专利名称：玉米ZmRop1蛋白的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中玉米ZmRopl蛋白的新用途。
背景技术：
玉米矮花叶病(maize dwarf mosaic disease，MDMD)可由一至多种病毒系统性侵染引起，在全世界范围内造成严重的经济损失。国际上已报道的可引起玉米矮花叶病的病毒有6种，它们均属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，它们分别是甘蔗花叶病毒(Sugar cane mosaic virus，SCMV)、玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)、高粱花叶病毒 (Sorghum mosaic virus, SrMV)、约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus, JGMV) > 玉米属花叶病毒(Zea mosaic virus,ZeMV)禾口白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus, PenMV)。甘蔗花叶病毒北京分离物(SCMV-BJ)是引起我国北方玉米产区玉米矮花叶病的优势株系(Fan ZF, Chen HY, Liang ΧΜ, Li HF, 2003. Complete sequence of the genomic RNA of the prevalent strain of a potyvirus infecting maize in China.Archives of Virology 148,773-82)。作为一种细胞内专性寄生物的植物病毒，在侵染过程中，其生活史的完成必须依赖寄主因子参与病毒脱壳、基因组复制、病毒颗粒组装和病毒运动过程。而这种依赖性就需要寄主因子在病毒侵染时改变原有的正常的功能和状态。这些复杂的改变一方面体现在植物发生了一系列生理和组织上的变化，从分子、化学和物理水平上来抵抗病毒的侵染，另一方面表现在病毒通过多种策略适应或改变寄主细胞从而增强侵染复制复合体的形成、抑制转录后基因沉默，促进细胞间的移动、干扰植物细胞周期等，同时导致寄主植物形成各种症状，包括花叶、褪色、矮化、发育缺陷或死亡等(Whitham SA,Yang C Goodin匪2006. Global impact :elucidating plant responses to viral infection. Molecular Plant-Microbe Interactions 19,1207-15)。在抗性寄主中，病毒的侵染会激发抗性寄主的免疫反应，病毒的无毒基因 (Avrgene)和寄主的抗病基因(R gene)相互识别可激发寄主的一些抗病防卫反应。在感病寄主中，植物基因表达的变化可能是由两种原因造成一是病毒侵染过程要求的寄主因子参与；二是由于寄主本身的抗病反应或由于病毒侵染干扰了植物miRNA的功能，进而引起植物典型的表型变化即症状的产生(Yang Ζ, Fu Y, 2007. R0P/RAC GIPasesignaling. Current Opinion in Plant Biology 10,490-4)。鉴定SCMV侵染后玉米中差异表达的基因，有助于探索防治玉米矮花叶病的新途径。近年来，科学家已经做了大量工作来鉴定SCMV侵染后玉米中差异表达的基因(Uzarowska A, Dionisio G, Sarholz, B et al. ,2009. Validation of candidate genesputatively associated with resistance to SCMV and MDMV in maize(Zea mays Dbyexpression profiling. BMC Plant Biology 9，15doi :10. 1186/1471-2229-9—15)， 然而，SCMV和玉米之间的分子互作机理尚不清晰。Rop作为植物重要的调控因子，参与调控植物多种信号途径，如调控花粉管的生长、调控肌动蛋白细胞骨架和细胞极性生长(Yang Ζ, 2002. Small GTPase versatile signaling switches in plants. Plant Cell Supplement 14，S375—88)、参与植物非生物胁迫(Nibau C, Wu H, Cheung A, 2006. RAC/ROP GTPase 'hubs' for signal integration and diversification in plants. Trends in Plant Science 11 (6),1360-85), Rops 33S 参与一些植物激素如脱落酸(Zheng ZL, Nafisi Μ, Tam A, Li H. et al. ,2002. Plasma membrane-associated ROP IOsmall GTPase is a specific negative regulator of abscisic acid responses in Arabidopsis. Plant Cell 14,2787-97)禾口生长素信号途径，Rops也参与泛素/26S蛋白体介导的蛋白水解(Tao L, Cheung AY, Nibau C Wu HM, 2005. RAC GTPases in tobacco and Arabidopsis mediate Auxin-induced formation of proteolytically active nuclear protein bodies that containAUX/IAAproteins. Plant Cell 17，2369_83)。在玉米中，共有 9 个 Rop 成员，ZmRopl 9 ;ZmRopl (ZmRacA)， ZmRop2 (ZmRacB), ZmRop3 (ZmRacC)和ZmRop4 (ZmRacD)在哺乳动物细胞中表达能够诱导过 fHL的/^t (Hassanain HH, Sharma YK, Moldovan L et al. ,2000. Plant Rac proteins induce superoxide production in mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research. Communications 272 :783-8)；而ZmRop2在玉米雄性配子体(花粉粒)中发挥重要功能(Agrawal GK, Iwahashi H, Rakwal R, 2003. Small GTPase iRop' :molecular switch for plant defense responses. FEBSLetters 546，173-80)，然而在大多数情况下，ZmRop 成员的参与调控玉米正常生长发育和玉米对生物、非生物逆境胁迫响应知之甚少。
发明内容
本发明的一个目的是提供序列表中序列1所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。本发明提供了序列表中序列1所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。本发明的另一个目的是提供序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。本发明提供了序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。所述抑制植物病毒复制为抑制植物病毒在植物体或植物组织或植物细胞中的复制；所述植物细胞为植物细胞中的原生质体；所述植物病毒为引起玉米矮花叶病的植物病毒；
所述引起玉米矮花叶病的植物病毒为甘蔗花叶病毒。序列表中序列1所示的蛋白在防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。所述植物病毒病害为玉米矮花叶病；所述玉米矮花叶病是由甘蔗花叶病毒引起的；所述植物为玉米。本发明通过⑴在玉米原生质体中共转化能表达ZmRopl的质粒与SCMV RNA,发现过量表达ZmRop 1，SCMV病毒复制水平降低约392. 6%,即过量表达ZmRopl可有效抑制SCMV 的复制；⑵在玉米叶片中瞬时沉默ZmRopl后接种SCMV，ZmRopl瞬时沉默的植株上，SCMV 建立系统侵染的时间缩短(提前3d)，病毒累积增加(表现在SCMV mRNA水平增加约274 395% )，产生的系统花叶症状更为严重，瞬时沉默ZmRopl促进了 SCMV在玉米上的系统侵染。这些将在防治玉米病毒病害中发挥重要作用，同时为玉米的分子育种打下良好的基础。
图1为在玉米原生质体中过量表达ZmRopl对SCMV复制的影响。图2为瞬时沉默ZmRopl的玉米植株表型及其ZmRopl的mRNA水平。图3为瞬时沉默ZmRopl对SCMV系统侵染玉米植株的影响。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、过量表达ZmRopl抑制甘蔗花叶病毒(SCMV)的复制一、构建ZmRopl瞬时表达载体按照分子克隆常规方法，构建ZmRopl瞬时表达载体pGFP-Ropl。具体方法如下 从美国自交系cv. Va35(购自中国农业大学国家玉米改良中心)叶片中提取总RNA为模板， 用上下游引物RoplF和RoplR，RoplF 5' -GTCGACATGGCGTCCAGCGCCTCTCGGTTCAT-3‘，(下划线部分为 Sal I 酶切位点)，RoplR 5' -GAGCTCTCAGGACTTGAAGCATAGCATTTTTCTTCCACCG-3‘，(下划线部分为Sac I酶切位点)，反转录PCR扩增得到ZmRopl蛋白的编码基因序列，该编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，该序列所编码的ZmRopl蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。然后利用Ml I和Mc I限制性内切酶酶切该编码基因序列，回收酶切后的基因片段；同时， 用Ml I和Mc I酶切载体pGFP(公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是Shi Y, Qin YiCao Y. et al. , 2011. Influence of an m-type thioredoxin in maize on potyviral infection. European Journal of Plant Pathology 131，317—26)，回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的基因片段连接后，获得重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在PGFP载体的Ml I和Mc I酶切位点间插入了序列表中序列2 所示的ZmRopl基因片段，证明重组载体构建正确，将该重组载体命名为pGFP-Ropl。二、甘蔗花叶病毒(SCMV) RNA提取1、SCMV病毒粗提纯收集感染SCMV且系统花叶症状明显的玉米叶片200g，剪成小段，在液氮中快速研磨成粉状。在研磨后的粉状物中加入400ml提取缓冲液1(0. 5M磷酸钾缓冲液，使用前加入0. OlM的二乙基二硫代氨钾酸钠和β -巯基乙醇，WV, ρΗ7. 2)，搅拌均勻。用双层尼龙网(孔径38 μ m)过滤，滤液加20% (WV) CCl4,充分搅拌20 30min。8，500rpm离心 25min。往上清液中加入0. 25M的NaCl (终浓度)，搅拌至完全溶解后，再缓慢加入6% (g/ ml)PEG-6000(Fluka,日本)，冰浴中搅拌至PEG-6000完全溶解，于4°C静置2h。8，500rpm离心30min，沉淀用含Tween-20 (Roche，Germany)的提取缓冲液II (0. 05M磷酸钾缓冲液， PH7. 2)于4°C悬浮过夜。7，OOOrpm离心15min，将上清液置于20%的蔗糖垫上(上清液与蔗糖垫的体积比为1 2)，38，000印111离心901^11。每管沉淀用1. Oml提取缓冲液III (0. 005M 磷酸钾缓冲液，PH7.2)充分悬浮，4°C冰箱中过夜。7，OOOrpm离心IOmin去沉淀，上清液即为粗提纯的SCMV，然后以100 μ 1为单位分装，于-80°C冰箱中保存备用。收集感染SCMV且系统花叶症状明显的玉米叶片的方法为将SCMV侵染的玉米汁液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第三片叶上，接种后将玉米植株放在人工气候室中培养，培养条件为23°C光照1 和21°C黑暗他。接种30天后收集系统花叶症状明显的玉米叶片。SCMV侵染的玉米汁液的制备方法如下从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为SCMV侵染后，通过机械摩擦方式接种到玉米(综31)植株上，保存在防虫温室中。接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明显的幼嫩叶片，称取0. Ig该幼嫩叶片，加入Iml接种缓冲液，充分研磨后转移到Eppendorf 管中，4°C，5000g离心5min，取上清，即得到SCMV侵染的玉米汁液。2、从粗提纯病毒中提取SCMV RNA在100 μ 1 粗提纯 SCMV 中加入 160 μ 1 RNAse-free 的 ddH20，再加入 200 μ 1 RNA 抽提缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0 ；200mM NaCl ；5mM EDTA)，然后加入 40 μ 1 10% SDSjg 勻，室温保持5min。加入2倍体积(800 μ 1)的PCI (苯酚氯仿异戊醇=25 24 1), 混勻，12，OOOXg离心5min。吸取上层水相，加入2倍体积的PCI，混勻，12，OOOXg离心 5min，再重复抽提一次。吸取上层水相，确定其体积后，加入1/10(V/V)3M的NaAC(pH 5. 2)，混勻；加入2. 2倍体积的无水乙醇，混勻，-80°C沉淀Ih或-20°C沉淀过夜。12，OOOXg离心20min，用Iml 70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥；所得RNA溶于30 μ 1 RNAse-free的ddH20 中，-80°C保存备用。三、玉米原生质体的制备、转化及观察(1)玉米原生质体的分离选取籽粒饱满、大小均一的玉米自交系综31 (购自中国农业大学国家玉米改良中心)种子，用氯气消毒并在超净工作台吹净氯气后置于25°C的培养箱中发芽、暗培养。当玉米黄化苗长到第2片叶高于第一片10 15cm时，剪下第2片叶子中间的6 8cm的部分， 轻轻将20片剪下的叶片叠在一起，用新开封的刀片切成约0. 5mm的细丝，在蒸馏烧瓶中按照Ig叶片加入5ml酶溶液(1 1. 5%纤维素酶RlO (Yakult Honsha,日本)、0· 2 0. 4% 离析酶R10(Yakult Honsha)、0. 6M甘露醇、20mM KCl、20mM MES，pH5. 7)的比例加入酶溶液， 然后消化、避光，抽真空30min (真空度0. 05MPa)，使酶溶液充分渗透到叶片中。然后在摇床 (40rpm)上继续避光消化池。将上述经酶溶液消化的叶片滤过尼龙网(孔径38 μ m)，转移到圆底离心管中，置于冰上，获得分离的玉米原生质体。(2)玉米原生质体的活力测定用尖端剪去的吸头取出500 μ 1分离的原生质体，转移到2ml离心管中，加入等体积的0. 02%荧光素乙酰乙酸盐(FDA)溶液(0. Iml FDA母液Qmg FDA溶于Iml丙酮) 溶于 IOml CPW 洗液中(27. 2mg/L KH2PO4,101mg/L KNO3,1480mg/L CaCl2 · 2H20，246mg/L MgSO4 · 7Η20，0· 16mg/L ΚΙ,Ο. 025mg/L CuSO4 · SH20,10% mannitol, pH5. 7)，静置 5min。取适量样品置于载玻片上，用镊子轻轻盖上盖片，注意不要使其盖片滑动。在荧光显微镜下， 五点取样，每个视野的原生质体总数不少于50个，观察记录原生质体总数和发黄绿荧光的原生质体总数，发黄绿荧光原生质体为有活力的原生质体(图1中A，玉米原生质体活力检测；分离出的玉米原生质体经FDA染色后在显微镜下观察黄绿色荧光，物镜倍数20X)。(3)玉米原始质体的转化及观察将玉米原生质体用电击缓冲液(0.6M mannitol,4mM MES, pH5. 7,20mM KCl)洗2 次。150 X g离心2min，小心吸去上清液，用电击缓冲液重悬原生质体，用血球计数板计数使重悬后的原生质体浓度达到2X106/ml，将原生质体置冰上备用。在2ml圆底离心管中加入50 μ g重组质粒pGFP-Ropl和300 μ 1原生质体，充分混勻，再加入10 μ g SCMVRNA,用移液器吸吐混勻，电击2次(5msec，200 μ F，400V)，冰上放置lOmin。150g离心anin，吸去上清液，用Iml孵育缓冲液(1000ml中包括30g蔗糖，4. 3gMurashige-Skoog[MS]盐，2mg甘氨酸，Img维生素Bi，IOOmg肌醇，0. 5mg 1-萘乙酸，0. 5mg 6-BA,0. 2mg 2，4-二氯苯氧乙酸， 0. 55M甘露醇，pH 5. 7)重悬原生质体，25°C黑暗孵育过夜。同时，以转化质粒pGFP和SCMV RNA的原生质体作为对照。转化后的原生质体，通过激光扫描共聚焦显微镜观察GFP绿色荧光来检测ZmRopl 的表达，转化质粒PGFP的对照原生质体，绿色荧光分布于整个原生质体细胞，而转化重组质粒pGFP-Ropl的原生质体，绿色荧光分布于原生质体细胞质膜(图1中B，转化后的玉米原生质体GFP绿色荧光观察；激光扫描共聚焦显微镜激发光波长488nm，40X油镜，标尺 10 μ m)。四、转化后玉米原生质体的总RNA提取和Real-time RT-PCR检测SCMV的累积
将Iml的TRIzol anvitogen，美国)加入到转化后孵育Mh的原生质体中(每 Iml TRIzol裂解10个电击反应的原生质体)，剧烈振荡^iin ；冰上放置5min。原生质体裂解物于4°C、12，000Xg离心IOmin以除去不溶的成分，将上清转入一新的1. 5ml离心管中。 在室温下静置5min，加0. 2ml氯仿，剧烈震荡15s，然后在室温下静置2 5min，再于4°C、 12，000 Xg的条件下离心15min。将上层水相转移到新的1. 5ml离心管中，加0. 5ml异丙醇， 混合(上下颠倒)，使样品在室温下静置15min，4°C、12，000 X g离心lOmin，则RNA会在管的侧壁和底部形成沉淀。弃上清，加入75%的乙醇洗涤沉淀，于4°C、7，500X g离心5min (如 RNA沉淀悬浮起来，则用12，000 X g)，弃乙醇。RNA在室温下干燥IOmin或在冷冻离心干燥机上浓缩5min，加入30 μ 1 RNAase-Free的ddH20溶解沉淀，_70°C保存备用。
将总RNA用DNase I消解后，检测其纯度和浓度。然后用试剂盒Takaka SYBRpremix Ex TaqTm 进行 Real-time RT-PCR 分析超量表达 ZmRopl 对 SCMV 复制的影响。以500ng总RNA作为模板，以试剂盒自带01 igo_d (T)和Random 6mers作为反向引物，进行反转录反应。每个反应管依次加入4. 0μ 1 5XReaction BufferU. 0μ 1 dNTPs (IOmM) >0. 5μ 1 RNase inhibitor^. 5 μ 1 01 igo-d (T) Primer (50 μ Μ) >0. 5 μ 1 Random 6mers (100 μ Μ)、500ng 总 RNA、0. 5 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase,最后用 RNAse-free的ddH20补充至20 μ 1。反应液在42°C水浴反应lh。获得的反转录产物用试剂盒自带的稀释缓冲液(EASY Dilution)稀释10倍。每个PCR反应管中加入2. 0μ 1稀释10倍的反转录产物、12. 5μ 1 2XSYBR Premix ExTaqUOmM dNTPs, 1. 0μ 1 SCMV 特异性引物(20 μ Μ)引物序列为SCMVqF 5' -TTTATGCGTGGCTTCTCG-3‘，SCMVqR 5' -TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3 ‘，最后用 dd H2O 补充至 25 μ 1。玉米泛素基因(登录号似9159)作为内参，内参引物为UbiF 5' -GGAAAAACCATAACCCTGGA-3‘，UbiR 5 ‘ -ATATGGAGAGAGGGCACCAG-3 ‘。 在 DNAEngine Opticon 2system(Bio-Rad)上进行反应。反应条件是50°C，2min ；94°C, IOmin ；94°C，15sec，58°C， 15sec ;72°C，15sec ;80· 5°C，lsec，读板，40 个循环。Real time PCR 结束以后，根据扩增仪自带的软件Opticon Monitor 3对数据进行分析。2_ΔΔετ法的步骤如下首先，对所有的测试样本(test)和校准样本(calibrator)，用参照基因(ref)的 Ct值归一目标基因(target)的Ct值Δ CT(test) = CT(targetj test)-CT(refj test)A Cll(Calibrator) 。T (target，calibrator)。T (ref, calibrator)其次，用校准样本的Δ Ct值归一测试样本的Δ Ct值
Δ Δ Ct = Δ Ct (test) - Δ Ct(calibrator)最后，计算表达水平比率f=表达量的比值得到的结果是通过参照基因表达水平校准的实验样本中目标基因相对于校准样本的增加或减少的倍数，用参照基因校准目标基因表达的目的是为了弥补样本组织量的差
巳结果表明，过表达ZmRopl的玉米原生质体(即转入重组质粒pGFP-Ropl的玉米原生质体)中SCMV mRNA的相对表达量为747%，而转入空载体pGFP-II的玉米原生质体中 SCMV mRNA的相对表达量为1139. 6%，相对于转入空载体pGFP-II的玉米原生质体，过表达ZmRopl的玉米原生质体中SCMV mRNA的相对表达量降低392. 6% (图1中C，Real-time RT-PCR检测玉米原生质体转化24h后SCMV的mRNA水平；每个数值代表三次独立实验数值士标准偏差，不同字母代表student’ s t-test显著性差异(P < 0. 05)。实施例2、ZmRopl在玉米植株上的瞬时沉默及其对SCMV侵染的影响一、ZmRopl在玉米植株上的瞬时沉默1、构建ZmRopl瞬时沉默载体从美国自交系cv.Va35叶片中提取总RNA为模板，用上下游引物RoplGSF和 RoplGSR,RoplGSF 5 ‘ -CATAAGCTTGTCGACCCACGCGTCCGCCCAG-3 ‘，(下划线部分为 Hind III酶切位点)， RoplGSR 5 ‘ -CATAAGCTTAGCAGCGGCGGATGAGCAGGGC-3 ‘，(下划线部分为 Hind III酶切位点)，反转录PCR扩增得到ZmRopl非翻译区特异性片段，通过HindIII酶切PCR 产物并回收14S3P的基因片段，同时用HindIII酶切雀麦花叶病毒侵染性克隆载体BMVpF3-5/13’ A/G(公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是 Ding, X. S. ， Schneider, W. L. ， Chaluvadi, S. R. , Mian, Μ. A. R. ， &Nelson, R. S. (2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts. Molecular Plant-Microbe Interactions,19, 1229-1239.)，回收2. Ikb的载体片段，将回收的2. Ikb的载体片段与回收的I^bp的基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体BMVpF3-5/13’ A/ G的HindIII酶切位点处插入了序列表中序列2第1到145位所示的ZmRopl序列，证明质粒构建正确，将构建的沉默载体命名为pF3-5/13’ A/G-ZmRopl。2、体外转录模板的制备在体外转录之前，用SpeI线性化载体BMVFl-11、用I^shAI线性化载体BMVF2-2 (公众可从中国农业大学获得，记载过载体BMVFl-Il和载体BMVF2-2的非专利文献是 Ding, X. S. ， Schneider, W. L. ， Chaluvadi, S. R. ， Mian, Μ. A. R. ， &Nelson, R. S. (2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts. Molecular Plant-Microbe Interactions, 19，1229-1239.)、用 I^shAI 线性化重组载体 pF3_5/13’ A/G-ZmRopl 和用 I^shAI 线性化载体 BMVpF3-5/13’A/G。线性化后的质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳分析线性化完全程度，确定线性化完全以后，用DNA回收试剂盒进行回收，测定DNA浓度，所有DNA浓度调整到500ng/y 1。3、体外转录以Spe I线性化的BMVFl-Il为模板，进行体外转录，得到BMVFl-Il体外转录产物； 以I^shA I线性化的BMVF2-2为模板，进行体外转录，得到BMVF2-2体外转录产物；以I^shA I 线性化的pF3-5/13’A/G-ZmRopl为模板，进行体外转录，得到pF3_5/13’A/G-ZmRopl体外转录产物；以I3ShA I线性化的BMVpF3-5/13’A/G为模板，进行体外转录，得到BMVpF3-5/13’A/G体外转录产物。体外转录体系参照Riboprobe andRiboMAX(TM) In Vitro Transcription Systems (!Iomega，美国)，并进行修改，体外转录体系如下所示最后用无RNA酶的ddH20补足20μ1，在37°C反应lh。体外转录完成以后，取出 1 μ 1用琼脂糖凝胶电泳分析体外转录产率和体外转录物的降解情况。在接种玉米以前，先对上述体外转录产物进行纯化，体外转录产物加入ddH20，补足至100 μ 1，加入等体积4M LiCl溶液，混勻后，冰浴过夜或-70°c沉淀Ih以上，12，000 Xg 离心20min，充分吸出上清后，用70%乙醇洗涤两次，干燥后溶于适量RNAase-Free的ddH20 中，-70°C保存备用。吸出的上清中为双链DNA模板，可以用乙醇沉淀后再次利用做体外转录的模板。4、体外转录产物接种将载体BMVF1-11、载体BMVF2-2和重组载体pF3-5/13，A/G_ZmRopl三者的体外转录产物等量混勻后摩擦接种玉米Va35三叶期的第二片叶，即为沉默接种(C-BMVAA;R0p145)。 将载体BMVF1-11、载体BMVF2-2和载体BMVpF3_5/13’A/G三者的体外转录产物等量混勻后摩擦接种玉米三叶期的第三片叶片，即为空载体对照接种(C-BMVve)；用无RNaseWddH2O 接种的植株作为模拟接种(Mock)。接种方法如下在待接种的叶片的第二片叶上轻微撒上高温灭菌的金刚砂，按每片叶子接种 l.Oyg体外转录物的量吸取接种液(体外转录为混合物)，用带有乳胶手套的手指轻轻涂抹叶片，尽量均勻且不重复涂抹。5min后，用蒸馏水冲洗叶片，洗去金刚砂。接种后的植物放置在暗处1 后，然后置22°C的温室中生长。C-BMVaA;和C-BMVAA;/R0p145每次都至少各接种3株，同时用RNAase-Free的ddH20接种相同数量的植株作为模拟接种。5、结果(1)体外转录物接种后美国自交系cv. Va35的表型C-BMVa7g和pC-BMVA/e/R0pl145接种以及模拟接种美国自交系cv. Va35后，在培养箱中生长，观察美国自交系cv. Va35上出现的症状等表型，并用数码相机记录。在代表C-BMVaA;和C-BMVAA;/R0p145的体外转录物接种后第7天，在接种叶上第一片系统叶均出现轻微的白色条纹症状。在接种后第10天，C-BMVA/e/R0p145接种的植株在接种叶上第一片和第二片系统叶均出现紧密的白色或淡黄色条纹，但接种C-BMVve玉米植株系统叶片仍表现轻微的白色条纹症状；而模拟接种的玉米植株的叶片未出现白色或淡黄色条纹症状，表型正常(图2中A，ZmRopl瞬时沉默的美国自交系cv. Va35的表型；体外转录物及模拟接种IOd后对第一片系统叶进行拍照)。
5XT3RNA聚合酶缓冲液 0. IM DTT
RNA酶抑制剂(40υ/μ1)
5mM Cap (m7GpppG)
10 X NTPs (20mMATP、、CTP、UTP，
4 μ 1 2 μ 1 0.5 Ul 2 μ 1 2 μ 1
2mM GTP)
处理好的模板 Τ3 RNA聚合酶
1-2 ug 0.5 Ul
(2)美国自交系cv. Va35中ZmRopl的沉默效率检测为了验证接种C-BMVve和C-BMVA/e/R0p145的玉米植株在表型上的差异是由于ZmRopl的沉默引起的，在接种后第12天，提取各接种植株的系统叶片的总RNA，通过 Real-time RT-PCR检测ZmRoplmRNA水平，所用到的特异性引物为RoplqF 5' -AGGATGTTCTATGATGAACATCTTCGG-3‘，RoplqR 5' -CTGCTTAACTCATAGCTAGCTAACCACAC-3 ‘。具体方法参照实施例 1 中的步骤四。结果表明，接种C-BMVAA;/R0p145的玉米植株系统叶片中，ZmRopl的mRNA水平是接种C-BMVaaj植株的系统叶片ZmRopl的mRNA水平的20% ，是模拟接种植株(Mock) 系统叶片ZmRopl的mRNA水平的15% 18% (图2中B，体外转录物及模拟接种后14天， Real-time RT-PCR检测ZmRopl沉默效率。每个数值代表三次独立实验数值士标准偏差， 不同字母代表student，s t-test显著性差异(P < 0. 05) ；Mock代表模拟接种植株系统叶片ZmRopl的mRNA水平；C-BMVve代表接种C-BMVve植株的系统叶片ZmRopl的mRNA水平； C-BMVA/G/Rop145代表接种C-BMVA/e/R0p145植株的系统叶片ZmRopl的mRNA水平)。二、瞬时沉默ZmRop 1对SCMV侵染的影响1、ZmRopl瞬时沉默的美国自交系cv. Va35挑战接种SCMV为了研究瞬时沉默对SCMV侵染的影响，在C_BMVAA;/R0pl145等体外转录物接种后 12天，在接种叶上部第二片系统叶用金刚砂摩擦接种SCMV，具体方法为在步骤1)接种 IOd后，分别在沉默接种(C-BMVve Rop145)、空载体对照接种(C-BMVaA;)和模拟接种(Mock) 的玉米叶片上等量接种(5 μ 1)(等量是指沉默接种、空载体对照以及模拟接种的叶片上接种的SCMV侵染的玉米汁液量是相等的)SCMV侵染的玉米汁液。接种方法为将SCMV侵染的玉米汁液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第二片系统叶上，接种SCMV后的美国自交系cv. Va35植株继续在相同的生长条件下生长。SCMV侵染的玉米汁液的制备方法如下从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为SCMV侵染后，通过机械摩擦方式接种到玉米(综31)植株上，保存在防虫温室中。接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明显的幼嫩叶片，称取0. Ig该幼嫩叶片，加入Iml接种缓冲液，充分研磨后转移到Eppendorf 管中，4°C，5000g离心5min，取上清，即得到SCMV侵染的玉米汁液。接种缓冲液的配制将1. 362g KH2PO4溶于IOOOml蒸馏水中，再将 1. 78IgNa2HPO4 · 2H20 溶于 IOOOml 蒸馏水中，然后将 490ml KH2PO4 溶液和 5IOmlNa2HPO4 溶液混合，4°C保存备用。2、美国自交系cv. Va35植株在二次接种SCMV后的表型差异这些接种了 C-BMVve和C-BMVAA;/R0pI145以及模拟接种的美国自交系cv. Va35植株在二次接种SCMV后在表型上又出现了差异。一方面表现为，SCMV系统症状出现的时间不同，沉默接种(C-BMVaA; Rop145)的美国自交系cv.Va35植株二次接种SCMV后第一片、第二片系统叶出现系统症状的时间是在二次接种SCMV后7d和Ild ；而空载体对照接种(C-BMVaxc) 和模拟接种(Mock)的美国自交系cv.Va35植株中二次接种SCMV后第一、二片系统叶出现系统症状对应的时间是IOd和14d。二次接种SCMV后7d和lld，沉默接种(C_BMVaA; Rop145) 的美国自交系cv. Va35植株，SCMV接种叶上系统叶均能通过RT-PCR检测到SCMV，而空载体对照接种(C-BMVaA;)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv. Va35植株，对应叶位的叶片中检测不到SCMV。另一方面表现为，沉默接种W-BMVve Rop145)的美国自交系cv. Va35植株中SCMV 系统叶表现的系统花叶症状要比空载体对照接种(C-BMVve)和模拟接种(Mock)植株症状要严重的多(图3中A，分别为沉默接种(C-BMVve Rop145)、空载体对照接种(C-BMVaA;)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv. Va35植株二次接种SCMV后系统叶的表型；SCMV接种后10 天对第一片系统叶片进行拍照)。3、瞬时沉默ZmRopl促进了 SCMV在美国自交系cv. Va35上的系统侵染为了验证SCMV在以上植株的症状差异是由于其在这些植株上侵染程度不同造成的，分别收集沉默接种(C-BMVA/e Rop145)、空载体对照接种(C-BMVve)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv. Va35植株二次接种SCMV后的SCMV系统叶用于分析SCMV的mRNA水平和病毒的累积情况。这些系统叶片一部分用来提取总RNA，用Real-time RT-PCR分析SCMV的 mRNA水平，所用到的特异性引物为SCMVqF 5' -TTTATGCGTGGCTTCTCG-3‘，SCMVqR 5' -TGTTGCTGGTGGCGTTGT-3‘。具体方法参照实施例1中的步骤四。结果表明，在沉默接种(C-BMVve Rop145)的美国自交系cv.Va35植株中，第一、二片系统叶中，SCMV的mRNA水平要比空载体对照接种(C-BMVve)的美国自交系cv. Va35植株和模拟接种(Mock)的美国自交系cv. Va35植株中对应叶位的系统叶片中SCMV的mRNA 水平均显著高；沉默接种植株中，第一片系统叶中，SCMV的mRNA水平要比空载体对照接种和模拟接种分别高257. 5%和294% ；第二片系统叶中，SCMV的mRNA水平要比空载体对照接种和模拟接种分别高145. 8%和171. 8% ；(图3中B，Real-time RT-PCR检测沉默接种 (C-BMVveRop145)、空载体对照接种(C-BMVve)和模拟接种(Mock)的美国自交系cv. Va35植株二次接种SCMV后系统叶的mRNA水平。每个数值代表三次独立实验数值士标准偏差，不同字母代表student，s t-test显著性差异(P < 0. 05) ；Mock代表模拟接种植株系统叶片 SCMV的mRNA水平；C-BMVve代表接种空载体对照接种植株的系统叶片SCMV的mRNA水平； C-BMVA/G/Ropl145代表接种沉默接种植株的系统叶片SCMV的mRNA水平)。
1权利要求
1.序列表中序列1所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。
2.序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用； 所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
3.含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。
4.根据权利要求3中所述的应用，其特征在于所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于所述抑制植物病毒复制为抑制植物病毒在植物体或植物组织或植物细胞中的复制； 所述植物细胞为植物细胞中的原生质体； 所述植物病毒为引起玉米矮花叶病的植物病毒； 所述引起玉米矮花叶病的植物病毒为甘蔗花叶病毒。
6.序列表中序列1所示的蛋白在防治植物病毒病害中的应用。
7.序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在防治植物病毒病害中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
8.含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在防治植物病毒病害中的应用。
9.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于所述重组表达载体为在pGFP载体的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
10.根据权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于 所述植物病毒病害为玉米矮花叶病；所述玉米矮花叶病是由甘蔗花叶病毒引起的； 所述植物为玉米。
全文摘要
本发明公开了玉米ZmRop1蛋白的新用途。本发明所提供的新用途为序列表中序列1所示的蛋白在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用、序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用、以及含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制植物病毒复制的产品中的应用。本发明通过在玉米原生质体中共转化能表达ZmRop1的质粒与SCMV RNA，发现过量表达ZmRop1，SCMV病毒复制水平降低约392.6％，即过量表达ZmRop1可有效抑制SCMV的复制。这些将在防治玉米病毒病害中发挥重要作用，同时为玉米的分子育种打下良好的基础。
文档编号A01N63/00GK102428963SQ201110285569
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者周涛, 施艳, 曹言勇, 范在丰 申请人:中国农业大学