专利名称：胚芽乳酸杆菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明关于乳酸杆菌菌株及其用途，尤其关于经分离的胚芽乳酸杆菌菌株 (Lactobacillus plantarum)CMU995及其用途，其寄存于德国国家菌种保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，寄存编号为 DSM 23780，寄存日期为2010年7月15日，寄存机构地址为hhoffen straP e 7B，38124Braunschweig，德国。
背景技术：
乳酸杆菌为存在于人类和动物肠道中的主要细菌，由于其具有许多有益于人体及动物体的生理活性，故常应用于各种益生菌(probiotic)产品中。举例言之，乳酸杆菌可抑制肠内病原菌(例如沙门氏菌或大肠杆菌)的生长，或抵抗病原菌的入侵，例如可防止沙门氏菌属的伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)侵入胃肠道上皮细胞。目前已有许多乳酸杆菌用于抑制病原菌的应用的相关专利，例如美国专利第5，603，930号中所揭露的约氏乳酸杆菌菌株(LactcAacillusjohnsonii)，可抑制肠毒素及肠侵入性病原菌；美国专利第3，953，609号中所揭露的雷特氏乳酸杆菌菌株 (Lactobacillus lactis)，可抑制消化系统中大肠杆菌的生长；以及美国专利第6，491，956 号中所揭露的嗜酸乳酸杆菌菌株(LactcAacillus acidophilus)，可预防及治疗由幽门螺旋杆菌感染所造成的胃炎、十二指肠溃疡及胃溃疡。乳酸杆菌若欲于动物体内有效地发挥功能，除须具备基本的生理/药理活性外， 尚须具有两个重要特性。首先，该乳酸杆菌须对动物胃肠道所分泌的胃酸和胆碱具有耐受性，才可存活于消化系统中而到达肠道，进而发挥作用。再者，该乳酸杆菌对动物宿主的肠道上皮细胞须有牢固的吸附能力，才可于胃肠道中与病原菌竞争吸附，免于因遭病原菌排除，而无法发挥功能。此外，由于病原菌亦借助吸附肠道上皮细胞的方式来感染动物体，若乳酸杆菌对肠道上皮细胞具有相对牢固的吸附能力，亦可达到排除病原菌，保护胃肠道免受感染的效果。本案发明人自新生儿的粪便中，筛选出一种新颖胚芽乳酸杆菌菌株，且经由活体内(in vivo)及活体外(in vitro)的相关实验，发现其除具有抑制病原菌的功效外，尚具有优异的胃肠道及泌尿道细胞的附着性，故可持久且有效地保护胃肠道及泌尿道免受病原菌的感染。另发现，该菌株甚至可以直接抑制病原菌生长，积极预防及治疗由该病原菌所致的疾病。
发明内容
本发明的一目的在于提供一种经分离的胚芽乳酸杆菌菌株(LactcAacillus plantarum)CMU995，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM 23780。本发明的另一目的在于提供一种组合物，其包含胚芽乳酸杆菌菌株CMU995。本发明的又一目的在于使用胚芽乳酸杆菌菌株CMU995制成抑制病原菌、保护胃肠道、及预防或治疗泌尿道感染的药物或保健食品等用途。本发明的技术及较佳实施方式，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。
图1所示为胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的基因指纹图谱。本发明的经分离的胚芽乳酸杆菌菌株(LactcAacillus plantarum) CMU995是寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM23780，寄存日期为2010年7月15日，寄存机构地址为 Inhoffen stra β e7B, 38124 Braunschweig,德国。
具体实施例方式本案发明人自健康新生儿的粪便中，筛选并分离出一种新颖的乳酸杆菌菌株，经菌种鉴定为Lactobacillus plantarum(中文名称为胚芽乳酸杆菌或植物乳酸杆菌)，且经命名为Lactobacillus plantarum CMU995 (以下称为胚芽乳酸杆菌菌株CMU995)。如上所述，乳酸杆菌对动物宿主的肠道上皮细胞须有牢固的附着能力，才可于胃肠道中与病原菌竞争吸附，进而排除病原菌，以达成所欲的生理效果。经发现，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可附着于胃肠道的上皮细胞，且相较于市面上常见的Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)乳酸菌，对胃肠道上皮细胞具有更强的吸附力。胚芽乳酸杆菌菌株CMU995除可附着于胃肠道的上皮细胞外，亦可牢固地附着于泌尿道的上皮细胞，故可于泌尿道中与病原菌竞争吸附，进而排除病原菌，以达成保护泌尿道的功效。由于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995对胃肠道及泌尿道具良好附着性，其可用于预防或治疗病原菌的感染。就预防的应用而言，可将胚芽乳酸杆菌菌株CMU995添加于如饲料、 饮料、营养补充品或保健食品中，使此菌株附着及保护食用者的胃肠道或泌尿道，而当病原菌入侵胃肠道或泌尿道时，由于无法与胚芽乳酸杆菌菌株CMU995竞争吸附，遂无法启动感染机制，而进一步被排出体外。就治疗应用方面，当人体或动物体的胃肠道或泌尿道遭病原菌感染时，举例言之，可服用包含胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的药物，透过胚芽乳酸杆菌菌株CMU995对胃肠道及泌尿道的吸附特性，排除附着于胃肠道或泌尿道内的病原菌，达成治疗效果。因此，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可借助其强烈吸附力来抑制病原菌对胃肠道或泌尿道细胞的附着，进而预防或治疗病原菌的感染。胚芽乳酸杆菌菌株CMU995除可拮抗病原菌对胃肠道或泌尿道的吸附，间接地抑制感染外，还可直接地抑制病原菌的生长，经由此二种抑制机制的加乘作用来保护胃肠道及/或泌尿道。因此，于本文中，“抑制病原菌”一词，包含抑制病原菌对胃肠道的附着、抑制病原菌对泌尿道的附着、以及抑制病原菌的生长。胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可用于抑制胃肠道及/或泌尿道中的各种病原菌；举例言之，可抑制选自以下群组的病原菌幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、沙门氏菌属(Salmonella spp·)、大肠杆菌属(Escherichia spp.)、金黄色葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、志贺氏杆菌(Shigella flexneri)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、白色念珠球菌(Candida albicans)或前述的组合，尤其是用于抑制幽门螺旋杆菌。幽门螺旋杆菌为革兰氏阴性、微需氧的致病菌，可生存于胃部及十二指肠的各区域内。幽门螺旋杆菌的传染途径迄今仍不明确，其会引起胃黏膜的慢性发炎，造成胃溃疡及十二指肠溃疡，甚至导致胃癌，因此，世界卫生组织宣布幽门螺旋杆菌为微生物型的致癌物质，也是第一个被发现可致癌的原核生物。全世界有超过五成的人口为幽门螺旋杆菌的带原者，尤其于发展中国家更为盛行。目前主要使用抗生素来治疗由幽门螺旋杆菌所引起的疾病，然而，由于其抗药性的产生，许多抗生素已无法达到令人满意的治疗效果。由于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可明显地抑制幽门螺旋杆菌的生长及其对肠道上皮细胞的附着，故可用于结合、甚或取代传统的抗生素治疗方法，以有效地预防或治疗由幽门螺旋杆菌所引起的各种疾病。此外，由于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可直接抑制病原菌的生长，故可运用于预防及治疗由病原菌所引起的疾病，而不限于胃肠道相关疾病。举例言之，已知金黄色葡萄球菌属除可感染胃肠道外，亦可感染如呼吸道、尿道、静脉及伤口等部位，故可利用胚芽乳酸杆菌菌株CMU995抑制金黄色葡萄球菌属生长的特性，将其应用于上述感染部位的治疗或感染预防。另一方面，白色念珠球菌除可感染胃肠道外，亦可感染如口腔及泌尿道的黏膜组织，故亦可利用胚芽乳酸杆菌菌株CMU995抑制白色念珠球菌生长的特性，将其应用于经感染的口腔或泌尿道的治疗或感染预防。由于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的抑制病原菌生长及附着的特性，其可广泛地运用于各种医疗及保健产品中。因此，本发明亦提供一种组合物，其包含胚芽乳酸杆菌菌株 CMU995。基于胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的上述特性，本发明的组合物可用于抑制病原菌、 保护胃肠道、保护泌尿道或前述的组合。本发明组合物可呈任何形式，举例言之，其可呈一选自以下群组的形式医药组合物、饲料、饮料、营养补充品、食品、保健食品及乳制品，或者，可呈一选自以下群组的形式 喷剂及塞剂。于本发明的一实施方式中，胚芽乳酸杆菌菌株CMU995可添加于食品中，例如制成包含此菌株的乳制品等。有关乳酸杆菌于医药组合物及食品的应用，可参考如于2007 年3月1日公开的TW20050129645及于2006年4月16日公开的TW20040131385的专利申请文件。可视需要于本发明组合物中添加任何适宜的添加物，进一步加强抑制病原菌生长及附着的效果，或者，添加其他营养或药性成分，以增加组合物的运用灵活性与调配度。举例言之，本发明组合物可另含有一种或多种如制酸剂及其他益生菌等其他活性成分，只要该活性成分对胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的效益没有不利的影响即可。本发明亦提供一种胚芽乳酸杆菌菌株CMU995于制造药物或保健食品的用途，例如，其可用以制备成具任何合宜形式的用于抑制病原菌、保护胃肠道、及预防或治疗泌尿道感染的药物或保健食品。兹以下列具体实施方式
以进一步例示说明本发明。其中该些实施方式仅提供作为说明，而非用以限制本发明的范畴。[实施例1]附着力分析实验A、制备乳酸杆菌菌株进行胃肠道细胞的附着力分析所使用的乳酸杆菌菌株包括本发明的
5Lactobacillus ρlantarum CMU995、Lactobacillus rhamnosus GG(LGG，鼠李糖乳酸杆菌) 及本实验室分离的B7P3、A7G1、B1T4、IA5、HT5菌株。以MRS培养液(Difco，底特律，密西根州，美国)活化所有受试乳酸杆菌两次后，分别将其接种至5毫升的MRS培养液中进行培养。M小时后，取1毫升菌液，并以6000转/分钟离心10分钟，以pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS，phosphate buffer solution)清洗两次，再进行吸附试验。以 Lactobacillus rhamnosus GG作为对照组。实验B、培养胃肠道/泌尿道的细胞株本实验使用的胃肠道细胞株为Caco-2人体肠癌细胞株(human colonadenocarcinoma，美 15 典型培胃物 1 藏中>[>，American Type CultureCollection, ATCC，寄存编号ATCC CRL 2102)及AGS胃癌细胞株(gastricadenocarcinoma，美国典型培养物保藏中心，寄存编号ATCC CRL 1739)；使用的泌尿道细胞株为Hela人类子宫颈上皮细胞(美国典型培养物保藏中心，寄存编号ATCC CCL-2)，皆购自台湾生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC),且已通过细菌、霉菌及霉浆菌(mycoplasma)污染测试。取得细胞株后，迅速将其移至37°C的恒温水浴槽中使其回温解冻，并培养于25平方厘米的培养皿中，再静置于37°C、含有5体积％二氧化碳的细胞培养箱中进行培养。细胞活化后继代数次，待细胞株稳定后才进行后续实验。Caco-2细胞的培养基为Dulbecco，s Modified Eagle培养基(DMEM，购自Gibco公司)，AGS细胞的培养基为F-12培养基(购自Gibco公司)，Hela细胞的培养基为最低基础培养基(Minimum essential medium, MEM，购自Gibco公司)，以上培养基皆需添加10体积％的胎小牛血清 (fetal bovine serum, FBS)。实验C、乳酸杆菌附着性分析将实验B中制备的细胞株分别以1毫升的0.05体积％胰蛋白酶(trypsin)处理5 分钟后，将其分装于一 96孔培养盘中，每个孔中加入1 X IO4个细胞，每天置换200微升的新鲜培养基。接着，添加20微升的实验A中制备的乳酸杆菌菌液于细胞中，并培养1小时，使乳酸杆菌附着于细胞上。进行附着1小时后，移除培养基，使用磷酸盐缓冲溶液清洗五次， 以去除未附着的乳酸菌，再添加100微升的10体积％福尔马林，以固定细胞及乳酸杆菌。30 分钟后，再以磷酸盐缓冲溶液清洗细胞3次，最后以100微升结晶紫(crystal violet)进行染色达5分钟，并以少量75体积％酒精快速冲洗，以去除细胞上的染色剂。利用相差显微镜观察各种乳酸杆菌对胃肠道或泌尿道上皮细胞的吸附性，并随机在不同的显微镜视野(randomized microscopic areas)下，观察并计算50个细胞的乳酸杆菌吸附情形，以及计算每个细胞的平均吸附乳酸杆菌数量。结果如表1所示。表1
权利要求
1.一种经分离的胚芽乳酸杆菌菌株(LactcAacillus plantarum) CMU995，其寄存于德国国家菌禾中保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures,DSMZ), 寄存编号为DSM 23780。
2.如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，所述胚芽乳酸杆菌菌株 CMU995具有胃肠道及/或泌尿道附着性。
3.如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，所述胚芽乳酸杆菌菌株 CMU995具有抑制病原菌生长的功效。
4.如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，所述胚芽乳酸杆菌菌株 CMU995具有抑制病原菌对胃肠道及/或泌尿道附着的功效。
5.如权利要求3或4的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，该病原菌选自以下群组幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、 沙门氏菌属(Salmonella spp.)、大肠杆菌属(Escherichia spp.)、金黄色葡萄球菌属 (Staphylococcus spp·)、志贺氏杆菌(Shigella flexneri)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) > ^^it^W-M (Candida albicans) $1 " 的
6.如权利要求5的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其特征在于，该病原菌是幽门螺旋杆菌。
7.一种组合物，其特征在于，包含如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995。
8.如权利要求7的组合物，其特征在于，所述组合物用于抑制病原菌、保护胃肠道、保护泌尿道或前述的组合。
9.如权利要求8的组合物，其特征在于，该病原菌选自以下群组幽门螺旋杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌属、大肠杆菌属、金黄色葡萄球菌属、志贺氏杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠球菌或前述的组合。
10.如权利要求7的组合物，其特征在于，所述组合物选自以下群组的形式医药组合物、饲料、饮料、营养补充品、乳制品、食品或保健食品。
11.如权利要求7的组合物，其特征在于，所述组合物选自以下群组的形式喷剂或塞剂。
12.—种如权利要求1的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995用于制造抑制病原菌、保护胃肠道、 及/或保护泌尿道的药物的用途。
13.如权利要求12的用途，其特征在于，该病原菌选自以下群组幽门螺旋杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门氏菌属、大肠杆菌属、金黄色葡萄球菌属、志贺氏杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠球菌或前述的组合。
全文摘要
一种经分离的胚芽乳酸杆菌菌株CMU995，其寄存于德国国家菌种保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，寄存编号为DSM 23780。一种包含胚芽乳酸杆菌菌株CMU995的组合物，及胚芽乳酸杆菌菌株CMU995用于制造抑制病原菌、保护胃肠道、及预防或治疗泌尿道感染的药物或保健食品的用途。
文档编号A23K1/16GK102337227SQ201010233798
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者林文鑫 申请人:中国医药大学