硝态氮)的生成。因此示，将培养液的上清与生物膜的混合液过滤而得到的干燥菌体物可作为‘作 为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌’使用。实施例7种菌的耐热性进行了通过对作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌施加 ‘加热处理’，对作为种菌的活性有何程度影响的检查。将实施例1中得到的干燥菌体物(本发明实施品1-1)各IOOmg于常温(约25°C )， 50 V，80 V的分别的温度静置30分钟。接下来，在三角瓶QOOml容)中放入30mL的蒸留纯水，作为微生物源而添加了各 30mg(每水IL Ig)上述加热处理后的干燥菌体物。向其中添加0. 03g (每水IL Ig)鲣煮汁(枕崎渔协制)，及通过以120rpm浸透维 持为成为好氧的条件的同时，还于水温25°C进行反应15天。再有，也同时作为对照实验进行，作为微生物源而添加30mg (每水IL Ig)树皮堆 肥(商品名Golden树皮，清水港木材产业协同组合制)而进行反应的实验。结果示于图9。其结果，于50°C进行30分钟加热处理的干燥菌体物，作为微生物源而添加时，示 至从有机物向硝态氮的无机化结束的反应时间(至达到硝酸根离子浓度的顶峰的时间)以 5天结束。因此，于50°C进行30分钟加热处理的干燥菌体物示，相比于常温(约25°C)静置 者，不减少地保持作为‘作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌’的功 能。对此，将于80°C进行30分钟加热处理的干燥菌体物作为微生物源而添加时，示至 从有机物向硝态氮的无机化结束的反应时间(至达到硝酸根离子浓度的顶峰的时间)需要 9天，示与将树皮堆肥作为微生物源时需要大致相同反应时间。从以上的结果示，于50°C 30分钟的加热处理中，作为对于并行复式无机化反应的 催化剂优化的微生物群的种菌的功能不降低，有耐热性。另外得知，于80°C 30分钟的加热处理者，反应结束后生成的硝酸根离子(硝态 氮)的生成量示与于常温(约25°C)静置者相同程度高，如果仅仅是暂时暴露于80°C的高 温，则不损失作为种菌的商品价值。再有，树皮堆肥作为微生物源时，反应结束时生成的硝态氮的量少的，与实施例1 中得到的干燥菌体物(本发明实施品1-1)相比多含有机成分，推定为由于将其利用的微生 物消费掉硝酸根离子，可回收的硝酸根离子的浓度降低。工业实用性本发明的种菌作为解决了在实践活用近年受到关注的，有机肥料的营养液栽培上 操作性差的问题(需要约2周的反应时间，微生物源的接种量每IL约5g多，将有机物一次 加入2g左右是限界)的技术而价值高。使用由本发明提供的种菌，则反应时间缩短为一半 以下，及微生物源的接种量缩减至4%，及有机物的添加量可提高到5倍，操作性大幅度升
高ο现在，活用有机肥料的营养液栽培受到关注，生产者急速增加，国内为150ha，荷兰为4000ha，持续扩大的营养液栽培中的相当部分预想置换为利用有机肥料。本发明提供的种菌，由于作为辅助这些生产者的生产活动的技术，大大地贡献，预想将广泛地利用，该市 场规模会变得非常大。本发明的种菌，不仅营养液栽培，而且，在室内绿化，屋上绿化等的展 览用水培养栽培中也可适用，市场性不限于农业领域。另外，本发明向以有机性废弃物作为原料的无机肥料制备技术的应用也可能。废 弃物的再资源化产业预想今后将扩大到2兆5千亿圆的市场规模，本发明作为将大量的有 机质资源迅速有效再资源化成无机肥料成分的技术，在产业上的利用可能性非常大。而且，本发明通过用本发明的种菌可新制备种菌。由于可相比以往的并行复式无 机化反应中进行的可以一半的天数制备，种菌的迅速且大量的生产成为可能。如上所述，从 种菌自体的广市场性，预想对种菌的需要会增大，提供将其迅速且大量生产的技术本身，预 想具有大的市场性。

[图1](a) (C)是示本发明的作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生 物群的种菌的制备方法的各种实施方式的说明图。另外，(a)也是示实施例1中生物膜的 形成及回收方法的模式图。[图2](a)是示本发明中固体表面上形成生物膜的一实施方式的模式图。另外， (b)是示实施例1中生物膜的形成及回收过程的照片。另外，(c)是示本发明中生物膜的回 收方法的实施方式的模式图。[图3]是示实施例2中硝酸根离子浓度的测定结果的坐标图。[图4]是示实施例3中硝酸根离子浓度，亚硝酸根离子浓度，氨浓度的测定结果的 坐标图。[图5]是示实施例4中硝酸根离子浓度的测定结果的坐标图。[图6]是示比较例1中硝酸根离子浓度，氨浓度的测定结果的坐标图。[图7]是示实施例5中硝酸根离子浓度的测定结果的坐标图。[图8]是示实施例6中硝酸根离子浓度的测定结果的坐标图。[图9]是示实施例7中硝酸根离子浓度的测定结果的坐标图。
权利要求
1.种菌的制备方法，包括 在可贮存水的容器中放置水，接种进行并行复式无机化反应的微生物群，及通过维持并行复式无机化反应在上述水中进行的环境，培养上述进行并行复式无机化 反应的微生物群；及使在与上述水接触的固体表面形成生物膜，接下来， 回收所述生物膜；及将回收的上述生物膜作为种菌，所述种菌是作为并行复式无机化反应的催化剂而优化 的微生物群的种菌。
2.权利要求1所述的种菌的制备方法，其中上述进行并行复式无机化反应的微生物群 的接种是将选自下列的1种以上接种土壤，树皮堆肥，及天然存在的水。
3.权利要求2所述的种菌的制备方法，其中所述并行复式无机化反应在上述水中进行 的环境是每1 7天对于上述水IL添加以干燥重量换算各0. 05 Ig的有机物的环境。
4.种菌的制备方法，包括 在可贮存水的容器中放置水，接种由权利要求1 3中任一项所述的种菌的制备方法得到的种菌，及 在并行复式无机化反应在上述水中进行的环境下，培养上述进行并行复式无机化反应 的微生物群；及使在与上述水接触的固体表面形成生物膜，接下来， 回收所述生物膜；及将回收的上述生物膜作为种菌，所述种菌是作为并行复式无机化反应的催化剂而优化 的微生物群的种菌。
5.权利要求4所述的种菌的制备方法中，其中所述并行复式无机化反应在上述水中进 行的环境是对于上述水IL添加以干燥重量换算0. 01 IOg的有机物的环境。
6.权利要求1 5中任一项所述的种菌的制备方法，其中所述并行复式无机化反应在 上述水中进行的环境是将上述水中维持为好氧的条件的环境。
7.权利要求6所述的种菌的制备方法，其中上述好氧的条件通过曝气或者振荡维持。
8.权利要求1 7中任一项所述的种菌的制备方法，其中所述并行复式无机化反应在 上述水中进行的环境是将上述水中维持为15 37°C的水温的环境
9.权利要求1 8中任一项所述的种菌的制备方法，其中所述与上述水接触的固体表 面是上述容器的壁面及/或底面。
10.权利要求3，5 9中任一项所述的种菌的制备方法，其中，在上述水中培养上述进 行并行复式无机化反应的微生物群时，上述水中生成的硝酸根离子浓度达到10 30mg/L 时，通过停止上述有机物的添加，从而抑制上述形成的生物膜中进行脱氮反应的微生物群 增殖地培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群。
11.权利要求1 10中任一项所述的种菌的制备方法，其中上述生物膜的回收是将培 养上述进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的培养液的上清废弃，之后回收在上 述固体表面上形成的生物膜。
12.权利要求1 11中任一项所述的种菌的制备方法，其中上述生物膜的回收是作为将以下物质混合的混合液而回收 上述固体表面上形成的生物膜，与培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群之后得到的培养液的上清。
13.权利要求11或12中任一项所述的种菌的制备方法，其中，将上述形成的生物膜回 收之后，通过离心分离或过滤除去额外的水分。
14.权利要求11所述的种菌的制备方法，其中，将上述培养液的上清废弃之后进行干 燥处理。
15.权利要求13所述的种菌的制备方法中，将上述额外的水分除去之后进行干燥处理。
16.权利要求1 15中任一项所述的种菌的制备方法，其中上述种菌是在进行50 80°C的加热时不丧失作为种菌的功能的种菌，所述种菌是作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌。
17.权利要求1 16中任一项所述的种菌的制备方法，其中上述种菌包括进行氨化作 用的微生物群，且相对Ig上述种菌包括1万 1亿细胞的进行硝化作用的微生物群。
18.作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌，其由权利要求1 17中任一项所述的种菌的制备方法得到。
19.包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料的制备方法，其包括 在可贮存水的容器中放置水，向其中添加权利要求18所述的上述种菌；及通过维持作为并行复式无机化反应在上述水中进行的环境来使在上述水中进行并行 复式无机化反应，所述环境是如下环境 添加有有机物、且 温度维持于15 37°C、且 眷维持为成为好氧的条件； 得到包括100mg/L以上的硝酸根离子的反应液；将得到的上述反应液作为肥料，所述肥料包括作为无机肥料成分的硝态氮。
20.权利要求19所述的肥料的制备方法，其中，上述有机物的添加是可一次添加至对 于上述水IL而以干燥重量换算不超过IOg的量。
21.权利要求19或20中任一项所述的肥料的制备方法，其中，可以不超过8天的天数 得到生成有100mg/L以上的硝酸根离子的反应液。
22.权利要求19 21中任一项所述的肥料的制备方法中，上述种菌的添加是对于上述 水IL而添加不低于0. Olg的量。
23.权利要求19 22中任一项所述的肥料的制备方法，其中，进行并行复式无机化反 应时不伴随脱氮反应。
24.包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料，其由权利要求19 23中任一项所述的肥 料的制备方法得到。
25.植物的栽培方法，其使用权利要求M所述的包括作为无机肥料成分的硝态氮的肥料。
26.植物的栽培方法，其在权利要求20 25中任一项所述的上述反应液中直接添加包括有机物的肥料而进行营养液栽培。
27.权利要求25或沈所述的植物的栽培方法，其中，上述植物是叶菜类的蔬菜，以果 实作为收获对象的果菜，果树，树木，或花卉。
全文摘要
本发明为了解决上述的课题，以提供如下方法作为课题从有机物生成作为无机肥料成分的硝态氮的并行复式无机化反应中，可大幅缩短至将有机物无机化为硝态氮的反应结束的时间，可一次大量添加有机物，其结果，可有效生成高浓度的硝态氮，且可大幅度缩减微生物源的添加量。提供种菌的制备方法，其特征在于，在可贮存水的容器中放置水，接种进行并行复式无机化反应的微生物群，及通过维持并行复式无机化反应在上述水中进行的环境，培养上述进行并行复式无机化反应的微生物群；及使在与上述水接触的固体表面形成生物膜，接下来，回收所述生物膜；及将回收的上述生物膜作为种菌，所述种菌是作为并行复式无机化反应的催化剂而优化的微生物群的种菌。
文档编号C05F17/00GK102112598SQ20098013065
公开日2011年6月29日 申请日期2009年7月16日 优先权日2008年10月9日
发明者筱原信 申请人:独立行政法人农业·食品产业技术综合研究机构