专利名称：白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及白沙蒿Δ 12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)及其制备与用途。
背景技术：
Δ 12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是植物控制亚油酸合成的关键酶，利用相关植物的FAD2基因进行基因重组，所得到的转基因植物或者植物以外其它转基因生物将在脂质代谢、细胞识别、免疫反应、耐寒等诸多方面将有新的表现。例如中国发明专利申请 200580048074. 1公开的编码植物脂肪酸去饱和酶基因的核酸分子及其使用方法中涉及了植物中种子贮存化合物的存在相关的蛋白质的编码核酸序列，涉及到在转基因植物中的用途。如脂质代谢相关化合物的操作方法，以及在植物和种子中提高油水平和改变脂肪酸组成的方法；以及应用这些新的植物多肽刺激植物生长和/或提高产率和/或种子贮存，等内容。中国发明专利申请200810186867. 5公开的双途径基因表达同步抑制获得高油酸低芥酸油菜的方法中介绍了利用改良的RNA干扰技术和基因工程手段，对油酸转化为其它脂肪酸的两条代谢途径①和②上的基因表达同时进行干扰沉默，最大限度阻止油酸转化为其它类型的脂肪酸，实现大幅度提高油酸含量和大幅度降低芥酸含量的方法。
在GenBank中已公布花生、芸薹、拟南芥、欧芹、茄和棉花等植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列。发明内容
本发明提供一种取自沙生植物-白沙蒿的FAD2基因，以及这种基因的制备方法及用途。
本发明所述的白沙蒿FAD2基因序列为基因序列表中的SEQ 1。
本发明所涉及的白沙蒿FAD2基因制备方法是首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物PI、P2 ；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列；根据测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的5’ P和5’ NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到 5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿 FAD2基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的 3’ P和3’ NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的白沙蒿AsFAD25’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入BamHI和McI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。
实验表明，构建AsFAD2的表达载体，转染烟草后得到的转基因植物叶片中亚油酸含量提高了 3. 57倍；在冷冻胁迫)进行的12小时期间，转基因植物抗冻性明显升高。
据报道，不饱和脂肪酸的增加与植物抗生物(病原体、植物病原体互做等)和非生物胁迫(低温、干旱、盐、重金属等)密切相关，参见Robert G. Upchurch "Fatty acid unsaturation, mobilization, and regulation in the response of plants to stress" Biotechnol Lett (2008) 30 :967_977，因此，白沙蒿△ _12脂肪酸脱氢酶基因有可能在这些过程中发挥作用。
本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下
P1 5，-AARAARGYYATYCCRCCVCAYTG-3，，
P2 :5’ -TKCCAYCRYIKSATWATRWKG-3‘；
P3 为5 ’ -ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，
P4 为5 ’ -TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3 ’，
5 ’ P 为5 ’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，
5， NP 为5， -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3，；
P5 为5 ’ -ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3 ’，
P6 为5 ’ -TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3 ’，
3 ’ P 为5 ’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，
3 ’ NP 为5 ’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。
P7 :5’ -AGAGGATCCATGGGCGCTGGT-3，
P8 :5’ -GCGGAGCTCTCAGTCGTACTTGCTTC-3’
其中R= Aor G ;Y = C or T ;V = A or C or G ;K = G orT ；S = C or G ;ff = Aor T0
本发明所涉及的白沙蒿FAD2基因可在油料作物的转基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作中应用，也可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。
白沙蒿(Artemisia sphaerocephala krasch)是一种优良超旱生固沙植物，是我国沙区畜牧业的重要饲料之一，是我国西北、华北、东北荒漠半荒漠地区的特有植物，其抗风沙，耐旱、耐寒、耐贫瘠性能极强。白沙蒿叶、籽中均含亚油酸乙酯，水解后可得到亚油酸， 白沙蒿籽油中亚油酸含量可达80%以上，总不饱和脂肪酸含量可达90%，是籽油中亚油酸含量最高的植物，参见白寿宁，云秀芳“沙蒿油开发利用探讨”《粮食与油脂》，2000 (3) 31-33。白沙蒿籽油中亚油酸含量极高，植物油中亚油酸含量最高的就是沙蒿油(参见表 1)。
表1沙蒿油与其他植物油亚油酸含量
权利要求
1.白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因，其特征是其基因序列为SEQ 1。
2.权利要求1所述的白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶基因的制备方法，其特征是首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物PI、P2 ；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列；根据测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与 GeneRacer 试剂盒中自带的5，P和5，NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5，外侧和巢式 PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的3’ P和3’ NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增， 得到3’末端核苷酸序列；将所得到的三段序列(白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列、5’末端核苷酸序列和3’末端核苷酸序列进行拼接，得到目标基因。
3.权利要求2所述的白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶基因的制备方法，其特征是采用白沙蒿的叶片提取RNA。
4.权利要求2或3所述的白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶基因制备方法中所用的相关引物， 其特征是上游引物Pl为5’ -AARAARGYYATYCCRCCVCAYTG-3’， 下游引物P2为5' -TKCCAYCRYIYSATffATRff KG-3'； P3 为5’ -ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’， P4 为5’ -TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3，， 5’ P 为5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’， 5’ NP 为5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ ； P5 为5’ -ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’， P6 为5’ -TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3，， 3’ P 为5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’， 3’ NP 为5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，。其中R = A or G ;Y = C or T ;V = A or C or G ;K = G or T ;S = C or G = A orT。
5.权利要求1所述的白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶基因在油料作物的转基因工作中的应用。
6.权利要求1所述的白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶基因在牧草作物的转基因工作中的应用。
7.权利要求1所述的白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶基因在除权利要求4或5所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。
8.权利要求1所述的白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶基因在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。
全文摘要
本发明公开白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。白沙蒿FAD2基因的制备是用白沙蒿的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的FAD2基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列；利用转基因技术进行的功能验证说明该基因表达可以使烟草叶片亚油酸升高3.57倍，并且转基因植物抗冻性明显提高。本发明的白沙蒿FAD2基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。
文档编号A01H5/00GK102533804SQ20111028102
公开日2012年7月4日 申请日期2011年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者傅华, 刘永红, 张丽静 申请人:兰州大学