专利名称：一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的快速繁殖技术，具体为一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，属生物技术领域。
背景技术：
铁皮石角斗(Dendrobium officinale Kimura et Migo)或(Dendrobium candidum Wall ex Lind.)，又名黑节草，系兰科(Orchidaceae)。石斛属多年生附生草本植物，常附生于密林树干或岩石上，并常与苔藓植物伴生。其新鲜茎或干燥茎入药，是我国最常用传统药材与中成药的原料药。《中国药典》规定铁皮石斛在烘软干燥后可加工成耳环石斛即铁皮枫斗。其味甘淡，性微寒，用于阴伤沣亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚弱，目暗不明，为中国十大仙草之一。在现代的药理研究中，据报道铁皮石斛还具有降血糖、增强抵抗力及抗癌作用。铁皮石斛的种子极为细小，胚胎发育不完全，无胚乳组织，在自然状态下发芽率极低，有性繁殖极为困难。生长于悬崖峭壁之阴处，自然产量极为稀少，由于价值不菲，长期以来一直处于过度采挖状况，其野生资源已濒临绝种，被国家列为2级保护植物，野生资源远远不能满足药材市场的需要。人工繁殖主要靠无性繁殖，从根部不断分蘖或从上部茎节处生根长出新的植株，但是产量很低，仍然离市场的需求相差甚远。为了做到保护与开发并举，通常利用组织培养的方法快速繁殖获得种苗，为人工栽培提供种源。在前人对铁皮石斛快速繁殖的报道中，多集中以种子、茎尖、茎段等为外植体，并通过原球茎的增殖与分化来繁殖种苗。其中存在的问题是用种子繁殖的后代有可能产生变异；茎尖作为外植体会散失母株，茎段由于自身带菌严重，会消毒不彻底。并有研究表明由于石斛的特殊性，在石斛的组织培养中，外植体的选择是十分关键的因素，不同的取材部位和时期，培养的结果也不一样，并且其他外植体形成的试管苗比种子试管苗成株快，茎粗，苗壮，易成活。而直接取材于腋芽作为外植体，不仅取材更方便，并且不伤母株的茎，能保留茎的完整性。目前对铁皮石斛腋芽直接培养诱导成苗的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，从而建立丛生芽途径的高效快速繁殖体系，使通过快速繁殖获得的植株能与母株保持遗传上的一致性，为铁皮石斛野生居群的恢复提供材料，达到保护野生资源的目的。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，具体步骤如下1)腋芽成活生长当铁皮石斛植株茎节间新长出腋芽长0. 5 1. Ocm时，用刀片小心切下完整腋芽， 自来水冲洗干净。在超净工作台上，材料先用75%酒精浸泡30s后，0. 升汞消毒lOmin， 无菌蒸馏水浸洗4次，每次5min，多余水分用无菌滤纸吸干。最后将材料接种在培养基上。以MS为基本培养基，分别添加0. 3mg/L的NAA、1. Omg/L的6-RA，3%的蔗糖和7g/L的琼脂， 调节PH值为5. 5 6.0，高压灭菌20 25min。培养室温度(25 士 3) °C，以植物培养灯为光源，光照强度20001χ，每天光照12h。培养10天就可见腋芽变粗、伸长，60天后长度可达 1.8 2. 0cm，长出5片叶，并且成活率为100%。2)丛生芽的诱导与增殖在腋芽继续伸长生长的同时，其基部不断有新的丛生芽发生。将腋芽移栽到增殖培养基上进行丛生芽的诱导和增殖。该培养基配方为MS、1. Omg/L的NAA、2. 5mg/L的ΒΑ、 20%的香蕉汁、3%的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值为5. 5 6. 0，高压灭菌20 25min。 培养室温度(25士3) °C，以植物培养灯为光源，光照强度20001x，每天光照12h。培养160d， 增殖倍数可达18. 0，随着培养时间的延长，增殖倍数也呈逐渐提高趋势。3)丛生芽生根及生长成苗将丛生芽转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为1/2MS、0. 2 0. 5mg/ L的NAA、20%的香蕉汁和2. 0%。的活性碳混合。培养30d，丛生苗基部的气生根发达，根系数量多达20 30条，且在根系上有白色粉末状，瓶苗叶片光亮，茎粗，节多，有利移栽。4)炼苗移栽(1)炼苗将生根瓶苗在移栽前的7 10天放在温室大棚中培养，炼苗。(2)组培苗移栽组培苗移栽基质为苔鲜、松树皮、木屑与碎石块及粗河沙混合。 用甲基托布沣粉剂600倍稀释液将移栽基质喷洒消毒2天后再移苗。由此方法移栽成活率高达95%以上。为了更进一步提高丛生芽的繁殖系数，采取丛生芽无激素培养的驯化取优质石斛丛生芽簇置于激素含量较高的驯化培养基上培养40d，从中选取生长快的芽簇群；再置于激素含量较低的驯化培养基上培养30d，从中选取生长快的芽簇群；最后置于无激素培养基上培养30d，从中选取生长快且健壮的芽簇。以上培养温度均为(25士 3)°C。本发明制备工艺生产的铁皮石斛丛生芽簇可以用于制备无菌干粉。具体制备方法为收集芽簇，去除培养基，用110°c干燥15min，然后80°C、24h烘干，然后用钴60照射灭菌，最后获得铁皮石斛无菌干粉。本发明上述试剂除特殊说明以外，均为质量百分比。本发明的技术方案，相对于现有技术具有以下有益效果与分株繁殖相比，大大提高了繁殖系数。濒危植物铁皮石斛高效快繁体系的建立为规模化生产提供了技术上的可能性。其深远意义不仅仅是规模化生产的种苗依靠人工栽培来满足市场需求，产生经济效益， 并且规模繁殖成功还可以增加野生居群数量，有利于野生居群的恢复，产生良好的社会效益和生态效益。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。1)腋芽成活生长当铁皮石斛植株茎节间新长出腋芽长0. 5 1. Ocm时，用刀片小心切下完整腋芽， 自来水冲洗干净。在超净工作台上，材料先用75%酒精浸泡30s后，0. 升汞消毒lOmin， 无菌蒸馏水浸洗4次，每次5min，多余水分用无菌滤纸吸干。最后将材料接种在培养基上。以MS为基本培养基，分别添加0. 3mg/L的NAA、1. Omg/L的6-RA，3%的蔗糖和7g/L的琼脂， 调节PH值为5. 5 6.0，高压灭菌20 25min。培养室温度(25 士 3) °C，以植物培养灯为光源，光照强度20001χ，每天光照12h。培养10天就可见腋芽变粗、伸长，60天后长度可达 1.8 2. 0cm，长出5片叶，并且成活率为100%。2)丛生芽的诱导与增殖在腋芽继续伸长生长的同时，其基部不断有新的丛生芽发生。将腋芽移栽到增殖培养基上进行丛生芽的诱导和增殖。该培养基配方为MS、1. Omg/L的NAA、2. 5mg/L的ΒΑ、 20%的香蕉汁、3%的蔗糖和7g/L的琼脂，调节pH值为5. 5 6. 0，高压灭菌20 25min。 培养室温度(25士3) °C，以植物培养灯为光源，光照强度20001x，每天光照12h。培养160d， 增殖倍数可达18. 0，随着培养时间的延长，增殖倍数也呈逐渐提高趋势。3)丛生芽生根及生长成苗将丛生芽转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为1/2MS、0. 2 0. 5mg/ L的NAA、20%的香蕉汁和2. 0%。的活性碳混合。培养30d，丛生苗基部的气生根发达，根系数量多达20 30条，且在根系上有白色粉末状，瓶苗叶片光亮，茎粗，节多，有利移栽。4)炼苗移栽(1)炼苗将生根瓶苗在移栽前的7 10天放在温室大棚中培养，炼苗。(2)组培苗移栽组培苗移栽基质为苔鲜、松树皮、木屑与碎石块及粗河沙混合。 用甲基托布沣粉剂600倍稀释液将移栽基质喷洒消毒2天后再移苗。由此方法移栽成活率高达95%以上。丛生芽无激素培养的驯化取优质石斛丛生芽簇置于激素含量较高的驯化培养基上培养40d，从中选取生长快的芽簇群；再置于激素含量较低的驯化培养基上培养30d，从中选取生长快的芽簇群； 最后置于无激素培养基上培养30d，从中选取生长快且健壮的芽簇。以上培养温度均为 (25士3) "C。通过丛生芽途径建立的快繁体系，也使铁皮石斛优质试管苗的数量得到极大提高，在合适的培养基上，丛生芽诱导的最大增殖倍数可达18. O。以增殖倍数18. O计算，如果 1个芽1年继代培养5次，可获得185 = 1889568个芽，培养100个腋芽就可以获得1亿个左右的丛生芽，进而可获得100亿丛试管苗。与分株繁殖相比，大大提高了繁殖系数。濒危植物铁皮石斛高效快繁体系的建立为规模化生产提供了技术上的可能性。其深远意义不仅仅是规模化生产的种苗依靠人工栽培来满足市场需求，产生经济效益，并且规模繁殖成功还可以增加野生居群数量，有利于野生居群的恢复，产生良好的社会效益和生态效益。丛生芽营养成分鉴定取一部分芽簇进行多糖和石斛生物碱等含量的测定。多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，用80%乙醇提取待测物中所含单糖、低聚糖等干扰性成份，再用水提取多糖类成分。 多糖类在硫酸作用下，先水解成单糖分子并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚缩合成有色化合物，以比色法测定多糖含量。由于石斛碱缺乏紫外吸收峰，所以生物碱含量的测定以石斛碱纯品为标准，采用溴甲酚绿法测定。含量测定结果显示丛生芽的多糖、生物碱、氨基酸和微量元素含量与野生石斛相差无几。
权利要求
1.一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，其特征在于具体步骤如下1)腋芽成活生长当铁皮石斛植株茎节间新长出腋芽长0.5 1. Ocm时，用刀片切下完整腋芽，自来水冲洗干净；在超净工作台上，材料先用75 %酒精浸泡30s后，0. 1 %升汞消毒lOmin，无菌蒸馏水浸洗4次，每次5min，多余水分用无菌滤纸吸干；最后将材料接种在培养基上；培养室温度为2248°C，以植物培养灯为光源，光照强度20001x，每天光照12h ；培养10天就可见腋芽变粗、伸长，60天后长度可达1. 8 2. Ocm，长出5片叶；2)丛生芽的诱导与增殖在腋芽继续伸长生长的同时，其基部不断有新的丛生芽发生；将腋芽移栽到增殖培养基上进行丛生芽的诱导和增殖；培养室温度22-28°C，以植物培养灯为光源，光照强度20001χ，每天光照12h ；培养160天；3)丛生芽生根及生长成苗将丛生芽转移到生根培养基上进行生根培养，培养30d，丛生苗基部的气生根发达，根系数量多达20 30条，且在根系上有白色粉末状，瓶苗叶片光亮，茎粗，节多；4)炼苗移栽(1)炼苗将生根瓶苗在移栽前的7 10天放在温室大棚中培养，炼苗； (2)组培苗移栽组培苗移栽基质为苔鲜、松树皮、木屑与碎石块及粗河沙混合；用甲基托布沣粉剂600倍稀释液将移栽基质喷洒消毒2天后再移苗。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，其特征在于步骤1)中所述的培养基是以MS为基本培养基，分别添加0. 3mg/L的NAA、1. Omg/L的6-BA，3%的蔗糖和7g/L的琼脂混合，调节pH值为5. 5 6. 0，高压灭菌20 25min。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，其特征在于步骤2)所述的增殖培养基配方为MS、1. Omg/L的NAA、2. 5mg/L的ΒΑ、20%的香蕉汁、3%的蔗糖和7g/ L的琼脂混合，调节pH值为5. 5 6. 0，高压灭菌20 25min。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，其特征在于步骤3)所述的生根培养基为1/2MS、0. 2 0. 5mg/L的NAA、20%的香蕉汁和2. 0%。的活性碳混合。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，其特征在于还包括丛生芽无激素培养的驯化取优质石斛丛生芽簇置于激素含量较高的驯化培养基上培养 40d，从中选取生长快的芽簇群；再置于激素含量较低的驯化培养基上培养30d，从中选取生长快的芽簇群；最后置于无激素培养基上培养30d，从中选取生长快且健壮的芽簇；以上培养温度均为22- °C。
6.权利要求1-5的任意之一所述的铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，其特征在于所生产的铁皮石斛丛生芽簇可以用于制备无菌干粉。
7.根据权利要求6所述的铁皮石斛无菌干粉，其特征在于其制备方法为收集芽簇， 去除培养基，用110°C干燥15min，然后80°C、24h烘干，然后用钴60照射灭菌，最后获得铁皮石斛无菌干粉。
全文摘要
本发明公开了一种铁皮石斛腋芽的快速繁殖技术，直接取材于铁皮石斛的腋芽作为外植体，直接诱导丛芽，比较不同种类、浓度的激素组合和不同的天然提取物对腋芽的存活生长、丛芽的诱导增殖以及成苗的影响，研究和探索丛生芽途径成苗的数量以及质量，筛选各时期的最佳培养基配方，从而建立丛生芽途径的高效快速繁殖体系，使通过快速繁殖获得的植株能与母株保持遗传上的一致性，为铁皮石斛野生居群的恢复提供材料，达到保护野生资源的目的。与分株繁殖相比，大大提高了繁殖系数。濒危植物铁皮石斛高效快繁体系的建立为规模化生产提供了技术上的可能性；有利于野生居群的恢复。
文档编号A01H4/00GK102369881SQ201110284479
公开日2012年3月14日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者朱恩灿, 魏渊源 申请人:澄思源生物科技(上海)有限公司