专利名称：一种微通气椴木栽培樟芝的方法
技术领域：
本发明涉及一种樟芝的培养方法，特别是涉及一种樟芝的微透气椴木栽培方法， 从而大量生产樟芝子实体。
背景技术：
牛樟芝简称“樟芝”，学名为Antrodia Camphorata,属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌 科薄孔菌属，俗名牛樟菇、红樟芝、樟内菇、樟菇等，是台湾特有的真菌，仅生长于台湾特有 的牛樟树(Cinnamomum kanehira)上，是牛樟树上发现的唯一一种腐木菌。樟芝一般生长 在心材已腐朽的老树干的中空内壁，也有少部分生长在树干倒伏的牛樟木材阴暗潮湿的表 面。不会生长在一般的樟树、白樟等类似树种上(陈体强，李开本，林章余.台湾食(药) 用菌发展现状[J]福建农业科技，2000，(1) :20-21.)。牛樟树是一种常绿阔叶高大乔木，生 长在海拔450-2000m的山区，主要分布在桃园复兴乡、角板山；苗栗南庄乡、三湾乡；南投竹 山镇、水里乡；高雄六龟，是我国台湾省特有的保育类树种，由林务处或林管局依法保管，窃 盗牛樟树者将因涉嫌违反森林保育法而移送法办。樟芝因其疗效特殊神奇，在民间有“阴阳对口菇”之称，台湾民间称之为“森林中 的红宝石”。近年来的研究不但证实樟芝完全没有副作用，且能活化细胞、改善体质、保护肝 脏、增强免疫，摆脱现代人经常罹患的文明病。樟芝中含有多种生理活性成分，如多糖、三萜 类化合物、超氧歧化酶(SOD)腺苷、蛋白质(含免疫蛋白)、多种维生素、微量元素(钙、磷、 楮)、核酸、凝集素、氨基酸、胆固醇、木质素、血压稳定物质等。根据台北医药大学一项“人 工栽培红樟芝子实体最新研究成果”显示，当人工栽培红樟芝子实体的浓度达到1500ug/mL 时，癌细胞的逆转效果几乎可以达到100%的有效率W]。樟芝被视为独特而珍贵的药用真 菌，因此具有极高的研究和商业价值，也是目前台湾最昂贵的野生真菌，在港澳被称为“神 芝”。近年樟芝子实体的神奇疗效渐为人知，需求殷切，虽已分区展开复育工作，仍然缓 不济急，天然樟芝价格每600克高达数十万新台币，被誉为全世界最昂贵的真菌药材。而樟 芝人工栽培也成为了一个研究的热点。由于樟芝的寄生树种——樟树资源缺乏以及特殊的 生长环境等因素，樟芝很难进行人工栽培。目前关于樟芝的研究大多围绕其液态发酵，而樟 芝的人工栽培技术鲜有报道。目前在台湾，对于樟芝人工培育大致可以分为液体发酵法、固 体培养法、椴木栽培法三种。液体发酵法即通过樟芝液体发酵得到菌丝体，约15天可以培养完成，速度快且成 本低廉，但是培养出的菌丝体与樟芝子实体药效差异很大。固体栽培法即为太空包栽培法，大约三月培养完成，将樟芝菌块植入太空包栽培 法，速度较快且不易污染。发明名称”樟芝的培养方法”(ZL200610162766. 5)涉及将樟芝接种于椴木中栽培 得到子实体，该发明中提到樟芝中的有效物主要是三萜类和多糖体，但该发明的方法是采 用固体培养基扩翻菌种，再在椴木上进行子实体的栽培，而且只对人工栽培的樟芝与野生樟芝中三萜类含量进行了比较，而对樟芝中同样具有药用功效且含量较高的多糖体没有涉 及。由于樟芝子实体的特效且难于培养，造成樟芝奇物可居，因此有必要丰富樟芝子 实体栽培的方法，为市场提供价廉物美的樟芝。
发明内容
本发明采用的微透气椴木栽培方法，严格控制栽培条件，比如光照、温度、湿度、 通风等，成功的实现了樟芝的人工栽培，生长周期11个月，生物转化率达到15%，其多糖含 量与野生樟芝的含量相当，且椴木栽培的樟芝，无论外观、香气、苦味、药效等都与野生樟芝一致。一种微通气椴木栽培樟芝的方法，包括如下步骤(1)樟芝经液体发酵制得液体菌种，( 樟木段处理将樟木段浸泡于水中浸泡， 使其水含量为50% -70%，再将其放入以海绵硅胶塞封口的容器中，灭菌，( 接种后盖上 海绵硅胶塞，(4)培养A)于温度25°C 48°C，湿度85% -95%，避光处培养至樟木表面长满 菌丝体；B)再将其置于日间温度为25°C 48°C，夜间温度18°C _20°C，日夜温差约为8°C，湿 度85% -95%，C02浓度1.0% -1. 5%，微光培养出子实体，所述微光培养，日间光照强度为 50-150Lux，夜间光照强度为 0. 001-0. 02Lux。所述步骤A培养时间为5-6个月，步骤B)培养时间为3-4个月。所述樟木段处理还包括在樟木段的切面和/或侧面沿垂直方向打孔。所述孔分布为梅花状，孔深5-lOcm。所述灭菌为121°C，90分钟，再自然冷却至室温。所述容器为聚丙烯菌袋。所述步骤(3)中的接种是将液体菌种沿樟木段的每个面流下后再将樟木置于液 体菌种中。所述湿度是通过不断补加水来控制。所述液体菌种的制作包括如下步骤a)菌种活化将冷藏保存的樟芝块接入母种培养基于恒温避光斜面培养 7-10 天;b) 一级种子液将a)培养得到的樟芝菌种接入有液体发酵培养基的容器中，摇床 180rpm/min, 28°C培养 7-12 天；c) 二级种子液无污染的一级种子液接种于有液体发酵培养基的容器中，摇床 180rpm/minJ8°C培养7_12天即得到液体菌种，所述母种培养基为葡萄糖2%、香蕉粉0. 5%、酵母膏0. 5%、蛋白胨0. 5%,MgS04 0. 3%,KH2P04 0. 3%、柠檬酸0. 05%, (NH4) 2S04 0. 05%、琼脂 2%、樟木浸液、pH4. 5 ；所述 液体发酵培养基为葡萄糖2%、香蕉粉0. 5%、酵母膏0. 5%、蛋白胨0. 5%,MgS04 0.3%, KH2P04 0. 3%、柠檬酸 0. 05%、(NH4) 2S04 0. 05%、樟木浸液、pH4. 5。所述二级种子液的培养时接种量为10%。本发明通过对樟木的处理，采用液体发酵扩繁得到液体菌种接种于樟木的表面， 采用微透气的方式，并通过控制培养温度，湿度，光照等条件进行培养，并采用微透气方式，4既保证透气性又有效的防止了杂菌污染，栽培得到了樟芝子实体。樟芝的液体发酵法已是常规的技术，且研究的最多，在本发明中，可采用常规的方 法，也可采用本发明的液体发酵方案。本发明的发酵液中添加有樟木浸液，从而使得液体发 酵的环境与自然生长的环境有些类似，也从而使得本发明的发酵得到的菌种菌丝其多糖含量较高。香樟学名Cinnamomum camphora(L. )Presl.科别樟科,别名木樟、乌樟、芳樟、 番樟、香蕊、樟木子，本发明采用的是樟木来自于湖北孝感的芳樟，它是樟科(Lauracae)樟 属(Cinnamomum Schaeffer) t章积 (Cinnamomum camphora(Linn.)Presl var. Iinaloolif ear Fujita)中的一种类型。在樟木段上打孔(梅花打孔法)有利于菌丝在樟木中的生长，缩短发菌时间，提高 透气性。本发明根据台湾野生樟芝的生活环境，选定樟芝人工栽培的温度、栽培方式以及 对栽培原料的处理方法，利用本实验室珍藏的樟芝菌株，采用梅花打孔法以及浸泡法对主 要栽培材料樟木进行处理并在樟芝菌丝体以及子实体生长期间模仿野生樟芝的生活环境 进行控制和管理，比如微光、高温加温差、高湿(多次补水法)、微通风等，成功的进行了樟 芝的人工栽培，生长周期约11个月，比有关报道的人工栽培樟芝子实体的生长周期2-3年 明显缩短，为樟芝子实体的药理研究奠定了基础。
图1子实体生长初期图2老熟后的子实体图3菌丝生长曲线图4胞内外粗多糖含量图5总糖测定标准曲线图6还原糖测定标准曲线图7 樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠LPS刺激下腹腔巨噬细胞NO生成的影响图8 樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠巨噬细胞吞噬中性红的作用的影响图9樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠NK的杀伤力的影响图10樟芝栽培子实体多糖对S180小鼠ConA刺激下的脾淋巴细胞增殖的影响图11樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠LPS刺激下腹腔巨噬细胞NO生成的影响图12樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠巨噬细胞吞噬中性红的作用的影响图13樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠NK的杀伤力的影响图14樟芝栽培子实体多糖对H22小鼠ConA刺激下的脾淋巴细胞增殖的影响其中图上标注:*P< 0. 05，**P < 0. 0具体实施例方式实施例1材料和方法1. 1 材料
1. 1. 1供试菌株樟芝(Antrodia Camphorata)青岛农业大学应用真菌省级重点 实验室珍藏，可对外公开发放。本实验不仅限于本菌株，同样可适用于其它菌株。1. 1.2母种培养基葡萄糖2%、香蕉粉0. 5%、酵母膏0. 5%、蛋白胨0. 5%、MgS04 0. 3%,KH2P04 0. 3%、柠檬酸 0. 05%、(NH4)2S04 0. 05%、琼脂 2%、樟木浸液、pH4. 51. 1. 3液体发酵培养基葡萄糖2%、香蕉粉0. 5%、酵母膏0. 5%、蛋白胨0. 5%, MgS04 0. 3%, KH2P04 0. 3%、柠檬酸 0. 05%、(NH4) 2S04 0. 05%、樟木浸液、ρΗ4· 5 樟木浸 液的制备取樟木碎屑500g，加入水5000mL，蒸煮直至浓缩为原体积的1/10，所得液体即为 樟木浸液，用量为每IOOmL液体发酵培养基加入50mL樟木浸液。1.2菌种活化挑取冷藏保存的樟芝菌块接入母种斜面培养基中，用棉塞封口，保证良好的透气 性。置于恒温避光培养约7-10天，用于后续试验。1. 3制备液体菌种一级种子液挑取用母种培养基培养好的樟芝接入三角瓶中，摇床ISOrpm/min， 培养7天。二级种子液显微镜镜检及平板划线确定一级种子液无污染后用于制作二级种子 液。每个250mL的三角瓶装液量为IOOmL,接种量为10mL。摇床180rpm/min，液体发酵 9天后，用于后续试验。1. 4樟芝栽培材料的预处理野生樟芝多生长于牛樟树干腐朽的中空内部或倒伏树干的潮湿表面。根据野生樟 芝的生长环境本实验采取微光、高温加温差、高湿(多次补水法)、微通风、樟木椴木栽培樟 芝。栽培原料樟木来自于湖北孝感的芳樟，它是樟科(Lauracae)樟属(Cirmamomum Schaeffer)樟树(Cinnamomum camphora(Linn.)Presl var. Iinaloolif ear Fujita)中的一种类型.对樟芝栽培原料——樟木进行预处理。将樟木锯成长约20cm的木桩，并在木桩的 上下切面以及侧面沿垂直方向做梅花状打孔，孔深约5-lOcm。梅花打孔法有利于菌丝在樟 木中的生长，缩短发菌时间，提高透气性。将打好孔的樟木在水中完全浸没浸泡2-3天，将 多余水分晾干(樟木的含水量控制在50% -70%之间)，装入聚丙烯菌袋中，根据樟木木段 粗细每个菌袋约装1-2根木段。用18-23mm的海绵硅胶塞封口，用绳扎紧，既保证透气性又 有效的防止了杂菌污染。121°C，灭菌90min，要求灭菌锅自然降到室温后再打开，已达到充 分灭菌的效果。1.5接种、装袋在超净工作台中将液体发酵种子液充分混勻，以保证种子液质量的一致性。待菌 袋冷却后，打开菌袋，每袋接入200mL樟芝液体发酵种子液，保证种子液沿木段的每个面流 下，用18-23mm的海绵硅胶塞封口，用绳扎紧，既保证透气性又有效的防止了杂菌污染。1. 6菌丝体生长期及出菇期的管理。将接种完毕的菌袋置于温度25°C -28°C的避光处培养，菌丝体生长期约6个月，在 这个过程中采用多次补水法保持高湿环境，即视季节而定中间补水5-7次，每次补无菌水 200-300mL，保证樟芝生长过程中的湿度在85% -95%之间。约6个月之后，待菌丝体长满木段之后，将其置于日间温度为25V 48°C，夜间温度18°C -20日夜温差约为8°C的环 境下继续培养，等待出菇，子实体生长较为缓慢，此时间长约3-4个月。出菇期间仍然要保 证樟芝生长环境的湿度以及通风，C02浓度1. 0% -1. 5%，采用微光培养，日间光照强度为 50-150Lux，夜间光照强度为 0. 001-0. 02Lux。2.结果与分析本方法栽培出的樟芝子实体紧贴着生于木材表面，木栓质至木质，质地极其坚硬、 边缘平而顿，具有浓郁的樟香味、无柄、外型为板状。子实体表面菌孔较大、多且密集。子实 体生长极为缓慢，子实体生长初期表面鲜艳为深红色(图1)，老熟后颜色呈黄褐色(图2)。 生物转化率约为15%。实验例多糖含量的检测1.樟芝液体发酵过程中菌丝的生长及胞内外粗多糖含量的测定1. 1樟芝液体发酵过程中菌丝体生长曲线二级种子液接种后每24h测定一次樟芝液体发酵液种多糖的含量及菌球干重并 记录数据。以此寻找菌丝干重和多糖含量间的关系，同时确定最佳发酵时间(如图3)。1. 2樟芝发酵过程中胞外(发酵液)粗多糖的提取将发酵液用八层纱布过滤收集上清液，90°C加热浓缩至原液的1/5，然后5000rpm 离心5min，收集上清液，加入3倍体积的95%的酒精，4°C沉淀12h，有絮状沉淀析出，沉淀物 分别用无水乙醉、丙酮、乙醚洗涤数次后，真空抽干，然后，放置五氧化二磷干燥器，进一步 干燥，得到胞外粗多糖干品，即为胞外粗多糖。1. 3樟芝液体发酵液中胞内(菌球)粗多糖的提取将发酵液用八层纱布过滤收集菌丝体，置于60°C烘干，取干燥的菌丝用研钵磨碎， 按Ig菌丝50mL水的比例，将菌丝放入90°C热水中浸提2h，过滤出浸提液，再向沉淀中加入 新水再浸提池，然后合并浸提液，90°C加热浓缩至原液的1/5，此后步骤同胞外多糖，由此 可得胞内粗多糖。胞内外粗多糖含量见如图4。如图1，随着发酵时间的延长，樟芝菌丝生物量的变化趋势，从第4d到第8d生长较 快，生物量达到最大值，第8d到第IOd菌丝量较稳定，第Ild开始生物量下降比较明显。结合图1和图2可以发现胞内粗多糖的多少和菌丝体产量有着直接的关系，随着 菌丝体重量的变化而变化，到8d以后随着菌丝体的减少也相应的减少，但减少的要更快一 些，主要是因为菌丝的自溶，有部分的多糖溶到了发酵液中去；而胞外多糖的多少也与菌丝 的产量有着密切的联系。微生物在生长时，能分泌一种酶到细胞外，可以把单糖和多糖连接 起来制造葡聚糖，组成自己的细胞壁，这可能是菌丝体生长旺盛时期胞外多糖迅速增加的 原因。8d以后虽然菌丝体的重量有所下降，但胞外多糖依然是增加的，主要是因为菌丝体内 多糖的溶出，但这以后的增幅有限，而且不久开始下降，以此可以得出结论樟芝菌丝产量 的大小可以反映多糖产量的高低，以后的培养实验可以用菌丝产量的多少来评估多糖的产 量；为获取较高的菌丝及多糖产量，樟芝的液体发酵(二级种子)培养以8-9d为宜。2.樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中多糖含量测定2. 1樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中多糖的提取樟芝发酵液中粗多糖及菌丝体中粗多糖的提取方法如1.2及1.3，将提取出的 粗多糖烘干，加水溶解，离心取上清后用于多糖含量的测定；樟芝栽培子实体按Ig子实体50mL水的比例，放入90°C热水中浸提2h，离心取上清直接用于多糖含量的测定。2. 2樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中多糖含量的测定
2. 2. 1蒽酮-硫酸比色法测定樟芝栽培子实体、菌丝体及发酵液中的总糖含量(1)原理强酸可使糖类脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，生成物与蒽酮脱水缩合，形 成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在620nm处有最大吸收。(2)试剂①葡萄糖标准液100 μ g/mL准确称取80°C烘至恒重的分析纯葡萄糖lOOmg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶 解后，定容至IL备用。②蒽酮0. 2g蒽酮溶于IOOmL浓硫酸中配制而成，现配现用(3)葡萄糖标准曲线的制作取6支试管，按照表1加入试剂
权利要求
1.一种微通气椴木栽培樟芝的方法，包括如下步骤(1)樟芝经液体发酵制得液体菌种，( 樟木段处理将樟木段浸泡于水中浸泡，使其 水含量为50%-70%，再将其放入以海绵硅胶塞封口的容器中，灭菌，( 接种后盖上海绵 硅胶塞，(4)培养A)于温度25 V 48°C，湿度85% -95 %，避光处培养至樟木表面长满菌 丝体；B)再将其置于日间温度为25V 48°C，夜间温度18°C -20日夜温差约为8°C，湿 度85% -95%，C02浓度1.0% -1. 5%，微光培养出子实体，所述微光培养，日间光照强度为 50-150Lux，夜间光照强度为 0. 001-0. 02Lux。
2.根据权利要求1所述的培养方法，所述步骤Α)培养时间为5-6个月，步骤B)培养时 间为3-4个月。
3.根据权利要求1所述的培养方法，所述樟木段处理还包括在樟木段的切面和/或侧 面沿垂直方向打孔。
4.根据权利要求3所述的培养方法，所述孔分布为梅花状，孔深5-lOcm。
5.根据权利要求1所述的培养方法，所述灭菌为121°C，90分钟，再自然冷却至室温。
6.根据权利要求1所述的培养方法，所述容器为聚丙烯菌袋。
7.根据权利要求1所述的培养方法，所述步骤(3)中的接种是将液体菌种沿樟木段的 每个面流下后再将樟木置于液体菌种中。
8.根据权利要求1所述的培养方法，所述湿度是通过不断补加水来控制。
9.根据权利要求1所述的培养方法，所述液体菌种的制备包括如下步骤a)菌种活化将冷藏保存的樟芝块接入母种培养基于恒温避光斜面培养7-10天；b)一级种子液将a)培养得到的樟芝菌种接入有液体发酵培养基的容器中，摇床 180rpm/min, 28°C培养 7-12 天；c)二级种子液无污染的一级种子液接种于有液体发酵培养基的容器中，摇床 180rpm/minJ8°C培养7_12天即得到液体菌种，所述母种培养基为葡萄糖2 %、香蕉粉0.5%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.5%、MgS04 0. 3%,KH2P04 0. 3%、柠檬酸 0. 05%, (NH4) 2S04 0. 05%、琼脂 2%、樟木浸液、pH4. 5 ；所述 液体发酵培养基为葡萄糖2%、香蕉粉0. 5%、酵母膏0. 5%、蛋白胨0. 5%,MgS04 0.3%, KH2P04 0. 3%、柠檬酸 0. 05%、(NH4) 2S04 0. 05%、樟木浸液、pH4. 5。
10.根据权利要求9所述的培养方法，所述二级种子液的培养时接种量为10%。
全文摘要
本发明涉及“一种微通气椴木栽培樟芝的方法”，属于菌类栽培领域，其特征在于将液体菌种接种于水含量为50％-70％樟木段上，微透气培养，于温度25℃-28℃，湿度85％-95％，培养出子实体。本发明通过对樟木的处理，采用液体发酵扩繁得到液体菌种接种于樟木的表面，采用微透气的方式，并通过控制培养温度，湿度，光照等条件进行培养，生长周期11个月，生物转化率达到15％，其多糖含量与野生樟芝的含量相当，且椴木栽培的樟芝，无论外观、香气、苦味、药效等都与野生樟芝一致。
文档编号A01G1/04GK102047814SQ20101051894
公开日2011年5月11日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者宁丽, 王胜蕊, 贾培培, 郭奇林, 郭立忠 申请人:青岛农业大学