专利名称：：防治辣椒青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料的制作方法
技术领域：
：本发明涉及能防治辣椒青枯病的拮抗菌及用其制成的微生物有机肥料，属于农业集约化生产
技术领域：
，专用于克服和消除辣椒青枯病问题。
背景技术：
：辣椒青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种土传病害，一旦发生，通常造成20%-30%的辣椒死亡，严重时高达50%以上，甚至绝收。目前，对辣椒青枯病的防治主要有作物轮作、化学防治和选育抗病品种等不同的方法，但防治效果较低。随着绿色农业的发展，对辣椒青枯病的防治重点逐渐转向以生物防治为主的综合防治，筛选高效拮抗菌株是进行生物防治的核心，同时将拮抗菌株和有机肥复配开发成既能够抗病又可以改善土壤结构的微生物有机肥料越来越受到人们的重视。
发明内容1.技术问题本发明的目的在于研制一种能防治辣椒青枯病的拮抗微生物有机肥料，防治效率达到70%，使大量辣椒连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。2.技术方案用于防治辣椒青枯病的拮抗菌a45，属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),2009年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3480，主要生物学特性为；革兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，芽孢中生或近中生，椭圆形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体；发酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇产酸，能水解淀粉和液化明胶，接触酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原反应、V-P(Voges-Proskauer)反应均为阳性，而甲基红反应、丙二酸利用、酒石酸盐利用均为阴性；在LB平板上30°C培养24h后，菌落周边不规则，不透明，具运动性。用上述拮抗菌a45所生产的防治辣椒青枯病的微生物有机肥料，其特征在于该肥料中含有2.OX109个/g以上的拮抗菌a45、全氮含量为33.lgkg—1，全磷含量为13.3gkg—1、全钾含量为21.3gkg—1。上述防治辣椒青枯病的微生物有机肥料的生产方法，包括1)将菌株a45接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30°C，170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵的a45拮抗菌液含菌或芽孢量>5X109个/ml；所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml,pH值调至7.2-7.4，121°C灭菌20min。2)有机肥的制备以腐熟的猪粪堆肥、腐熟的牛粪堆肥、氨基酸有机肥以体积比3:3:4混合制成；所用腐熟的猪粪、牛粪堆肥发芽指数均为98%以上，有机质质量比含量彡35%，有机氮质量比含量为1.2-2%，含水量25-30%。3)将a45拮抗菌液按20%(V/ff)的比例接种到步骤2)所述有机肥中进行固体发酵，发酵温度为30-50°C，发酵过程中每天翻堆1次，发酵周期5-7天，使拮抗菌含量达到2.0XIO9个/g以上，最后在温度不超过60°C的条件下将其含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为防治辣椒青枯病的微生物有机肥料。所述微生物有机肥料可专用于防治辣椒青枯病。3.有益效果本发明涉及一种能克服或消除连作辣椒青枯病的微生物有机肥料及其生产方法，利用猪粪堆肥、牛粪堆肥和氨基酸有机肥混合物，再与拮抗菌液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点1)该肥料产品中含有抑制辣椒青枯病病原细菌生长的专一性高效菌株(枯草芽孢杆菌a45)，其抑制效果非常显著。试验结果表明，在含有辣椒青枯病的土壤上施用本产品后，辣椒青枯病的生物防治率高达70%以上。2)该肥料为有机肥，含有丰富的有机质，而且大部分为氨基酸和小分子多肽。有机肥料中含有的丰富营养也为其中的拮抗菌提供了生长繁殖的条件，使其在土壤中存活下来并形成优势种群，从而发挥防病作用。3)由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于辣椒的无公害生产，农民可以不用或减少防治青枯病的化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于农产品的出口。同时，该微生物有机肥料还有增产功能，可为农民增加收入。四图1施用拮抗菌a45和微生物有机肥对辣椒根系病原菌的影响五具体实施例方式(一)菌株的分离和鉴定以辣椒青枯病病原菌青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)(德国的菌种保藏中心(DSMZ)，Ralstoniasolanacearum(DSMNo.9544)，辣椒青枯病拮抗菌株的筛选及田间防效的测定，《中国生物防治》2001年，第17卷，第03期，郭坚华等)为指示菌从来自于辣椒青枯病发病田块中的健康辣椒植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验最终筛选出高效拮抗菌株a45，鉴定到属种，菌种于30%甘油中-70°C保存。拮抗菌a45，属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，芽孢中生或近中生，椭圆形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体；发酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇产酸，能水解淀粉和液化明胶，接触酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原反应、V-P(Voges-Proskauer)反应均为阳性，而甲基红反应、丙二酸利用、酒石酸盐利用均为阴性；在LB平板上30°C培养24h后，菌落周边不规则，不透明，具有运动性。(二)菌剂生产1)菌株接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30°C，170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，获得a45拮抗菌液(LC)含菌或芽孢量彡5XIO9个/ml;所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121°C灭菌20min。2)有机肥(OF)的制备以腐熟的猪粪堆肥、牛粪堆肥和氨基酸有机肥(江苏新天地氨基酸肥料有限公司，肥料名称氨基酸有机肥，登记证号苏农肥(2008)准字0180号，肥料规格N+P205+K20≥6%有机质≥30%氨基酸彡5%)以体积比33;4混合制成。所用腐熟的猪粪、牛粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量>35%，有机氮质量比含量为1.2-2%,含水量25-30%。3)将a45拮抗菌液按20%(V/W)的比例接种到步骤2)所述有机肥中进行二次固体发酵，发酵温度为30-50°C，发酵过程中每天翻堆1次，发酵发酵周期5-7天，使拮抗菌含量达到2.0X109f/g以上，获得拮抗菌a45的固体菌剂。最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，获得防治辣椒青枯病的微生物有机肥料(B0F)。用上述拮抗菌所生产的微生物有机肥(B0F)(防治辣椒青枯病的专用微生物有机肥料)，该肥料中含有2.OX109个/g的拮抗菌a45、全氮含量为33.lgkg_S全磷含量为13.3gkg—1、全钾含量为21.3gkg—1。(三)温室盆栽试验供试辣椒品种中椒4号购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所，育苗45片真叶后移栽到装有5kg土壤的盆钵中。盆钵设置5个处理1)健康土壤(cig；2)健康土壤+辣椒青枯病病原菌(CK2)；3)健康土壤+辣椒青枯病病原菌+有机肥(CK2+0F)；4)健康土壤+辣椒青枯病病原菌+a45拮抗菌液(CK2+LC)；5)健康土壤+辣椒青枯病病原菌+微生物有机肥(CK2+B0F)。每种处理设三个区组，每个区组十二个重复。其中有机肥(OF)和微生物有机肥施用量(B0F)为5%。，没有添加有机肥的处理用氮、磷、钾肥补齐养分。按照设置将病原菌和拮抗菌分别接种到土壤中，接种病原菌的土壤中病原菌含量为9.6X106个/g土，接种拮抗菌的土壤中拮抗菌的含量为1.0X107个/g土，具体做法是采用含菌量为2.0X109个/g的微生物有机肥，按照5%。施肥量(即5Kg土壤中使用25g)进行施肥，使得土壤中拮抗菌的含量为1.0X107个。辣椒生长15天后每天调查青枯病发生情况，计算病情指数和防治效果(病情指数=E(各级病株数X相应级数)/调查总植株数X100；防治效果=(对照区病情指数一处理区病情指数)/对照区病情指数x100；病害严重度分级标准0级无病状；I级1/4叶片发病；II级1/2叶片发病；III级整株死亡)。结果显示，施用拮抗菌液体菌剂和微生物有机肥对辣椒青枯病的生物防治率分别为69.58%和76.09%(表1)。同时还能显著减少根际病原菌的数量(图1)，延缓a45的数量下降。试验结果表明，施用微生物有机肥不但可以起到防治辣椒青枯病，大大减少土壤中青枯病原菌数量的作用，还促进辣椒根际微生物群落的变化，有益细菌、放线菌及真菌群落均显著增加(表2)。表1拮抗菌a45及其与有机肥复合施用对防治辣椒青枯病的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2施用微生物有机肥对辣椒根际土壤中微生物区系的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求用于防治辣椒青枯病的拮抗菌a45，属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，2009年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3480，主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞形状为杆状，芽孢中生或近中生，椭圆形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体；发酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇产酸，能水解淀粉和液化明胶，接触酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原反应、V-P反应均为阳性，而甲基红反应、丙二酸利用、酒石酸盐利用均为阴性；在LB平板上30℃培养24h后，菌落周边不规则，不透明，具有运动性。2.用权利要求1所述防治辣椒青枯病的拮抗菌a45所生产的微生物有机肥料。3.根据权利要求2所述的防治辣椒青枯病的微生物有机肥料，其特征在于该肥料中含有2.OXIO9个/g以上的拮抗菌a45、全氮含量为33.Igkg—1，全磷含量为13.3gkg-1、全钾含量为21.3gkg—1。4.权利要求2或3所述防治辣椒青枯病微生物有机肥料的生产方法，包括1)将权利要求1所述的菌株a45接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为初始PH范围为7.0-7.2，培养温度30°C，170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵获得的a45拮抗菌液含菌或芽孢量>5XIO9个/ml；2)有机肥的制备以腐熟的猪粪堆肥、腐熟的牛粪堆肥和氨基酸有机肥以体积比3:3:4比例混合制成；3)将a45拮抗菌液按体积质量比20%的比例接种到步骤2)所述有机肥中进行固体发酵，发酵温度为30-50°C，发酵过程中每天翻堆1次，发酵周期5-7天，使拮抗菌含量达到2.0XIO9个/g以上，最后在温度不超过60°C的条件下将含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为获得的防治辣椒青枯病的微生物有机肥料。5.根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤1)所用PDA培养液配制方法为，以配制IL培养基为例用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121°C灭菌20min。6.根据权利要求4或5所述微生物有机肥料的生产方法，所用腐熟的猪粪堆肥、腐熟的牛粪堆肥发芽指数均为98%以上，有机质质量比含量>35%，有机氮质量比含量为1.2-2%，含水量25-30%ο7.权利要求2或3所述微生物有机肥料的应用。全文摘要本发明涉及用于防治辣椒青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对辣椒青枯病病原细菌有显著拮抗作用的一株拮抗菌(枯草芽孢杆菌a45)，利用该拮抗菌与有机堆肥制成抗病微生物有机肥料，肥料中含有2.0×109个/g以上的a45，全氮含量为33.1gkg-1、全磷含量为13.3gkg-1、全钾含量为21.3gkg-1。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，对辣椒青枯病防治率高达70％。文档编号A01N63/02GK101805716SQ20101013822公开日2010年8月18日申请日期2010年4月2日优先权日2010年4月2日发明者冉炜,杨兴明,江欢欢,沈其荣,沈标申请人:南京农业大学