控制种子大小和油脂合成的基因的制作方法

专利名称：控制种子大小和油脂合成的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及控制种子大小和/或油脂合成的基因。
背景技术：
目前，含油种子农作物中油的水平和植物种子大小已经通过传统育种和选择方法而得以逐渐增加。尽管我们可以通过诸如导入或操作含油种子中的各种植物脂肪酸生物合成基因来实现脂肪酸比例的增加，然而仍然需要增加植物种子大小和油含量的改良方法。 同时，在农业生产中，有时需要降低植物种子中油脂含量以获得更为有利的性状，例如在用于生产蛋白粉的大豆中。拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。PNY作为一种BELl-Iike (BELL) homeodomain protein 与KNOTTEDl-Iike homeobox (KNOX)家族的BP相互作用，参与了茎和胎座框的发育(Smith and Hake, 2003 ；Alonso-Cantabrana et al.，2007)。现有技术已经发现 PNY 与 BP 相互作用调节花序的发育以及荚果的形态(Smith and Hake, 2003 ；Ragniet al，2008，；Bhatt et al,2004 ；Byrne et al，2003 ；Alonso-Cantabrana et al，2007)。然而，至今，PNY 与控制种子大小和/或油脂合成有关的功能分析尚未见报道。

发明内容
本发明人通过图位克隆法分离了控制种子大小和/或油脂合成的基因，更具体的是拟南芥中控制种子大小和/或油脂合成的基因，所述基因为拟南芥第5染色体上 At5g02030 (PNY)基因。基于上述基因，本发明的目的之一是提供一种分离的多核苷酸，其包含或由选自下组之一的多核苷酸组成a)具有SEQ ID NO 1所示序列的多核苷酸；b)多核苷酸，其编码SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列，或编码在SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO 2所示的cDNA序列，或具有SEQ ID NO 3所示的序列；c)多核苷酸，其与SEQ ID NO=I所示序列具有至少60%序列同一性；d)多核苷酸，其在严谨条件下与a)或b)或c)之一杂交；e)多核苷酸，其为a)_d)之一的片段。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸c)中所述的多核苷酸与SEQ ID NO 1所示序列具有至少70%序列同一性，优选至少80%序列同一性，还优选至少95%序列同一性；更优选至少99%序列同一性。优选地，本发明的多核苷酸是一种控制种子大小和/或油脂合成的核酸。本发明另外提供一种分离的多核苷酸，其具有SEQ ID NO :1所示序列，其中位点1942的G被A取代。为了更好地实施本发明，进一步提供一种载体，其包含上述至少一种多核苷酸。本发明同时提供一种核酸构建体，其包含上述至少一种多核苷酸。本发明还提供了一种植物细胞，其包含上述的核酸构建体。本发明还提供了包含上述植物细胞的植物。进一步地，本发明的所述植物是单子叶植物或双子叶植物。优选地，本发明的单子叶植物选自玉米，稻，小麦，大麦或棕榈，本发明的双子叶植物选自拟南芥，大豆，油菜， 花生，向日葵，红花，棉花，烟草，番茄，马铃薯和可可。特别优选地，本发明的双子叶植物是拟南芥。特别地，本发明的植物是蓝藻。本发明还包括植物材料，其包括本发明的植物的后代，克隆，繁殖材料，种子，荚果。优选地，本发明的植物材料是种子。本发明还包括从本发明的植物材料制备的组合物，包括食品，油，粉，饲料。本发明还包括从经转化的植物的一或多种种子制备的油，所述植物含有本发明的多核苷酸。本发明的另一个目的是提供一种蛋白质，其具有如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列或该序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列。另一方面，通过抑制本发明的多核苷酸的表达，本发明人证明，在植物中能够促进种子增大，或者使种子中油脂的含量增加。本领域技术人员了解通过常规的生物学方法可以使本发明的多核苷酸表达降低，特别有效的方法是RNA干扰方法和反义RNA方法。因此本发明的另一方面提供一种促进种子增大和/或油脂合成的方法，包括在产生所述种子并且含有本发明的多核苷酸的植物中使本发明的多核苷酸表达降低或不表达的步骤。本领域普通技术人员了解使本发明的多核苷酸表达降低或不表达的方法。其包括但不限于RNA干扰方法或反义RNA方法。同时，本发明还涉及一种促进种子增大和/或油脂合成的方法，包括在产生所述种子并且含有本发明的蛋白质的植物中使本发明的蛋白质活性降低或丧失的步骤。本发明的另一方面涉及一种抑制种子增大和/或油脂合成的方法，包括用本发明的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤。通过本发明人的研究，本领域技术人员可以相信，通过用本发明的多核苷酸转化目标植物，并使所述多核苷酸在目标植物中表达，特别是过表达，可以促进脂肪酸合成的负调控，从而抑制种子增大和/或油脂合成，进而降低种子中的油脂含量。所述方法对于希望其中油脂含量尽可能低的种子，例如用于生产蛋白粉的大豆的种子，具有重要意义。转化植物并使本发明的多核苷酸在被转化的植物中表达的方法是本领域普通技术人员所熟知的。本发明的另一个目的是提供本发明的多核苷酸在控制种子大小和/或油脂合成中的用途。本领域技术人员基于现有技术和本说明书公开的内容可以得知，可利用本发明的载体的植物包括双子叶和单子叶植物，优选产油种类，包括但不限于玉米(Zea mays)，油菜(Brassica sp.)，具体是可用作种子油来源的那些油菜种类(例如，B. napus，B. rapa， B. juncea), ( H ^ (Helianthus annuus), ^1 (Carthamus tinctorius), M (Oryza
5sativa)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，花生(Arachis hypogaea)，棉花(Gossypium barbadense，Gossypium hirsutum)，椰子(coconut) (Cocosnucifera)，可可 (Theobroma cacao)，油掠榈(Elaeis guineensis)，亚麻(flax) (Linum usitatissimum)； Cuphea species ；蓖麻(castor)(Ricinuscommunis)，撤揽(olive)(Olea europaea)， 腰果(cashew) (Anacardiumoccidentale)，马卡达姆坚果(macadamia)(Macadamia integrifolia)禾口杏仁(almond) (Prunus amygdalus))。本发明所述植物可用于产生含有有价值的商业产品诸如油和动物饲料的种子。这种种子的加工和碾磨是本领域已知的。本发明的其它目的见于本发明的详细描述之中。除非有其它说明，本发明的实施使用本领域中的传统分子生物学，细胞生物学，和克隆技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。此外，用于杂交的严谨条件是本领域技术人员所熟知的，诸如示例性高严谨条件包括在42°C、50%甲酰胺，5X SSC, 50mM 磷酸钠，pH 7. 0,5mM EDTA，0. 1% SDS，5X Denhardt' s 以及 100 μ g/mL 变性鲑精 DNA 中进行杂交，并在60-65°C、0. IX SSC，0. SDS进行洗涤。核酸杂交的详细指南见，例如， Sambrook and Russell “ Molecular Cloning :ALaboratory Manual" (2001)。禾[!用i^ili 参考文献，本领域熟练技术人员可产生本发明核酸的变体。在描述本发明示例性的具体实施方案之前，应当明确本发明不局限于描述的具体材料和方法，因为这些可以改变。也应理解这里使用的命名法仅仅以描述具体实施方案为目的，并未打算限制本发明的范围，本发明的范围只由附加的权利要求书限制。这里使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的意义相同。尽管任何与这里描述的相似或相当的材料和方法可被用于实践或试验本发明，优选的材料和方法是这里所描述的。


图IWS野生型和1A-15-3的株型对比。(A) 1A-15-3突变体，(B)结荚期1A-15-3 突变体与WS野生型的对比。(C)着生在1A-15-3突变体茎节点上的簇生叶。(DUA-15-3突变体的簇生荚果。(E) 1A-15-3突变体与WS野生型荚果对比。(F) 1A-15-3突变体和WS野生型的单株荚果数(三次生物学重复的统计结果)。白色箭头标示出部分簇生荚果和簇生茎生叶。图2. 1A-15-3与WS野生型种子，千粒重和株粒重。图3. 1A-15-3与pnyl的千粒重和株粒重对比(A) 1A-15-3与pnyl的千粒重。 (B) 1A-15-3与pnyl的株粒重。图4. 1A-15-3突变体的互补。(A) RT-PCR分析检测1A-15-3互补株系中PNY的表达。⑶互补株系苗期的表型。(C) 1A-15-3突变体与互补株系种子大小的对比。⑶1A-15-3 突变体与互补株系种子长度和宽度统计。(Ε)1Α-15-3突变体与互补株系千粒重对比。 (F) 1A-15-3突变体与互补株系株粒重对比。CA6-1、CA8-2和CAl 1_2为互补株系。图5. 1A-15-3、WS和互补株系种子的脂肪酸含量。WS为野生型，CA6-1，CA8-2， CAl 1-2均为互补株系。图6. 1A-15-3、WS和互补株系种子中的各脂肪酸组分的含量。1A_15_3种子的C16:0、C18:0、C18:2、C18:3、C20:0、C20:1和C22:l含量均高于野生型和互补株系。WS野生型；CA6-1、CA8-2、CAl 1-2为互补株系。
具体实施例方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明。下面的实施例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。材料和方法1.拟南芥突变体库的构建和突变体筛选本申请用0. 2%的EMS溶液，常温过夜处理拟南芥野生型WS种子。第二天将种子清洗干净后，消毒处理，播种于MS培养基，在23°C、16小时光照培养一周，将幼苗移栽到营养土中，放入23°C、16小时光照的培养室中培养。为防止花粉杂交污染，每株单独套管，待成熟后单株收种，组成EMS诱变的突变体库，该库共有3，700个Ml代株系。在突变体的筛选中从每个Ml代株系取20粒种子播种，观察表型，筛选目的突变体。2.拟南芥的杂交选取母本植株尚未露白的花蕾，去掉萼片、花瓣和雄蕊，只留下柱头，去掉周围的花和荚果以防花粉污染或混淆；取父本植株新开放的花朵的雄蕊，用其花药反复涂抹母本的柱头，使花粉粘在柱头上以便授精。待杂交的荚果成熟后马上收获杂交Fl代。3.拟南芥的转化及转化纯合体的筛选将拟南芥种子在10%的花王漂白水中摇勻消毒15分钟，然后换灭菌水洗三次，再加入0. 琼脂，混勻后播在MS培养基上，在23°C、16小时光照的条件下培养。一周后将小苗移栽到含有蛭石的种植盆中，在23°C、16小时光照下生长，待植物开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝生长。将剪枝后4-6天的植株倒置，将花浸泡在转化缓冲液(5%蔗糖溶液，pH 5.7， 0. 03% Silwet L-77，农杆菌浓度为0D_ 0.4-0.6)中15-30秒。取出种植盆，避光保湿侧放M小时，然后将种植盆直立，按常规方法种植植株至结实，收获成熟种子。将干燥一周后的种子播种于含50 μ g/mL卡那霉素(Kanamycin)的MS培养基上， 每皿500粒左右，在4°C的冰箱中春化1-2天，然后放入23°C的培养室中培养。只有含外源片段的转基因幼苗才能在卡那霉素选择培养基上正常生长。当幼苗生长到4片真叶时，移栽到种植盆中生长，成熟后分单株收获种子(Tl代)。收取的Tl代种子同样在含卡那霉素选择培养基上生长，分单株收获种子(T2代)。 在T2代观察转基因植株的分离比例，选择表型分离接近3 1的转基因植株继续种到T3 代，该种子用于相应实验。4.⑶S活性的组织化学定位1)将组织材料放入1. 5mL离心管或96孔微量滴定板，加入100-200 μ L⑶S显色溶液。2) 37 °C温育过夜(时间也可短一些)。3)将组织浸泡在70%的乙醇中脱色，每3个小时更换一次乙醇直至脱色彻底。4)在70%的乙醇中置于4°C冰箱中保存或立即镜检。5.拟南芥种子的扫描电镜观察
1)用蒸馏水浸泡成熟干燥的拟南芥种子6-8个小时，在解剖镜下剥去种皮。2)用含曙红的FAA固定液在常温下固定种子M小时。3)先用超纯水将种子清洗一次，再用磷酸缓冲液清洗两次。4)将种子放入导电液中处理40-50分钟。5)再次用超纯水清洗，然后将种子用10%、20%、40%、60%、80%、100%、100% 酒精逐级脱水，每个酒精浓度脱水处理30分钟。6)用叔丁醇/乙醇比例为1/3、1/1、3/1溶液逐级渗透已脱水的种子，每次渗透处理3小时；然后换成100%叔丁醇处理3小时，最后更换一次100%叔丁醇过夜。7)再次更换100%叔丁醇，并真空冷冻干燥样品。8)为了便于观察，将种子的上下两片子叶和胚根分开，整齐摆放在样品台上。在摆放时注意上下两片子叶和胚根的上下两面，共计六个面均需有十个以上面向镜头的样品， 以备照相和统计。放好样品后，进行喷金和上镜观察。9)放大倍数均为250倍，采集图像，用ImageJ统计种子各面的细胞个数和细胞大小。6.拟南芥种子的脂肪酸含量测定1)取IOmg左右拟南芥种子，加入3mL 7. 5% (w/v)的K0H/CH30H溶液研磨样品， 研磨中每个样品加入50mg/mL C 17:0 50 μ L作为对照。2)将研磨后的样品收入15mL离心管中，70°C水浴3小时。3)向离心管中加入用甲醇稀释为6N的HCl 2mL，14% BF3 (氟化硼)2mL，混勻，70°C 水浴1. 5小时。4)向离心管中加入0.9% NaCl lmL，正己烷^iL,混勻，萃取。幻重复上一步，再萃取一次。6)用氮吹仪将样品吹干。7)加入500 μ L乙酸乙酯溶解干燥的脂肪酸，放入玻璃瓶，在_20°C保存。8)用气相色谱质谱联用仪测量脂肪酸的组分和浓度。7.拟南芥种子的元素含量测定1)取样将待测样品拟南芥的种子用蒸馏水清洗3次，超纯水清洗一次，放在干净的滤纸上晾干，放入80°C烘箱烘烤2-3天至样品完全烘干以备用。2)硝解每个样品称取IOOmg左右放入硝解罐中，加入2mL色谱纯H2O2，SmL分析纯HNO3，放入微波硝解炉(Milestone，Italy)中硝解。硝解完成后将溶液转入容量瓶中用超纯水定容。3)测量用等离子光谱仪(Perkin-Elmer，USA)测量硝解后溶液中的元素含量。8.拟南芥植株荚果数、株粒重和千粒重的统计取每个株系10株成株，统计总的荚果数，取每株的平均数；收获后去掉瘪粒，称量 10株总产量取平均值即为每株的株粒重；将混勻的种子随机取1000-2000粒称重，并统计籽粒数，计算千粒重。以上皆需三次生物学重复。9.拟南芥横切面的组织切片制作制作过程参照Leica树脂切片试剂盒说明书1)取0. 8mm左右的拟南芥新鲜茎段，用4%戊二醛固定液固定M小时。
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2)用10%、20%、40%、60%、80%、100%、100%酒精逐级脱水，每个酒精浓度脱水处理30分钟。3)依次用乙醇/Historesin为3 1、1 1、1 3的溶液浸泡脱水后的样品，每次处理3-4个小时。4)更换为 100% Historesin，处理 3-4 个小时。5)再更换一次 100% Historesin，浸泡过夜。6)第二天再次更换新的100% Historesin，浸泡一小时。7)将Historesin和Hardener以16 1的体积比混勻，制成混合液。8)将样品放入模子中加入Historesin/Hardener的混合液包埋样品，注意不要产生气泡，用封口膜封口以隔绝空气使包埋好的模块凝固，静止过夜。9)待模块完全凝固后将封口膜去掉，用胶水将包埋块粘到bloclcholder上。10)切片之前先将载玻片放在50°C的烤片台上预热，并在载玻片上滴加适量蒸馏水。在切片机上用玻璃刀将包埋好的样品切成5-10μΜ的薄片，将切好的薄片放入滴加在载玻片上的蒸馏水中展片。11)42°C烤片过夜，用TBO染色液给片子染色，并镜检。10. Northern 杂交本实验按照《(分子克隆实验指南》第三版所述方法和试剂进行，简述如下1)制胶将3_4.5g琼脂糖放入250mL DEPC水中，加热使琼脂糖溶解。待温度降至 55°C，加入 30mL IOxMOPS 缓冲液(0. 2M pH7. 2M0Ps，20mM 乙酸钠，IOmM EDTA (pH 8.0)， 17. 5mL甲醛，混勻后倒入制胶器中备用。2) RNA样品的准备每个样品包括10-20 μ g总RNA，5. 5yL甲酸，15 μ L甲酰胺， 1. 5 μ L IOxMOPS缓冲液，加DEPC水至总体积30 μ L，在55°C处理15分钟使RNA变性，然后立即放入冰上，保持5分钟，再加入3 μ L含EB的lOxloading buffer,充分混勻放在冰上备用。3)电泳将制好的胶放入电泳槽中，电泳缓冲液为IxMOPS缓冲液。将混合好的样品点入点样孔中，在5V/cm和室温条件下电泳3-4小时。4)转膜先将转膜缓冲液20xSSC(3M NaCl,0. 3M Na3Citrate)倒入托盘中，用玻璃板和滤纸搭好盐桥。将电泳结束的胶放入DEPC水中清洗15分钟，然后切去点样孔，反面向上平放在搭好的盐桥上，周围用封口膜封好，上面依次铺上硝酸纤维素膜，2层滤纸和吸水纸若干，并压上适当重物，转膜12小时。5)烤膜转好的膜在DEPC水中漂洗15分钟后，放在滤纸上晾干，放入80°C烤箱烘烤1. 5-2. 0小时，然后用保鲜膜包好放入4°C保存备用。6)预杂取200 μ L 10mg/mL鲱鱼精DNA，沸煮5分钟变性，立即放在冰上冷却5分钟。将转好的膜放入杂交管中，倒入适量65°C预热的杂交液(0.5M pH7. 2磷酸缓冲液，ImM pH 8. 0EDTA,7% SDS，1 % BAS)，加入变性的鲱鱼精DNA，放入杂交炉中在65°C条件下预杂 6-8小时。7)探针标记用Promega公司探针标记试剂盒进行标记。向25ng探针DNA加入适量Nuclease-Free Water至总体积30 μ L，沸煮10分钟，立即放入冰上冷却5分钟，再加入 10 μ L Labeling 5xbuffer，2 μ L 未标记 dNTP (不含 dCTP)，2 μ L Nuclease-Free BSA, 1 μ L
9DNA Polymerase〗 Large Fragment，最后加入大约 30 μ C[ α _32P]-dCTP，在室温下标记 3 小时，加入等体积0. 5M NaOH终止反应。8)杂交和压片将标记好的探针加入杂交管中，在65°C杂交12-16小时。倒出杂交液，用 Washing Solution I (hSSC)，65°C清洗 15 分钟；再用 Washing Solution II(2xSSC, 0. 1%SDS)在65°C清洗15分钟，取出膜，在滤纸上晾干，迅速用保鲜膜封好，压入暗匣，并在暗室中放入未曝光的X光片。之后将暗匣放入_80°C显影一天。9)洗片在暗室中取出X光片放入显影液中3分钟，取出，用清水清洗一下，再放入定影液中2分钟，取出，用清水将残留定影液冲洗干净，即可将片子拿出暗室观察和照相。11.试剂的配制11. 1TB0染色液的配置1) pH 4. 4benzoate buffer :benzoic acid 0. 25g, sodium benzoate 0.29g,力口超纯水定容至200mL。2)将 0. Ig toluidine blue 0 溶于 IOOmL 上述溶液中即可。11. 2⑶S显色溶液配方lmmol/L X-gluc 于 100mmol/L 的磷酸钠缓冲液pH 7，含 10mmol/L EDTA, l-5mmol/ L 铁氰化钾，l-5mmol/L 亚铁氰化钾，0. 1% I^ritonX-lOO。12. 1A-15-3互补载体的构建用Ecor I和I3St I酶切BAC T7H20，回收5. 9kb的DNA片段，并将其连接到被EcoR I和I^st I酶切的pCAMBIA2300上。连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，用PCR、酶切和测序方法鉴定阳性菌落。实施例1.突变体的筛选发明人共筛选拟南芥M2代约19，000个植株，得到一系列与产量及营养相关的突变体。本发明人着重分析了 1A-15-3突变体。该突变体与野生型WaSSilewSkiia(WS)回交， Fl代植株为野生型表型，表明1A-15-3是一个隐性突变体；F2代出现分离。实施例2. 1A-15-3突变体的表型鉴定幼苗时期，1A-15-3与野生型没有明显差异，但是1A-15-3比野生型的抽苔时间晚 5-6天。抽苔之后突变体和野生型在株型上表现出明显的差异。按由下到上的顺序，1A-15-3 茎上的第一个节点与莲座叶之间的距离在不同个体间长短不一，且该位点生长出多个分枝并伴有簇生的叶片和荚果，该位置簇生叶片狭长，簇生荚果中多瘪粒；之后的第二、三个节点处也常生有簇生的叶片和荚果；野生型分枝上荚果依次排列，而在1A-15-3的各个分枝上均出现簇生荚果(图1，A-D)，同时突变体荚果比野生型荚果短(图1，E)；从整株来看 1A-15-3的叶片和茎比野生型薄且柔软，株高较矮，单株荚果平均数为186. 67个，显著多于野生型的115个(图1，F)，整个生长周期比野生型长四周左右。进一步观察发现1A-15-3的结实率比野生型低(WS结实率为93%，1A-15_3结实率为74% )，在增加光强或干旱胁迫下1A-15-3的结实率则出现明显下降(结实率约为50% )。1A-15-3的种皮颜色不一，种子较野生型体积增大(图2，A)。统计结果显示， 1A-15-3的平均千粒重Q9mg)为野生型的1. 6倍，株粒重(81mg)为野生型(6ang)的1. 3 倍(图2，B和C)。由此看来，虽然结实率低于野生型，但是由于荚果多和千粒重大，1A-15-3突变体的平均单株粒重较野生型有明显优势。实施例3.突变基因的分离和互补鉴定及功能分析1.突变基因的分离和鉴定鉴于1A-15-3突变体在表型和产量性状上与野生型有明显差异，采用本领域熟知的图位克隆法分离该突变基因。1A-15-3突变体是从WS生态型中诱变所得，因此选用 1A-15-3分别与Col和Lansberg(Lans)生态型杂交，同时构建两个F2代群体用于图位克隆。通过图位克隆法分离了该基因，发现突变表型是由于拟南芥第5染色体上 At5g02030 (PNY)的第二个内含子的第一个碱基发生了由G-A的突变所致。由于该突变碱基位于内含子的剪切识别位点，所以本发明人认为该突变可能会引起前体RNA的异常剪切，进而导致翻译的提前终止或RNA的不稳定。PNY(PENNYWISE)是一个已报道基因，又名 BLR(BELLRINGER)、RPL(REPLUMLESS)和 VAN(VAAMANA)，在 Colunmia 生态型背景，它参与了拟南芥的茎顶端分生组织(Shoot Apical Meristem, SAM)以及荚果果皮和胎座框的分化和发育等重要生命过程(Smith andHake，2003 ；Ragn et al，2008 ；Bhatt et al,2004 ；Byrne et al,2003 ；Alonso-Cantabrana et al，2007)，未见报道该基因与种子大小和/或油脂合成有关。从 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)获得的 PNY 在 Col 背景下的T-DNA插入突变体pnyl与1A-15-3的表型进行了比较分析。pnyl的种子也比Col野生型大，pnyl的千粒重约为21. 3毫克，Col为14. 2毫克，pnyl株粒重也大于对照Col (约1.2 倍)(图3)。发现在Columbia遗传背景下，PNYl的突变对结实率没有明显影响(pnyl结实率约为94%，Col野生型为96% )。为了进一步验证1A-15-3体中的突变性状是否由PNY基因的点突变所引起，从 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)获得含有 PNY 基因的 BAC 克隆 T7H20， 用Ecor I和I^st I酶将包括PNY启动子和编码序列(大约61Λ)的DNA片段切下，连接到 PCAMBIA2300载体上，并用这一载体转化1A-15-3突变体，筛选出转化阳性株系并观察其表型。如图4，RT-PCR检测结果显示，互补株系CA6-l、CA8-2和CA11-2中PNY的表达恢复正常，它们的株型和生长周期也与野生型相似。互补株系CA6-l、CA8-2和CA11-2的种子长度分别为 327. 4μπι、330. 7μπι和 334. 7μπι，宽度分别 187. 7 μ m、192. 2 μ m和 189. 3 μ m 与突变体(长407. 3 μ m，宽233. 8 μ m)存在显著差异，和野生型(长321. 6 μ m，宽188. 6 μ m)相似 (图 4，C 和 D)。2. PNY在种子发育中的功能分析通过图位克隆分离了 1A-15-3的突变基因At5g02030 (PNY)(本申请中的控制种子大小和油脂合成的基因)。在前人的研究中发现PNY与BP相互作用调节花序的发育以及荚果的形态(Smith and Hake, 2003 ；Ragn et al，2008 ；Bhatt et al,2004 ；Byrne et al, 2003 ；Alonso-Cantabrana etal，2007)。我们发现在种子的发育时期，PNY除了在胎座框中表达之外，还在发育的胚中表达，说明PNY还参与了种子的发育。通过对WS野生型、1A-15-3 突变体及互补株系的分析，发现PNY参与了种子大小和脂肪酸合成的调控。电镜照片的统计结果表明1A-15-3的种子的细胞大小与野生型没有明显差异，证明其种子体积增大是由细胞数目增多所致。因此，PNY基因突变很可能促进了种子细胞分裂或延缓了细胞分裂的终止进程，从而导致种子细胞数的增加。
3. PNY参与拟南芥种子脂肪酸合成的调控由于RT-PCR的结果显示，突变体中与脂肪酸合成相关的基因LEC1，LEC2，CAC2表达明显上调，因此本发明人推测PNY参与了脂肪酸合成的调控。种子脂肪酸含量测定结果显示，1A-15-3突变体的总脂肪酸含量为567. 02mg/g，是野生型(331. 49mg/g)脂肪酸含量的1. 7倍，互补株系CA6-1、CA8-2和CA11-2的脂肪酸含量恢复到接近野生型水平，分别为 433. 85mg/g、332. 25mg/g、257. 8ang/g(图5)。这些结果表明，PNY基因的突变引起了种子脂肪酸含量的改变，说明PNY参与了种子脂肪酸合成的调控。进一步对种子中各组分脂肪酸的分析表明，在1A-15-3突变体中各脂肪酸组分，C16:0、C18:0、C20:0、C18:2、C18:3、C20:1 和C22:1的含量均显著高于野生型和互补植株(图6)。说明PNY对脂肪酸合成的调控应在于合成的早期步骤，而不是后期的碳链延长和加工过程。1A-15-3的籽粒颜色不均一，存在大量色素沉积严重的籽粒这可能与籽粒中的脂肪酸含量发生变化有关，且突变体中与调控种子脂肪酸合成的基因LEC1，LEC2的表达上调，编码脂肪酸合成中的biotin-subimit基因CAC2也强烈上调。种子中脂肪酸含量测定证实1A-15-3突变体种子的脂肪酸总量及各组分脂肪酸含量均明显高于野生型和互补株系， 由此可以认为PNY作为一个负调控因子参与种子脂肪酸合成，因此PNY的突变导致脂肪酸合成上游调控基因LECl和LEC2的上调表达，从而导致种子脂肪酸含量的升高。另外，TAGl 基因编码乙酰辅酶A-二酰基甘油酰基转移酶，该酶催化TAG合成的最后一步。在1A-15-3 突变体中TAGl的表达量与野生型没有明显变化，说明PNY只参与脂肪酸的合成的调控，而不影响脂肪酸合成之后的TAG合成过程。本发明人通过以上具体实施方式
，证明PNYl是一个控制产量和品质性状的重要基因，参与了拟南芥种子大小和脂肪酸合成的负调控。通过敲除或减量表达该基因可增加种子千粒重和种子脂肪酸含量。同时，在希望的植物中过量表达该基因，可以降低种子中脂肪酸的含量。可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因而，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。参考文献1. Alonso-Cantabrana H. , Ripoll J. J. , Ochando I. , Vera A. , Ferrandiz C., Martinez-Laborda Α.Common regulatory networks in leaf and fruitpatterning revealed by mutations in the Arabidopsis ASYMMETRICLEAVES1 gene. Development, 2007(134) :2663-26712. Bhatt A.M. , Etchel Is J. P. , Canales C. , Lagodienko A. , Dickinson H.VAAMANA—a BELl-Iike homeodomain protein, interacts with KNOXproteins BP and STM and regulates inflorescence stem growth inArabidopsis. Gene, 2004(328) 103-1113. Byrne Μ. Ε. , Groover Α. Τ. , Fontana Joseph. R. , Martienssen R. A. PhVllotactic pattern and stem cell fate are determined by the Arabidopsishomeobox gene BELLRINGER. Development,2003(130) :3941-3950
12
4. Ragn L. ,Belles-Boix E.，Gunl M.，Pautot V. Interaction of KNAT6 andKNAT2 with BREVIPEDICELLUS and PENNYffISE in Arabidopsisinflorescences. Plant Cell, 2008(20) :888-9005. Smith H. M. S. , Hake S. The interaction of two homeobox genes, BREVIPEDICELLUS and PENNYffISE,regulates internode patterningin the Arabidopsis inflorescence. Plant Cell,2003 (15) :1717_1727。
权利要求
1.分离的多核苷酸，其包含或由选自下组之一的多核苷酸组成a)具有SEQID NO 1所示序列的多核苷酸；b)多核苷酸，其编码SEQID NO :4所示的氨基酸序列，或编码在SEQID NO :4所示的氨基酸序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO 2所示的cDNA序列，或具有SEQ IDNO 3所示的序列；c)多核苷酸，其与SEQID NO 1所示序列具有至少60%序列同一性；d)多核苷酸，其在严谨条件下与a)或b)或c)之一杂交；e)多核苷酸，其为a)_d)之一的片段。
2.权利要求1的多核苷酸，其中c)中所述的多核苷酸与SEQID NO :1所示序列具有至少70%序列同一性，优选至少80%序列同一性，还优选至少95%序列同一性；更优选至少99%序列同一性。
3.权利要求1或2的多核苷酸，其是一种控制种子大小和/或油脂合成的核酸。
4.分离的多核苷酸，其具有SEQID NO :1所示序列，其中位点1942的G被A取代。
5.载体，其包含权利要求1-4中任一项的至少一种多核苷酸。
6.核酸构建体，其包含前述权利要求1-4中任一项的多核苷酸。
7.植物细胞，其包含权利要求6中所述的核酸构建体。
8.植物，其包含权利要求7的细胞。
9.权利要求8的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
10.权利要求9的植物，其中所述单子叶植物选自玉米，稻，小麦，大麦或棕榈。
11.权利要求9的植物，其中所述双子叶植物选自拟南芥，大豆，油菜，花生，向日葵， 红花，棉花，烟草，番茄，马铃薯和可可。
12.权利要求11所述的植物，其为拟南芥。
13.权利要求8的植物，其中所述植物是蓝藻。
14.植物材料，包括权利要求9-13任一项中所述的植物的后代，克隆，繁殖材料，种子，荚果。
15.权利要求14的植物材料，其为种子。
16.从权利要求14的植物材料制备的组合物，包括食品，油，粉，饲料。
17.从经转化的植物的一或多种种子制备的油，所述植物含有权利要求1-4所述的多核苷酸。
18.一种蛋白质，其具有如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列或该序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列。
19.一种促进种子增大和/或油脂合成的方法，包括在产生所述种子并且含有权利要求1-3任一项的多核苷酸的植物中使权利要求1-3任一项的多核苷酸表达降低或不表达的步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述方法是RNA干扰方法或反义RNA方法。
21.一种促进种子增大和/或油脂合成的方法，包括在产生所述种子并且含有权利要求18的蛋白质的植物中使权利要求18的蛋白质活性降低或丧失的步骤。
22.—种抑制种子增大和/或油脂合成的方法，包括用权利要求1-3任一项所述的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤。
23.权利要求1-4任一项所述的多核苷酸在控制种子大小和/或油脂合成中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种控制种子大小和/或油脂合成的基因，包含该基因的载体，核酸构建体，细胞，植物材料等，本发明还涉及一种控制种子大小和/或油脂合成的方法，以及本发明的基因的用途。
文档编号A01H5/10GK102212529SQ20101014751
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者凌宏清, 孔丹宇, 陈春林 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所