专利名称：一种丁香杀线虫提取物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种丁香杀线虫提取物及其制备方法。
背景技术：
根结线虫(Meloidogyne spp.)为植物根系专性寄生物，是当前影响农业生产的一类重要病原物。从20世纪80年代开始，利用植物提取液防治线虫的研究逐渐引起人们的重视，至今已报道的杀线虫植物约有102科2 属316种，其中研究较多的有菊科、楝科、豆科、十字花科、茄科、禾本科、大戟科、罂粟科、夹竹桃科、含羞草科、百合科等，但自然界植物资源极为丰富，许多具有杀线虫作用的植物还未被发现，《中国有毒植物》一书列入有毒植物1300 多种，其中，许多种类都具有杀虫活性。很多植物都可以就地取材，应用方便，效果明显，因此，目前国内对杀线虫植物资源的筛选及毒杀活性测定等方面有较多研究，充分调查和挖掘出更多更有效的新杀线虫植物种类将成为未来发展的方向。丁香为桃金娘科植物丁香(Eugenia caryophyllata)的干燥花蕾。当花蕾由绿色转红时采摘，晒干入药。花蕾含挥发油即丁香油，主要包括丁香油酚(Eugen0l)、B-石竹烯 (B-Caryophyllene)、乙酰丁香油酚，以及甲基正戊基酮、水杨酸甲酯、苯甲醛、苄醇、间甲氧基苯甲醛、乙酸苄酯和胡椒酚(Chavicol)等。其活性物质在人类医学上的应用较多，具有抗真菌和细菌、驱虫，止痛等作用。在农业生产上相关报道很少，只有少量用于杀螨的报道， 未见丁香无水乙醇提取物用于植物根结线虫病防治的相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备丁香无水乙醇提取物的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)将丁香与无水乙醇混勻，得到混合物；2)将步骤1)得到的混合物进行超声处理，即得到丁香无水乙醇提取物。所述丁香为丁香花蕾。步骤1)中，所述丁香与无水乙醇的配比为IOg (45-55)ml ；步骤2)中，所述超声的功率为300W-500W，所述超声的工作频率*^KHz-100KHz， 所述超声的时间为25min-35min ；所述超声的温度为23°C 48°C。步骤1)中，所述丁香与无水乙醇的配比为IOg (45,50或55)ml ；步骤2)中，所述超声的功率为300W、400W或500W，所述超声的工作频率为观1(泡、 45KHz或IOOKHz，所述超声的时间为25min、30min或35min ；所述超声的温度为23°C、25°C 或 28°C。在步骤1)前，还包括将所述丁香粉碎至35目-45目大小的步骤；所述丁香粉碎至具体为35目、40目或45目大小；在步骤2、后，还包括如下步骤将所述超声处理得到的超声产物依次经抽滤、滤液浓缩至膏状，得到丁香无水乙醇提取物。由所述的方法制备的丁香无水乙醇提取物也是本发明保护的范围。所述的丁香无水乙醇提取物在杀线虫和/或防线虫中的应用也是本发明保护的范围。所述的丁香无水乙醇提取物在制备线虫的生防制剂中的应用也是本发明保护的范围。所述线虫为根结线虫(Meloidogyne spp.)。本发明的另一个目的是提供一种线虫的生防制剂。本发明提供的生防制剂，其活性成分为所述的丁香无水乙醇提取物。所述线虫为根结线虫(Meloidogyne spp.)。本发明的实验证明，本发明采用无水乙醇对丁香进行提取，并将提取液对根结线虫的毒杀效果测试，结果为该提取物对根结线虫有强的毒杀活性；说明本发明的提取物为今后根结线虫生防制剂的开发和应用奠定基础。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、丁香无水乙醇提取物的获得高速粉碎机，6202型，北京环亚天元机械技术有限公司制造；台式三频数控超声波清洗器，KQ-500VDV型，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，RE-2000型，上海亚荣生化仪器厂；体视显微镜，Motic SMZ-140型，麦克奥迪实业集团有限公司；微量可调移液器，GILS0N，法国；96孔一次性细胞培养板，JET BIOFIL 型，加拿大；电热恒温培养箱， SKP-02. 420型，黄石市恒丰医疗器械有限公司；无水乙醇(分析纯)，北京化工厂；供试的丁香Eugenia caryophyIlata购自北京市同仁堂大药房，属于桃金娘科，使用花蕾。供试根结线虫(Meloidogyne spp.)从田间发病地块采集番茄根结线虫病的病根， 按照马喆等人(两种农药对南方根结线虫的室内毒力测定，北京农学院学报，2009二4(3) 17-19)介绍的方法，通过从病根上挑去卵囊和孵化获得。1、根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备从田间采集番茄根结线虫病的病根，取产生大量根结的番茄根系，自来水轻轻冲洗干净，用解剖针轻轻挑取病根上的乳白色卵囊，放入直径6cm的小培养皿内，加入少量无菌水，在25°C恒温箱中孵化3d，收集2龄幼虫(简称B)，并加入一定量的无菌水将其配制成一定浓度(500条/mL)的根结线虫二龄幼虫悬浮液备用。2、植物提取物的制备方法一1)粉碎将干燥的丁香放入高速粉碎机粉碎后过40目筛，放入密封袋中备用。2)提取采用超声波提取法，准确称取粉碎好的植物干粉10g，加入无水乙醇50mL于碘量瓶中，放入超声波发生器中，超声功率为400W，工作频率为45KHz，超声的温度为25°C，超声处理30min后，得到丁香的无水乙醇提取液，经过抽滤(使用抽滤瓶和布氏漏斗，垫2层滤纸)，然后将滤液在旋转蒸发器内减压浓缩至稠膏状(丁香无水乙醇提取物)。进行杀虫活性测定前，将膏状物加水配制成浓度为20mg/mL的水溶液，然后装入磨口棕色广口瓶密封， 置于4°C冰箱中保存备用，即为植物提取液(丁香无水乙醇提取物)。方法二1)粉碎与方法一基本相同，不同的是粉碎后过35目筛，放入密封袋中备用。2)提取与方法一基本相同，不同的是植物干粉10g，加入无水乙醇45mL，超声功率为300W，工作频率为^KHz,超声的温度为23°C，超声处理25min ；得到植物提取液(丁香无水乙醇提取物)。方法三1)粉碎与方法一基本相同，不同的是粉碎后过45目筛，放入密封袋中备用。2)提取与方法一基本相同，不同的是植物干粉10g，加入无水乙醇55mL，超声功率为500W，工作频率为ΙΟΟΚΗζ，超声的温度为^°C，超声处理35min ；得到植物提取液(丁香无水乙醇提取物)。实施例2、毒杀活性测定方法采用触杀法测定，具体步骤为取96孔细胞培养板，每孔分别加入配好的浓度为 20mg/mL的由实施例1步骤2的方法一获得的植物提取液150 μ L，再加入等体积的由步骤1 得到的根结线虫二龄幼虫悬浮液，混勻，25°C静置，分别于12h、24h和4 后在体视显微镜下观察，检查线虫死活(针触法)，僵直或卷曲不动的虫体视为死亡，按下式计算线虫校正死亡率。以无菌水为对照，每处理重复3次，结果取平均值士标准误。
死亡亨(。/ )_死亡线虫数”· 夕匕亡车(/0卜供试线虫数
^^^Φ οΛ处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率1ΛΛ
校正死IT率(％) =-, Utroijai^n 、女-X100
1 -对照组线虫死IT率数据处理与分析实验数据通过DPS2000分析整理，结果通过邓肯氏新复极差多重比较法(Duncan's multiple range test,DMRT)进行差异显著性分析。杀线虫强弱分级标准按 Chandravadana 等(Chandravadana M V, Eugene S, Nidiry J, et al. Nematicidal activity of some plant extracts [J]. Indian J Nematol，1996，26 (2) :148-151.)的方法进行，具体分级标准为“_”表示无活性，校正死亡率< 10% ；“ + ”表示弱活性，校正死亡率为10% 30% ；“++”表示中等活性，校正死亡率为30% 50% ；“+++”表示较强活性， 校正死亡率为50% 80%;“++++”表示强活性，校正死亡率> 80%。同列数据后标有不同小写字母表示差异显著(ρ < 0. 05，DMRT法)，大写字母表示差异极显著(ρ < 0. 01，DMRT 法)。以提取物浓度为lOmg/mL处理线虫时，丁香无水乙醇提取物对根结线虫的毒杀活性结果如下处理后Ia1后，丁香无水乙醇提取物对根结线虫的毒杀活性强度为+++，校正死亡率为 61. 38 士8. 75bC,
处理后24h后，丁香无水乙醇提取物对根结线虫的毒杀活性强度为++++，校正死亡率为 94. 04士 3. 91aA,处理后4 后，丁香无水乙醇提取物对根结线虫的毒杀活性强度为++++，校正死亡率为 98. 48 士 1. 52aA。从上述结果可见，丁香的无水乙醇提取物对根结线虫表现出强毒杀活性，处理Mh 后，线虫校正死亡率分别为94. 04% ；处理4 后，线虫校正死亡率分别为98. 48%。根据DPS多重比较结果也表明，丁香的无水乙醇提取物在0. 05及0. 01的水平上差异不显著，均表现出强毒杀活性。采用同样方法检测，由实施例1步骤2的方法二和方法三获得的植物提取液，结果
与方法一无显著差异。
权利要求
1.一种制备丁香无水乙醇提取物的方法，包括如下步骤1)将丁香与无水乙醇混勻，得到混合物；2)将步骤1)得到的混合物进行超声处理，即得到丁香无水乙醇提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述丁香与所述无水乙醇的配比为IOg (45-55)ml ；步骤2)中，所述超声的功率为300W-500W，所述超声的工作频率为^KHz-lOOKHz，所述超声的时间为25min-35min ；所述超声的温度为23°C 48°C。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述丁香与无水乙醇的配比为IOg 05、50或55)ml ；步骤2)中，所述超声的功率为300W、400W或500W，所述超声的工作频率为^KHz、 45KHz或IOOKHz，所述超声的时间为25min、30min或35min ；所述超声的温度为23°C、25°C 或 28 0C ο
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于在步骤1)前，还包括将所述丁香粉碎至35目-45目大小的步骤；所述丁香粉碎至具体为35目、40目或45目大小；在步骤2、后，还包括如下步骤将所述超声处理得到的超声产物依次经抽滤、滤液浓缩至膏状，得到丁香无水乙醇提取物。
5.由权利要求1-4中任一所述的方法制备的丁香无水乙醇提取物。
6.权利要求5所述的丁香无水乙醇提取物在杀线虫和/或防线虫中的应用。
7.权利要求5所述的丁香无水乙醇提取物在制备线虫的生防制剂中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述线虫为根结线虫(Meloidogyne spp. ) O
9.一种线虫的生防制剂，其活性成分为权利要求5所述的丁香无水乙醇提取物。
10.根据权利要求9所述的生防制剂，其特征在于所述线虫为根结线虫(Meloidogyne spp. ) O
全文摘要
本发明公开了一种丁香杀线虫提取物及其制备方法。本发明提供了一种制备丁香无水乙醇提取物的方法，包括如下步骤1)将丁香与无水乙醇混匀，得到混合物；2)将步骤1)得到的混合物进行超声波处理，并经过抽滤和浓缩，即得到丁香无水乙醇提取物。本发明的实验证明，本发明采用无水乙醇对丁香进行提取，并将提取液对根结线虫的毒杀效果测试，结果为该提取物对根结线虫有强的毒杀活性；说明本发明的提取物为今后根结线虫生防制剂的开发和应用奠定基础。本发明从植物材料丁香中提取杀线虫活性物质，所使用的是天然无害的植物材料，可以减少化学农药的使用，从而降低农产品和环境的污染。
文档编号A01N65/28GK102246829SQ201110214040
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者刘正坪, 宋庆丰, 尚巧霞, 胡盼, 赵晓燕, 马喆, 魏艳敏 申请人:北京农学院