专利名称：一种利用ugt72b14制备红景天甙的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用UGT72B14制备红景天甙的方法。
背景技术：
高山红景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor)又名库页红景天，是景天科 (Crassulaceae)红景天属(Rhodiola rosea L.)植物，为多年生草本或亚灌木，常具肉 质匍匐根状茎，是长白山珍稀药用植物之一。红景天属植物的主要活性成分为红景天甙 (salidroside)和甙元酪醇(tyrosol)等，现代药理学研究结果表明红景天甙具有明显的 抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、延缓机体衰老等功效，对于航天、深海、沙漠、高 原、体育等行业是一种极具开发应用前景的环境适应药物，同时对高辐射从业人员、微机使 用频繁人员、强脑力劳动者、中老年人群具有积极的滋补保健作用。大量的研究工作表明毛状根系统可表现出不同程度的原植物次生代谢产物的合 成能力，因此毛状根培养体系被认为是继细胞培养后最有前途的生产次生代谢产物的培养 系统。目前，通过毛状根培养可以生产的次生代谢产物有生物碱类、苷类、黄酮类、醌类、多 糖类和蛋白质等。近年来，利用毛状根作为“生物反应器”来生产药用植物的有效成分，已 在多种植物中获得成功，如人参、红豆杉等。而且通过Ri质粒介导向植物基因组插入外源 基因的超表达，来促进药用植物次生代谢物质的产生或实现药用成分的生物转化(如乙酰 化、糖基化等)也已获得成功，如用Ri质粒作为载体将来源于棉花的FDS (法呢基二磷酸合 成酶)基因导入药用植物青蒿中，可大幅度提高毛状根中青蒿素的含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用UGT72B14制备红景天甙的方法。本发明提供的制备红景天甙的方法，包括如下步骤1)将UGT72B14蛋白的编码基 因导入目的植物的外植体，得到转基因的毛状根；2)从所述转基因的毛状根中提取红景天 甙，得到红景天甙；所述UGT72B14蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述序列2由473个氨基酸组成。所述UGT72B14蛋白的编码基因通过重组发根农杆菌介导导入目的植物的外植 体；所述UGT72B14蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。所述重组发根农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主发根农杆菌得到的重 组发根农杆菌；所述重组植物表达载体为将所述UGT72B14蛋白的编码基因插入载体pBRin713的 BgLII和Bst EII识别位点间得到的。将所述UGT72B14蛋白的编码基因导入目的植物的外植体，得到转基因的毛状根 的方法包括如下步骤用重组发根农杆菌侵染所述目的植物的外植体，再依次进行共培养、 抑菌培养，得到带有毛状根的外植体；取所述带有毛状根的外植体中的毛状根，将其进行筛
4选培养，得到所述转基因的毛状根。所述将UGT72B14蛋白的编码基因导入目的植物外植体，得到转基因植物的毛状 根的方法中，在所述取所述带有毛状根的外植体中的毛状根后，在所述筛选培养前，包括将 所述毛状根进行继代培养的步骤；所述用重组发根农杆菌侵染所述目的植物的外植体的时间为15分钟。所述外植体为叶盘。从叶片上通过打孔器打下来的小圆片即为叶盘，可用于转基因转染。所述共培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌 呤、玉米素和乙酰丁香酮，得到所述共培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所述共培 养所用的培养基中的浓度为0. 2mg/L，所述玉米素在所述共培养所用的培养基中的浓度为 0. 2mg/L，所述乙酰丁香酮在所述共培养所用的培养基中的浓度为25mg/L ；所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加乙酰丁香酮、 羧苄青霉素和头孢霉素，得到所述抑菌培养所用的培养基，所述乙酰丁香酮在所述抑菌培 养所用的培养基中的浓度为25mg/L，所述羧苄青霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓 度为250mg/L，所述头孢霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为250mg/L ；所述筛选培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加头孢霉素、羧 苄青霉素和潮霉素，得到所述筛选培养所用的培养基，所述头孢霉素在所述筛选培养所用 的培养基中的浓度为250mg/L，所述羧苄青霉素在所述筛选培养所用的培养基中的浓度为 250mg/L，所述潮霉素在所述筛选培养所用的培养基中的浓度为25mg/L ；所述继代培养的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加头孢霉素和羧苄 青霉素，得到所述继代培养的培养基，所述头孢霉素在所述继代培养的培养基中的浓度为 250mg/L，所述羧苄青霉素在所述继代培养的培养基中的浓度为250mg/L ；每IOOOml所述共培养所用的培养基按照如下方法配置700mlMS液体培养基中加 入0. 2ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 2ml玉米素母液、1. 25ml乙酰丁香酮母液后，蒸馏水定容至 1000ml，得到所述共培养用的培养基；每IOOOml所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配置700mlMS液体培养基中 加入1. 25ml乙酰丁香酮母液、2. 5ml羧苄青霉素母液、2. 5ml头孢霉素母液后，蒸馏水定容 至1000ml，得到所述抑菌培养所用的培养基；每IOOOml所述筛选培养所用的培养基按照如下方法配置700mlMS液体培养基 中加入0. 25ml潮霉素母液、2. 5ml羧苄青霉素母液、2. 5ml头孢霉素母液后，蒸馏水定容至 1000ml，得到所述筛选培养所用的培养基；每IOOOml所述继代培养所用的培养基按照如下方法配置700mlMS液体培养基中 加入2. 5ml羧苄青霉素母液、2. 5ml头孢霉素母液后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述继代
培养所用的培养基；所述6-苄氨基嘌呤母液按照如下方法配置称取50mg 6_苄氨基嘌呤用IOml IM 的NaOH水溶液溶解，加水定容到50ml，得到所述6-苄氨基嘌呤母液；所述玉米素母液按照如下方法配置称取2mg玉米素用Iml IM NaOH水溶液溶解 后加水定容到2ml，得到所述玉米素母液；所述乙酰丁香酮母液按照如下方法配置称取200mg乙酰丁香酮用3ml甲醇溶解后加二甲基亚砜定容到10ml，得到所述乙酰丁香酮母液；所述羧苄青霉素母液按照如下方法配置称取500mg羧苄青霉素溶解在水中后， 加水定容到10ml，得到所述羧苄青霉素母液；所述头孢霉素母液按照如下方法配置称取IOOOmg头孢霉素溶解在水中后，加水 定容到10ml，得到所述头孢霉素母液；所述潮霉素母液按照如下方法配置称取IOOOmg潮霉素溶解在水中后，加水定容 到10ml，得到所述潮霉素母液；所述共培养的时间为2天，所述共培养的温度为25°C，所述共培养为暗培养；所述 抑菌培养的时间为25天，所述抑菌培养温度为25°C，所述抑菌培养为暗培养；所述筛选培养的时间为30天，所述筛选培养温度为22°C，所述筛选培养为光照培 养，光照强度为12001x;所述继代培养的时间为20天，所述继代培养的温度为25°C，所述继代培养为暗培养。所述UGT72B14蛋白的编码基因为序列表中的序列1的自5，末端第53位到第1474 位核苷酸所示的DNA分子。上述序列1由1671个核苷酸组成，其OFR为序列1的自5’末端第53位到第1474 位核苷酸所示的DNA分子。在所述制备红景天甙的方法中，在所述步骤2)前还包括如下步骤扩培培养所述 转基因的毛状根，得到扩培的转基因的毛状根；所述扩培培养使用的培养基为1/2M&培养基；所述扩培培养的温度为22°C、所述 扩培培养的振荡速度为120rpm，旋转半径为13mm，所述扩培培养的时间为75天，且每25天 继代一次。所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，所述双子叶植物优选为景天科植 物，所述景天科植物优选为红景天属植物，所述红景天属植物尤其优选为高山红景天。本发明的实验证明，将UGT72B14基因置于植物高效表达载体pBRin713的35S启 动子+Ω增强子下游，通过发根农杆菌介导法转化高山红景天，通过强效启动子的增进表 达及基因转化培养基优化，UGT72B14的高效表达导致转基因高山红景天发根中红景天甙含 量较对照提高4. 2倍。本发明为利用高山红景天转基因毛状根系统过表达红景天甙生物合 成途径关键酶-UGT72B14提供了具有创新性和实用性的相关技术方法及应用。
图1为红景天根中糖基转移酶活性随时间变化趋势图2为红景天根总RNA的电泳结果图3为红景天根3’ RACE结果图4为所获得基因5’ RACE结果图 5 为 UGT72B14 全长 cDNA 的 PCR 扩增图6为UGT72B14蛋白的结构功能域分析图7为pBSUGT72B14表达载体的构建示意8为发根农杆菌介导转化遗传高山红景天路线图
图9为部分转基因高山红景天发根的PCR和PCR-southern检测结果图10为转基因高山红景天发根的红景天甙含量测定结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、UGT72B14基因分离应 M RACE(rapid-amplification of cDNA ends)^ C0DEH0P(consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)简并弓丨物设计以及 茉莉酮酸甲酯(MeJA)诱导的方法成功地从高山红景天根组织分离得到1个新的UDP-葡萄 糖基转移酶基因cDNA全序列。具体过程如下1、红景天根中糖基转移酶活性随时间变化趋势为了优化分离酪醇葡萄糖基转移酶基因的RNA提取时期，对MeJA诱导高山红景天 根产生的糖基转移酶活性随时间变化趋势进行分析。研究以酪醇为底物，测定了不同时间 高山红景天愈伤与根粗酶液中糖基转移酶的比活力(U/mg FW)，结果见图1。由图可见，根中 催化酪醇的酶比活力在第12天时测量值在6次中最高，由于蛋白合成要滞后于转录过程， 因此选取10天的根组织作为RNA提取材料。2、总RNA的提取使用改进的CTAB方法提取红景天根RNA，改良的RNA提取缓冲液中加入强还原剂 β -巯基乙醇和螯合剂PVP40，有效的降低了多酚类物质的影响；而LiCl的选择性沉淀则排 除了红景天中大量糖类物质对提取的干扰。纯度检测结果为根总RNA平均的0D26(I/0D28(i值 约为1.85，说明提取的总RNA比较纯净，这种方法是一种有效的红景天根总RNA提取方法 (图 2)。3、UGT72B14基因3，端序列的分离以高山红景天根组织总 RNA 为模板，以 QT (5，-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCT CAAGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘)为反转录引物，按照Promega反转录试剂盒说明书进行cDNA 第一链的合成。之后以反转录的cDNA第一链为模板，根据C0DEH0P设计的简并引物(Block H :5，-CAGCTGTTGGAGTTTTTGTTACTCAytgyggntgga-3，. N 是任何碱基；Y 是 C 或 T)，与设计的 锚定引物为组合进行套式PCR扩增，PCR电泳结果显示获得1条大小约500bp左右的特异 条带(图3 :M :DL2000marker ； 1-3 分别为16d，12d，0d时提取RNA的PCR扩增结果)，所获 得基因的碱基长度与预计的可能长度相符。将所获得的cDNA片段经DNA测序后并进行生物信息学分析后发现，其氨基酸序列 与已注册的植物UDP-葡萄糖基转移酶羧基末端序列具有较高的同源性(最高达到65% )， 说明该序列是高山红景天1个UDP-葡萄糖基转移酶基因的3’端，长度为530bp，而且是一 个新基因。4、UGTC2和UGTR基因5，端序列的克隆所获得基因的5，-RACE的试验结果如图4(M =DL 2000marker ；1 :PCR扩增结果) 所示。将图4中所示特异性的、与预计大小(保守区到5’端碱基长度)相符的条带回收、连接T载体、转化、鉴定、测序、分析、测序后，结果发现所得序列与其它植物UDP-葡萄糖基 转移酶基因同源性不是很高，最高分别达到62%，基因长度为1241bp。5、全长cDNA的克隆利用DNAman软件对分离的基因的cDNA3’端序列和5’端序列测序结果进行电子合 并，得到全长为1671的序列，命名为UGT72B14。UGT72B14的核苷酸序列为序列表中的序列 LOFR的序列为序列表中序列1的自5，末端第53位到第1474位核苷酸的序列。UGT72B14 编码的蛋白命名为UGT72B14，其氨基酸序列为序列表中的序列2。表1中相应的引物，以根的RNA反转录的cDNA第一链为模板，扩增出长度为 1433bp (保括酶切位点和保护碱基的序列)的UGT72B14基因的完整开放读码框内序列，结 果见图5(M:DL2000marker ；1 :UGT72B14基因全长PCR扩增结果)，电泳显示序列长度与预 期大小相符。同样，该条带经回收、T载体连接、转化、鉴定后测序。测序结果同电子合并的 结果(序列表中的序列1)相符。表1UGT72B14 cDNA全长引物(酶切位点用于植物表达载体的构建)
组织酶切位
基因名工、引物名序列^
5，-GAAGATCTATGGC UGT72B14 根 pUGTRup TGGCTCAGGCACA Bgl II 6、UGT72B14基因的生物信息学分析利用DNAman软件对获得的UGT72B14基因全长cDNA序列进行分析，所获得的 UGT72B14 cDNA全长1671bp (序列1)，其中包括1422bp (序列1自5，末端第53位到第1474 位核苷酸)完整的开放阅读框(open reading frame，0RF)，推测编码473个氨基酸的多肽， 同时含有53bp的5’非转译区(5’ UTR)和97bp 3’非转译区(3’ UTR)以及多聚腺苷酸尾。 5'UTR区起始密码子前出现终止密码子，并且通过BLASTp和已知其他植物糖基转移酶的序 列比对，结果证明获得的UGT72B14基因的cDNA是完整的。7、UGT72B14基因的结构和功能域分析用BLAST 服务器(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)中的 protein blast 对UGT72B14基因推测编码的氨基酸序列进行结构域分析，分析表明UGT72B14在261-440 之间含有一个典型的UDP-葡萄糖基转移酶特征性结构域，而在255-442之间有一个典型的 C0G1819也即糖基转移酶结构域，见图6。UGT72B14基因可通过上述方法获得，也可人工合成。实施例2.发根农杆菌介导的UGT72B14转化高山红景天人工合成序列表中序列1所示cDNA。
1、pBSUGT72B14 载体的构建以上述人工合成的CDNA为模板，用引物pUGTRup和pUGTRdown进行PCR扩 增，得到的PCR产物经过BgLII和Bst EII酶切后得到的片段插入到pBRin713载 体(Ma, L. Q.，Liu, B. Y.，Gao, D. Y.，Pang, X. B.，Lu, S. Y.，Yu, H. S.，Wang, H.，Yan, F. , Li, Z. Q. , Li, Y. F. , Ye, H. C. , 2007. Molecular cloning and overexpression of a novelUDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis. Plant Cell R印.26，989_999 ；公众可从北京农学院获得。)BgLII 和 Bst EII识别位点间获得重组载体，将重组载体转化大肠杆菌DH5 α，经过抗生素筛选后得到 重组菌，提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，鉴定结果表明，酶切后产生1.5kb左右的条 带和IOkb左右的载体条带，且PCR的电泳结果也出现1.5kb左右的条带，将该质粒命名 为pBSUGT72B14。将pBSUGT72B14进一步测序验证，结果为该质粒为在pBRin713载体的 BgLII和Bst EII识别位点间插入序列表中序列1自5’末端第53位到第1474位核苷酸， 即UGT72B14的ORF序列，构建成含有UGT72B14完整读码框架的高效植物双元表达载体 PBSUGT72B14。通过冻融法将pBSUGT72B14转化到发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) ATCC15834(刘本叶、叶和春、李国凤、贾燕涛、麻密、陈建林、张艳萍；发根农杆菌转化青蒿 影响因素的研究；应用与环境生物学报；1998，4(4) 349-353 ；American Tissue Culture Collection简称ATCC ；公众可从北京农学院获得。)感受态细胞中，获得重组菌ATCC15834/ PBSUGT72B14，将重组菌提取质粒后经过酶切鉴定，获得酶切后产生1.5kb左右的条带和 9. 5kb左右的条带的重组菌为阳性重组菌ATCC15834/pBSUGT72B14。2、转UGT72B14高山红景天发根的获得将上述获得的阳性重组菌ATCC15834/pBSUGT72B14接种在固体培养基(YEB)上 划线培养，于27°C下活化3次，挑取平板上单菌落，接种在50ml YEB液体培养基，于27°C、 120rpm\min,黑暗下震荡培养，继代3次，培养阳性重组菌ATCC15834/pBSUGT72B14的OD6tltl M 0. δ,Μ ΙΙ^ (Rhodiola sachalinensis A. Bor ；Ma, L. Q. ，Liu, B. Y. ，Gao, D. Y. ， Pang, Χ. B. ， Lu, S. Y. ， Yu, H. S. ， Wang, H. ， Yan, F. , Li, Z. Q. , Li, Y. F. ， Ye, H. C.， 2007. Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis. Plant Cell Rep. 26, 989-999 ；公众可从北京农学院获得。)叶盘，侵染时间为15分钟。先将高山红景天的无菌苗叶片切成0. 5X0. 5cm的小块，叶面向下接在预培养培 养基上，25°C暗培养2d (表2，图8)，再用上述获得的0D_为0. 5的阳性重组菌ATCCl5834/ PBSUGT72B140侵染预培养培养基上高山红景天的叶盘，将阳性重组菌ATCC 15834/ PBSUGT72B140侵染过的高山红景天叶盘置于共培养基上培养2d(表2，图8)，转移到只含 有抑制农杆菌生长抗生素(羧苄青霉素Car，250mg/L;头孢霉素Cef，250mg/L)的培养基 上，25°C继续培养(暗培养)25天进行脱菌，将长度为l-2cm左右的发根剪下在继代培养基 上培养20d(25°C，暗培养)后，转接到含有25mg/L潮霉素Hyg、250mg/L羧苄青霉素Car和 250mg/L头孢霉素Cef的筛选培养基上培养30d，培养温度为22°C，光照强度为12001x(图 8)，筛选得到转UGT72B14高山红景天发根(图8 =A 侵染前的预培养；B 侵染过农杆菌的高 山红景天叶盘进行共培养基；C 高山红景天发根及利用抗生素抑菌和筛选过程；D 发根摇
9瓶培养)。 表2高山红景天农杆菌介导转化用培养基
预培养培养 MS+6-BA 0. 2 mg/L+ZT 0. 2 mg/L
基:
共培养培养
抑菌培养基:
继代培养基 筛选培养基 扩培培养基
MS+6-BA (6-苄氨基嘌呤)0. 2 mg/L+ZT (玉米素) 基0.2 mg/L +AS (乙酰丁香酮)25 mg/L
MS+AS (乙酰丁香酮)25 mg/L + Car 250mg/L+ Cef 250mg/L
MS+ Car 250mg/L +Cef 250mg/L MS+Hyg 25mg/L+ Car 250mg/L+ Cef 250mg/L 1/2MS0_每1000ml所述共培养所用的培养基按照如下方法配置700mlMS液体培养基中加 入0. 2ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 2ml玉米素母液、1. 25ml乙酰丁香酮母液后，蒸馏水定容至 1000ml，得到所述共培养用的培养基；每IOOOml所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配置700mlMS液体培养基中 加入1. 25ml乙酰丁香酮母液、2. 5ml羧苄青霉素母液、2. 5ml头孢霉素母液后，蒸馏水定容 至1000ml，得到所述抑菌培养所用的培养基；每IOOOml所述筛选培养所用的培养基按照如下方法配置700mlMS液体培养基 中加入0. 25ml潮霉素母液、2. 5ml羧苄青霉素母液、2. 5ml头孢霉素母液后，蒸馏水定容至 1000ml，得到所述筛选培养所用的培养基；每IOOOml所述继代培养所用的培养基按照如下方法配置700mlMS液体培养基中 加入2. 5ml羧苄青霉素母液、2. 5ml头孢霉素母液后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述继代
培养所用的培养基；所述6-苄氨基嘌呤母液按照如下方法配置称取50mg 6_苄氨基嘌呤用IOmllM 的NaOH水溶液溶解，加水定容到50ml，得到所述6-苄氨基嘌呤母液；所述玉米素母液按照如下方法配置称取2mg玉米素用Iml IM NaOH水溶液溶解 后加水定容到2ml，得到所述玉米素母液；所述乙酰丁香酮母液按照如下方法配置称取200mg乙酰丁香酮用3ml甲醇溶解 后加二甲基亚砜定容到10ml，得到所述乙酰丁香酮母液；所述羧苄青霉素母液按照如下方法配置称取500mg羧苄青霉素溶解在水中后， 加水定容到10ml，得到所述羧苄青霉素母液；所述头孢霉素母液按照如下方法配置称取IOOOmg头孢霉素溶解在水中后，加水 定容到10ml，得到所述头孢霉素母液；所述潮霉素母液按照如下方法配置称取IOOOmg潮霉素溶解在水中后，加水定容 到10ml，得到所述潮霉素母液。所述MS培养基的组成及配制方法如下
表3为MS培养基母液 表4为MS培养基配制方法(1000ml) 配制方法大量筒中先放置200ml左右的蒸馏水，将上述母液称量后加入大量筒 中，再加入400—500ml蒸馏水，加入30克蔗糖溶解后定容到1000ml，倒入三角瓶中。用PH 计测PH值到5. 80—5. 85。加入7—7. 5g琼脂后融化倒瓶灭菌。3、提取红景天甙将筛选得到的粗壮、多分枝转UGT72B14高山红景天发根转入液体1/2M&培养基 摇瓶进行扩培培养，每25d继代一次，经过75d，得到扩培的转UGT72B14高山红景天发根，扩 培培养条件为温度22°C、振荡速度为120rpm，旋转半径为13mm ；所述扩培培养所用的培养基(1/2MSJ，与上述MS培养基的制备方法基本相同，唯 一不同的是将MS培养基中的大量、微量、钙盐、铁盐、有机I和有机II的浓度均减半。4、转UGT72B14高山红景天发根的分子鉴定以上述筛选得到的粗壮、多分枝转UGT72B14高山红景天发根为材料，提取基因组 DNA为模板，进行PCR检测。为了避免内源基因的干扰，PCR引物之一为目标基因的3’引物 (pUGTRdown)，另一个引物为对应于CaMV 35S启动子上游的一段核苷酸序列(35S-UP) (5’ -TGATATCTCCACTGACGTAAGGGATG-3，)，该引物在野生型高山红景天基因组上没有互补序列。 图9A为转化pCAUGT72B14的部分转基因发根的PCR检测结果。结果显示从转基因发根中 扩增得到的DNA片断为1. 6Kb左右(包含部分载体序列)，阴性对照(野生型高山红景天) 没有扩增产物。在检测的25个发根系中阳性结果为16个转UGT72B14高山红景天发根，说 明转基因的发根阳性率比较高。为了进一步验证该结果，将PCR产物经Southern吸印转至尼龙膜上，以 Digoxigenin标记的UGT72B14 cDNA为探针(UGT72B14的ORF序列，序列表中序列1的自 5’末端第53-1474位核苷酸。)对部分的PCR鉴定的阳性转UGT72B14高山红景天发根 进行PCR-Southern检测，结果如图9B，扩增产物均与探针产生杂交信号。这一结果表明 UGT72B14的cDNA确已整合到高山红景天转基因发根的基因组DNA中。采用同样的方法将空载体pBRin713载体也转入高山红景天中，获得转pBRin713 高山红景天发根。采用同样的方法将pCAMBIA1301-UGT72B14导入高山红景天中，获得转 PCAMBIA1301-UGT72B14高山红景天发根。pCAMBIA1301^ (Ge Y, Cheng X, Hopkins A, Wang ZY. Generation of transgenic Lolium temulentum plants by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Rep. 200726(6) :783_789，公众可从北京农学院获得。)记载。pCAMBIA1301-UGT72B14的构建方法与pBSUGT72B14基本相同，为将序列表中序列 1自5’末端第53位到第1474位核苷酸插入pCAMBIA1301载体的BgLII和Bst EII识别位 点间得到。实施例3、转UGT72B14高山红景天发根的红景天甙的HPLC检测为进一步对UGT72B14功能进行分析，对由实施例2获得的转UGT72B14高山红景天发根进行了 HPLC测定，具体方法如下从由实施例2的3步骤获得的所述发酵产物中提取红景天甙，具体提取方法如下 将扩培后的高山红景天发根于烘箱中60°C烘至恒重，粉碎后过80目网筛，精确称取0. 8g样 品加入甲醇8ml，超声作用30min (超声功率100w、时间30min)，之后于60°C孵育30min，于 250C IlOOOg离心15min，收集上清液；沉淀用50%的甲醇水溶液再提取一次，将上清液合并 后,过0. 45 μ m滤膜。取过滤后的溶液进行HPLC检测，检测条件为色谱柱=Hypersyl ODS柱，5mm，
4.6X 150mm ；流动相水-甲醇-乙腈(70 25 5，ν/ν/ν)；流速0. 8ml/min ；检测波长 275nm,带宽10nm，参比波长400nm，带宽80nm ；外标法定量。红景天甙标准品(上海同田生物技术有限公司，Catalog E-0069)，保留时间为
5.85分钟。HPLC检测的野生型对照发根中的红景天甙的保留时间为5. 85分钟，转UGT72B14 高山红景天发根中的红景天甙的保留时间为5. 85分钟。以野生型对照(高山红景天的发根)、由实施例2获得的转pBRin713高山红景天 发根和由实施例2获得的转pCAMBIA1301-UGT72B14高山红景天发根为对照。实验重复三 次，结果取平均值。其中转UGT72B14高山红景天发根、野生型对照及转pBRin713高山红景 天发根各检测10个。发根中的红景天甙含量测定结果的数据分析见图10。结果如图10(A，阴性对 照；B，空载体转化对照；C，UGT72B14转化系)所示，结果表明野生型对照发根组织(阴 性对照)中的红景天甙含量为3.81mg/g DW，转pBRin713高山红景天发根(空载体转化 对照)中的红景天甙含量为5. 72mg/g DW，转UGT72B14高山红景天发根(UGT72B14转化 系)中的红景天甙含量为19. 81mg/g Dff (干重)，较其野生型对照提高4. 2倍(图10)；而 转PCAMBIA1301-UGT72B14高山红景天发根中的红景天苷含量为7. 47mg/g DW，远低于转 UGT72B14高山红景天发根(使用pBRin713载体)。本发明为利用高山红景天转基因毛状根系统过表达红景天甙生物合成途径关键 酶-UGT72B14提供了具有创新性和实用性的相关技术方法及应用。
权利要求
一种制备红景天甙的方法，包括如下步骤1)将UGT72B14蛋白的编码基因导入目的植物的外植体，得到转基因的毛状根；2)从所述转基因的毛状根中提取红景天甙，得到红景天甙；所述UGT72B14蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述UGT72B14蛋白的编码基因通过重组发根农杆菌介导导入目的植物的外植体； 所述UGT72B14蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重组发根农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主发根农杆菌得到的重组发 根农杆菌；所述重组植物表达载体为将所述UGT72B14蛋白的编码基因插入载体pBRin713的多克 隆位点间得到的。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于将所述UGT72B14蛋白的编码基 因导入目的植物的外植体，得到转基因的毛状根的方法包括如下步骤用重组发根农杆菌 侵染所述目的植物的外植体，再依次进行共培养、抑菌培养，得到带有毛状根的外植体；取 所述带有毛状根的外植体中的毛状根，将其进行筛选培养，得到所述转基因的毛状根。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述将UGT72B14蛋白的编码基 因导入目的植物的外植体，得到转基因的毛状根的方法中，在所述取所述带有毛状根的外 植体中的毛状根后，在所述筛选培养前，包括将所述毛状根进行继代培养的步骤；所述用重组发根农杆菌侵染所述目的植物的外植体的时间为15分钟。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述外植体为叶盘。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述共培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、玉米 素和乙酰丁香酮，得到所述共培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所述共培养所用的 培养基中的浓度为0. 2mg/L，所述玉米素在所述共培养所用的培养基中的浓度为0. 2mg/L, 所述乙酰丁香酮在所述共培养所用的培养基中的浓度为25mg/L ；所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加乙酰丁香酮、羧苄 青霉素和头孢霉素，得到所述抑菌培养所用的培养基，所述乙酰丁香酮在所述抑菌培养所 用的培养基中的浓度为25mg/L，所述羧苄青霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为 250mg/L,所述头孢霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为250mg/L ；；所述筛选培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加头孢霉素、羧苄 青霉素和潮霉素，得到所述筛选培养所用的培养基，所述头孢霉素在所述筛选培养所用的 培养基中的浓度为250mg/L，所述羧苄青霉素在所述筛选培养所用的培养基中的浓度为 250mg/L，所述潮霉素在所述筛选培养所用的培养基中的浓度为25mg/L ；所述继代培养的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加头孢霉素和羧苄青 霉素，得到所述继代培养的培养基，所述头孢霉素在所述继代培养的培养基中的浓度为 250mg/L，所述羧苄青霉素在所述继代培养的培养基中的浓度为250mg/L ；所述共培养的时间为2天，所述共培养的温度为25°C，所述共培养为暗培养； 所述抑菌培养的时间为25天，所述抑菌培养温度为25°C，所述抑菌培养为暗培养； 所述筛选培养的时间为30天，所述筛选培养温度为22°C，所述筛选培养为光照培养，光照强度为12001x ；所述继代培养的时间为20天，所述继代培养的温度为25°C，所述继代培养为暗培养。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述UGT72B14蛋白的编码基因 为序列表中的序列1的自5’末端第53位到第1474位核苷酸。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于在所述制备红景天甙的方法中，在所述步骤2)前还包括如下步骤扩培培养所述转基 因的毛状根，得到扩培的转基因的毛状根；所述扩培培养使用的培养基为1/2M&培养基；所述扩培培养的温度为22°C、所述扩培 培养的振荡速度为120rpm，旋转半径为13mm，所述扩培培养的时间为75天，且每25天继代一次。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或者 单子叶植物，所述双子叶植物优选为景天科植物，所述景天科植物优选为红景天属植物，所 述红景天属植物尤其优选为高山红景天。
全文摘要
本发明公开了一种利用UGT72B14制备红景天甙的方法，包括如下步骤1)将UGT72B14蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物的毛状根；2)从所述转基因植物的毛状根中提取红景天甙，得到红景天甙；所述UGT72B14蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述UGT72B14蛋白的编码基因是通过重组植物表达载体导入所述目的植物的；所述重组植物表达载体为将所述UGT72B14蛋白的编码基因插入载体pBRin713的多克隆位点间得到的。本发明为利用高山红景天转基因毛状根系统过表达红景天甙生物合成途径关键酶-UGT72B14提供了具有创新性和实用性的相关技术方法及应用。
文档编号A01H4/00GK101914120SQ20101026196
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月24日 优先权日2010年8月24日
发明者于寒松, 师光禄, 张继星, 王有年, 马兰青 申请人:北京农学院