专利名称：一种铁皮石斛人工种子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种铁 皮石斛人工种子的制作方法，是一种植物高效快繁技术，属于生物技术领域。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium candidum)又称黑节草，是一种珍贵的药用植物，自古以来被认为是滋阴补益的珍品，具有益胃生沣、滋阴清热、明目利嗓等功效。早在秦汉时期的 《神农本草经》就称“铁皮石斛主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸弱、强阴、久服厚肥肠”；在 《本草纲目》中，李时珍认为石斛为“本经上品，甘、淡、微咸，主治伤中，除痹下气，补内绝不足，平胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年”。铁皮石斛是中国特有的名贵药材，千年以来一直和灵芝、人参、冬虫夏草等被列为上品中药，并被道家养生经典《道藏》誉为中华九大仙草之首。民间则称其为“救命仙草”，因其主要分布在海拔600-2500m的山谷半阴湿林中的树干或岩石上，野生资源已濒临绝迹，1987年被国务院列为珍稀野生药用植物加以保护。人工繁育铁皮石斛现在普遍使用的方法是植物组培的方法，利用组织培养技术能在一定程度上解决快繁问题，但其试管苗生产周期长，成本高，移栽也不易成活，且不便储藏和运输，从而限制了铁皮石斛的规模性生产。铁皮石斛的种子无胚乳，所以自然条件下发芽率很低。人工种子可以快速繁殖结实率低或难以用种子繁殖、育性欠佳的作物，快速推广优良种质资源，这将对种植业生产向自动化方向推进，创造有利条件。人工种子(artificial seeds)是将植物立体培养产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织(球茎、芽、愈伤组织、胚状体等)包埋在含有营养成分和保护功能的外壳中形成的，在适宜的条件下能够发芽出苗的颗粒体。人工种子技术的发展为铁皮石斛的工厂化育苗提供了一条新的途径，人工种子的制作过程相对组培育苗有投入少，减少了移栽驯化过程，生产周期短等优点。现代研究在人工胚乳、包埋方法、人工种皮、储藏方法等方面做了很多探索，但对于人工种子的萌发率和成苗率及储藏条件等仍有很多问题没有解决。包埋剂的选择及制作工艺需要进一步改进， 既要提高种子的萌发率，又要方便储藏运输。在人工胚乳或人工种皮中添加特殊材料以促进其萌发或延长人工种子的储存问题已成为人们研究的重点。
发明内容
本发明我们旨在提供一种铁皮石斛人工种子的制作方法，以解决现有技术的上述问题，这种方法可机械化操作、方便快捷、低成本繁育铁皮石斛。本发明的目的可以通过以下技术方案来解决。一种铁皮石斛人工种子的制作方法，其具体步骤为(1)原球茎的诱导选择生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株，每2节为一段放入500ml的烧杯中， 加入少量洗衣粉，用纱布单层棚扎杯口，然后用工程线扎紧，放在自来水龙头下冲洗30min，冲水量调整到能使铁皮石斛茎段在水中漂动为好。主要作用是洗去外表尘土和大颗粒菌落、菌丝等。将上述完成后的材料带到无菌室超净工作台上，进行二次消毒灭菌将茎段腋芽的苞叶拨去，用70%的酒精速浸25s，然后用0. 1 %的升汞溶液浸泡lOmin，灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底，然后用无菌水冲洗5次，去掉表面药物残留。将上述材料剪成每1节为一段，去掉药物浸透的茎段部分，接种于预先做好的分化增殖培养基组培瓶中，放在培养基上培养。培养条件温度26°c，光照时间12h，光照强度 2000Lx, 30d后诱导出原球茎。，所述的分化增殖培养基为MS培养基、4mg/L 6-BA (6-苄氨基嘌呤)和0. 4mg/L NAA (萘乙酸)的混合。(2)铁皮石斛人工种子的制作将原球茎转入含有0.5mg/L ABA(S-诱抗素)的MS培养液内震荡培养(IOOr/ min)，每IOd更换1次培养液，30d后选取长乘宽约为0. 5-1. 5mmX 2. 0-3. 4mm原球茎作为包埋繁殖体。以MS+4mg/L的6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0. 4mg/L的NAA (萘乙酸)+2 %海藻酸钠+0.2%多菌灵为基本人工胚乳，为了增加透气、保持水分便于吸收，在此基础上添加 1. 5-2. 0%的淀粉、1. 0-2. 0%活性炭、1. 0-2. 0%保水剂和1. 0-3. 0%的纳米TiO2,以海藻酸钠中添加2%的壳聚糖和5. 0% -10%的纳米TiO2为人工种皮基质。在超净工作台上用镊子将原球茎浸入用MS培养基、4mg/L的6_BA、0. 4mg/L的 NAA、2%的海藻酸钠和0.2%多菌灵配成的包埋液(即人工胚乳)中，用玻璃棒搅拌均勻使原球茎与包埋剂充分混合均勻。5-lOmin后用滴管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴入到人工种皮基质的2 %的CaCl2溶液中进行固化，控制每滴包含一个原球茎，30min后用培养液漂洗15min，即得人工种子。以上均为质量百分比浓度。在不同的萌发基质上进行萌发试验，萌发基质分别为MS培养基、栽种基质进行萌发实验。人工种子在种子MS培养基中30d萌发率为98. 0%，在栽种基质中的萌发率可达 75. 0%，在室外苗床上的萌发率仍可达70%。将制作好的人工种子放入灭菌并烘干的三角瓶中，用封口膜封好，在4°C下分别储存 30d 和 90d。通过本发明的制作方法既可以提高种子的萌发率，又方便储藏运输。在人工胚乳或人工种皮中添加特殊材料还可以促进其萌发或延长人工种子的储存。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。(1)原球茎的诱导选择生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株，每2节为一段放入500ml的烧杯中， 加入少量洗衣粉，用纱布单层棚扎杯口，然后用工程线扎紧，放在自来水龙头下冲洗30min， 冲水量调整到能使铁皮石斛茎段在水中漂动为好。主要作用是洗去外表尘土和大颗粒菌落、菌丝等。将上述完成后的材料带到无菌室超净工作台上，进行二次消毒灭菌将茎段腋芽的苞叶拨去，用70%的酒精速浸25s，然后用0. 1 %的升汞溶液浸泡lOmin，灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底，然后用无菌水冲洗5次，去掉表面药物残留。将上述材料剪成每1节为一段，去掉药物浸透的茎段部分，接种于预先做好的分化增殖培养基组培瓶中，放在培养基上培养。培养条件温度26°C，光照时间12h，光照强度 2000Lx, 30d后诱导出原球茎。，所述的分化增殖培养基为MS培养基、4mg/L 6-BA (6-苄氨基嘌呤)和O. 4mg/L NAA (萘乙酸)的混合。(2)铁皮石斛人工种子的制作将原球茎转入含有0. 5mg/L ABA的MS培养液内震荡培养(lOOr/min)，每IOd更换1次培养液，30d后选取长乘宽约为0. 5-1. 5mmX 2. 0-3. 4mm原球茎作为包埋繁殖体。以 MS+4mg/L的6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0. 4mg/L的NAA(萘乙酸)+2 %海藻酸钠+0. 2 %多菌灵为基本人工胚乳，为了增加透气、保持水分便于吸收，在此基 础上添加1. 5-2. 0%的淀粉、 1. 0-2. 0%活性炭、1. 0-2. O %保水剂和1. 0-3. O%的纳米TiO2,以海藻酸钠中添加2%的壳聚糖和5.0% -10%的纳米TiO2为人工种皮基质。在超净工作台上用镊子将原球茎浸入用MS培养基、4mg/L的6_BA、0. 4mg/L的 NAA、2%的海藻酸钠和0.2%多菌灵配成的包埋液(即人工胚乳)中，用玻璃棒搅拌均勻使原球茎与包埋剂充分混合均勻。5-lOmin后用滴管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴入到人工种皮基质的2%的CaCl2溶液中进行固化，控制每滴包含一个原球茎，30min后用培养液漂洗15min，即得人工种子。人工种子的萌发实验在不同的萌发基质上进行萌发试验，萌发基质分别为MS培养基、栽种基质、苗床进行萌发实验。人工种子在种子MS培养基中30d萌发率为98. 0%，在栽种基质中的萌发率可达75. O %，在室外苗床上的萌发率仍可达70%。铁皮石斛种子在自然条件下的萌发率仅为5%，现在市场上的人工种子的萌发率也仅为80%，我们的产品大大提高了铁皮石斛人工种子的萌发率。人工种子的储藏实验将制作好的人工种子放入灭菌并烘干的三角瓶中，用封口膜封好，在4°C下分别储存 30d 和 90d。 将制作好的人工种子储存30d后其在MS培养基上的萌发率为95.0%，60d后萌发率仍可达90. O %，成苗率可达85.0%。现在市场上对于人工种子的储存还存在很大的问题，随着储存时间的延长人工种子的萌发率会有明显的下降，我们所制备的人工种子在储存后仍能保持很高的萌发率。虽然国内有关铁皮石斛人工种子制作的报道，但制作的人工种子的仅在培养基上萌发成功，未实现在栽种基质和户外苗床上的萌发。本发明利用现代纳米材料制作的人工胚乳和人工种皮，不仅可以改善海藻酸钠包埋系统的透气性、保水性和吸水性，缩短人工种子的萌发时间，而且可以抑制微生物的繁殖和成长，达到抑菌、防腐的作用，并促进人工种子胶粒中的原球茎生长，从而提高人工种子在栽种基质和户外苗床上的萌发率和成苗率， 为铁皮石斛人工种子实用化提供技术支持，从而为铁皮石斛的繁育开辟了一条新的途径。
权利要求
1.一种铁皮石斛人工种子的制作方法，其特征在于 其具体步骤为1)原球茎的诱导选择铁皮石斛健康植株，经过切段、灭菌、清洗后，接种于预先做好的分化增殖培养基的组培瓶中，在培养基上诱导出原球茎，然后进行原球茎的增殖培养；2)人工种子的制作将原球茎再转入含有0.5mg/L的ABA的MS培养液内，以lOOr/min 的速度震荡培养，每IOd更换1次培养液；30d后选取长X宽为0. 5-1. 5mmX2. 0-3. 4mm 的原球茎作为包埋繁殖体，采用滴注法进行人工种子制作；以MS培养基、4mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA、2%的海藻酸钠和0. 2%的多菌灵为基本人工胚乳；以海藻酸钠添加2%壳聚糖和5. 0-10%纳米TiO2为人工种皮基质；将原球茎浸入人工胚乳中，使原球茎与包埋剂充分混合均勻；5-lOmin后用滴管将包有原球茎的半凝胶状态海藻酸钠滴入到人工种皮基质的2% CaCl2溶液中进行固化，控制每滴包含一个原球茎，30min后用培养液漂洗15min， 即得人工种子。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子的制作方法，其特征在于所述的分化增殖培养基为MS培养基、4mg/L的6-BA和0. 4mg/L的NAA混合。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子的制作方法，其特征在于步骤1)中，所述的切段、灭菌和清洗具体为选择生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株，每2节为一段放入500ml的烧杯中，加入少量洗衣粉，用纱布单层棚扎杯口，然后用工程线扎紧，放在自来水龙头下冲洗30min，冲水量调整到能使铁皮石斛茎段在水中漂动；洗去外表尘土和大颗粒菌落、菌丝等；将上述完成后的材料带到无菌室超净工作台上，进行二次消毒灭菌将茎段腋芽的苞叶拨去，用70%的酒精速浸25s，然后用0. 的升汞溶液浸泡 IOmin,灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底，然后用无菌水冲洗5次，去掉表面药物残留。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子的制作方法，其特征在于步骤1)中，所述的接种、诱导过程具体为将经切段、灭菌和清洗后的石斛茎段剪成每一节为一段，去掉药物浸透的茎段部分，接种于预先做好的分化增殖培养基的组培瓶中，放在培养基上培养；培养条件温度26°C，光照时间12h，光照强度2000Lx ；30d后诱导出原球茎。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛人工种子的制作方法，其特征在于为了增加透气、保持水分便于吸收，在人工胚乳中添加1.5-2.0%的淀粉、1.0-2.0%活性炭、1.0-2. 0%保水剂和1. 0-3. 0%的纳米Ti02。
全文摘要
本发明公开了一种铁皮石斛人工种子的制作方法，将铁皮石斛茎在培养基上诱导并获得原球茎，然后进行原球茎的增殖培养，再转入含有0.5mg/L的ABA的MS培养液内震荡培养，每10d更换1次培养液。30d后选取原球茎作为包埋繁殖体，采用滴注法进行人工种子制作，以MS培养基、4mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA、2％的海藻酸钠和0.2％的多菌灵为基本人工胚乳，以海藻酸钠添加2％壳聚糖和5.0-10％纳米TiO2为人工种皮基质，并进行人工种子的萌发和储藏研究。通过本发明的制作方法既可以提高种子的萌发率，又方便储藏运输。在人工胚乳或人工种皮中添加特殊材料还可以促进其萌发或延长人工种子的储存。
文档编号A01H4/00GK102428870SQ20111028449
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者朱恩灿, 魏渊源 申请人:澄思源生物科技(上海)有限公司