专利名称：铁皮石斛的组培繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种铁皮石斛的无激素组织培养快繁方法。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium officinale)，别名黑节草，是兰科(Orchidaceae)石斛属 (Dendrobium)中名贵的药用植物，是中华九大仙草之首，有极其丰富的药用价值，野生资源极少，主要分布于云南、广西、安徽等地。据《本草纲目》记载，铁皮石斛具有“主治伤中、补五脏虚劳、强阴益精、厚肠胃、补内绝不足、平胃气、长肌肉、益智除惊、轻身延年之功效”。由于其茎干入药，对咽喉疾病、提高人体免疫力乃至肿瘤都具有显著疗效，成为了驰名中外的保健佳品。由于人们长期的野外采挖，野生的铁皮石斛已经到了濒危的状况。铁皮石斛坐果率很低，种子不易发芽，自然繁殖率极低。建立组培快繁体系可以从根本上解决这一问题。迄今，铁皮石斛组培快繁立法大多都选用茎尖、新芽、休眠芽为外植体，通过拟原球茎途径培养。用无菌种子产生原球茎组培方法鲜有报道。尽管这些方法优化了传统生产的培养基成分，操作简便，生产成本低，药用成分接近野生铁皮石斛，但存在繁殖率较低，分化慢，难于进行批量生产和工厂化生产等问题。发明目的针对现有技术存在的上述不足，本发明旨在提供一种铁皮石斛的无激素组织快繁方法，各阶段采用不同的优化培养基配方，使之在野生种源缺乏及繁殖率低的情况下能够快速繁衍，使该物种的优良性状的保存能够得到保障，同时避免了通过拟原球茎途径造成的周期长的缺点，缩短离体培养时间及生产成本，提高生根率和幼苗移栽率，为铁皮石斛的可持续利用奠定组培种苗繁育基础。本发明的上述目的是用下述的技术方案加以实现的铁皮石斛的无激素组培繁殖方法，包括蒴果消毒、原球茎诱导，分化并壮苗生根培养，试管苗移栽步骤，取铁皮石斛的成熟蒴果进行原球茎诱导、分化、壮苗、生根培养， 培养的温度为20-23°C，湿度为30-45%，光照条件为自然光2000-2500LUX+人工辅助光 1500-2000LUX，光照时间为Uh/d ；所述的原球茎诱导培养基为改良MS+10%香蕉+10%马铃薯+蛋白胨1 %，分化培养基为&+10 %香蕉+10%马铃薯，壮苗生根培养基为1/2改良 MS+20%香蕉+活性炭0. 5% ；改良MS用KNO3减半，NH4NO3减半。所述的组培繁殖方法中，蒴果消毒先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫，然后采用75 %的酒精灭菌3min，无菌水冲洗3遍后再用0. 1 %升汞溶液进行表面消毒10min-15min，分两次进行，第一次消毒5-8min，不断震荡后用无菌水清洗3_5遍， 再用0. 升汞消毒5-7min后用无菌水清洗3_5遍。所述的组培繁殖方法，移栽是生根组培苗在培养瓶内培养45天以后炼苗30天，再移栽于温室大棚。所述的组培繁殖方法，移栽基质为白水苔或锯末、松树皮，PH为5. 8。
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所述的组培繁殖方法，移栽在早上8-11点，温度18-25°c下进行。具体地，本发明的组培繁殖方法为选取铁皮石斛成熟的蒴果，先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫，然后采用75%的酒精灭菌3min，无菌水冲洗3 遍后再用0. 升汞溶液进行表面消毒10min-15min，分两次进行，第一次消毒5-8min，不断震荡后用无菌水清洗3-5遍，再用0. 升汞消毒5-7min后用无菌水清洗3_5遍。将蒴果置于消毒后的滤纸上，切去两端后纵切，将种子撒播于原球茎诱导培养基即改良MS+10% 香蕉+10%马铃薯+蛋白胨中，pH为5. 8，改良MS用KNO3减半，NH4NO3减半，1.5个月后将长出的原球茎放入分化培养基即B5+10%香蕉+10%马铃薯中进行苗分化，1. 5个月后将形成的小苗放入壮苗及生根培养基即1/2改良1/2改良MS+20 %香蕉+活性炭0. 5 %中，瓶内培养45天生根后进行组培苗炼苗30天，移栽于白水苔或锯末、松树皮、湿度40%-50%、 PH为5.8的基质苗床上，空气湿度为60% -80%，每天早晚各喷水一次。与现有技术相比，本发明的组培方法的优点在于本发明方法在培养不同阶段采用了不同配方的培养基，以适应植物在不同时期对营养物质的需求，在原球茎诱导阶段，加入了蛋白胨，有效的提高了种子的诱导率，在原球茎分化阶段，采用了 &培养基，使得增值系数提高到10，从根本上解决了铁皮石斛组织培养分化率低的问题。在生根过程中，添加了 0. 5%的活性炭，使得生根条数比无添加活性炭的增加一倍，且根系粗壮发达，提高了移栽成活率。建立了本发明的有效的工厂化铁皮石斛组培快繁方法，解决了传统种子繁殖困难，繁殖受阻的状况。通过本发明组培快繁得到的幼苗，成苗容易，一致性强，生长健壮，叶色浓绿，很少病虫害，易于管理。不受季节限制，任何时候都可以进行组培。可以保持物种特性，使该品种能够延续和可持续利用。由于无激素添加，不存在诱变、污染等食品安全问题，节约了生产成本，且生产过程中分化率高，繁殖速度快。通过本发明的组培快繁方法，繁育的铁皮石斛在一月内可增殖系数为10，平均生根率为98%，平均移栽成活率为95%，极大地提高了铁皮石斛的繁殖系数，阻止了由于野外植株少缺乏种子及种子成活率低，导致该物种灭绝的危险，为该物种的保存和可持续利用提供了非常有效的繁殖方法。利用本发明的蒴果无菌种子繁殖方法，能解决一直以来使用蒴果繁育时遇到的原球茎分化率低，增殖率低，代数低，试管苗长势弱的问题，使用本发明优化的配方，生产的铁皮石斛的药用成分与野生相当或略高于野生铁皮石斛的有效成分，达到了高效快繁的目的。本发明通过不断的探索实验，形成了一套专门的无激素铁皮石斛组织培养繁殖技术体系，克服了之前专利培养基成分复杂，培养过程繁琐，无实际工厂化繁殖经验，为大规模人工种植铁皮石斛提供了保障，现阶段已使用本发明工厂化生产铁皮石斛瓶苗4年之久，生产过程中问题少，分化率高，繁殖速度快，继代代数多，成分与野生铁皮石斛相当或略高于野生铁皮石斛的有效成分含量，证明了该繁殖技术是目前为止适合工厂化生产的组培方法。
具体实施例方式以下实施例用来进一步说明本发明的实质性内容。根据本发明技术方案和实施例
4的描述，也许同领域技术人员在本发明的基础上还可以对本发明技术方案进行一些修改和改进。因此，在不偏离本发明主要技术方案基础上所做的修改和改进，均应属于本发明所要求保护的范围。实施例1 以铁皮石斛(Dendrobium officinale)的成熟蒴果为外植体探索原球茎诱导最适培养基。先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫，然后采用75%的酒精灭菌3min，无菌水冲洗3遍后再用0. 1 %升汞溶液进行表面消毒10min-15min，分两次进行，第一次消毒5-8min，不断震荡后用无菌水清洗3_5遍，再用0. 1 %升汞消毒5-7min后用无菌水清洗3-5遍。将蒴果置于消毒后的滤纸上，切去两端后纵切，将种子撒播于原球茎诱导培养基即改良MS+10%香蕉+10%马铃薯+蛋白胨1 %中，pH为5. 8，改良MS用KNO3减半， NH4NO3减半。1. 5个月后将长出的原球茎放入分化培养基即B5+10%香蕉+10%马铃薯中进行苗分化，1. 5个月后将形成的小苗放入壮苗及生根培养基即1/2改良1/2改良MS+20%香蕉+活性炭0. 5%中，瓶内培养45天生根后进行组培苗炼苗30天，移栽于白水苔或锯末、松树皮、湿度40% -50%, pH为5.8的基质苗床上，大棚内湿度为60% -80%，每天早晚各喷水一次。本发明方法在培养不同阶段采用了不同配方的培养基，以适应植物在不同时期对营养物质的需求，在原球茎诱导阶段，加入了蛋白胨，有效的提高了种子的诱导率，在原球茎分化阶段，采用了 &培养基，使得增值系数提高到10，从根本上解决了铁皮石斛组织培养分化率低的问题。在生根过程中，添加了 0. 5%的活性炭，使得生根条数比无添加活性炭的增加一倍，且根系粗壮发达，提高了移栽成活率。本发明优化的培养基配方不仅提高了分化系数而且促进了生根，继代30天后，每个芽生长叶片7-8片，株高3cm，大量须根白绿色。另外，温度对丛芽的诱导和组培苗的生长和生根也起到了非常关键的作用，温度在21-23°C，光照为自然光2000-2500LUX+人工辅助光1500-2000LUX，光照时间12h/d，有利于原球茎分化。在此条件下叶色浓绿，生长健壮，试管苗的增殖系数较高，平均生根率为98%，平均移栽成活率为95%，极大地提高了铁皮石斛的繁殖系数。当每株铁皮石斛在瓶内生根较密，根长为l_3cm时可作移栽准备。首先将瓶盖打开进行炼苗，同时，在温室准备移栽准备，移栽基质为白水苔或锯末松树皮等，PH5.8。将移栽基质装入移栽盘内，清水浸透，将炼苗30天后的组培苗移栽于温室内的移苗盘内，移栽时间最好在早上8-11点进行，温度在18-25°C，覆薄膜并每天浇水1-2次，注意在早上8-10 点以前打开薄膜以通气，湿度在50-60%之间。10天以后即可揭掉薄膜，进行正常管理。通过上述本发明的组培快繁方法，繁育的铁皮石斛在一月内可增殖系数为10，平均生根率为98%，平均移栽成活率为95%，极大地提高了铁皮石斛的繁殖系数，阻止了由于野外植株少缺乏种子及种子成活率低，导致该物种灭绝的危险，为该物种的保存和可持续利用提供了非常有效的繁殖方法。利用本发明的蒴果无菌种子繁殖方法，能解决一直以来使用蒴果繁育时遇到的原球茎分化率低，增殖率低，代数低，试管苗长势弱的问题，使用本发明优化的配方，生产的铁皮石斛的药用成分与野生相当或略高于野生铁皮石斛的有效成分，达到了高效快繁的目的。
本发明通过不断的探索实验，形成了一套专门的无激素铁皮石斛组织培养繁殖技术体系，克服了之前专利培养基成分复杂，培养过程繁琐，无实际工厂化繁殖经验，为大规模人工种植铁皮石斛提供了保障，现阶段已使用本发明工厂化生产铁皮石斛瓶苗4年之久，生产过程中问题少，分化率高，繁殖速度快，不添加任何激素，不存在诱变、污染等食品安全问题，生根苗健壮，移栽成活率高，药用成分与野生铁皮石斛相当或略高于野生铁皮石斛的有效成分含量，证明了该繁殖技术是目前为止适合工厂化生产的组培方法。
权利要求
1.铁皮石斛的无激素组培繁殖方法，包括蒴果消毒、原球茎诱导，分化并壮苗生根培养，试管苗移栽步骤，其特征在于取铁皮石斛的成熟蒴果进行原球茎诱导、分化、壮苗、生根培养，培养的温度为20-23°C，湿度为30-45%，光照条件为自然光2000-2500LUX+人工辅助光1500-2000LUX，光照时间为Uh/d ；所述的原球茎诱导培养基为改良MS+10%香蕉+10% 马铃薯+蛋白胨1%，分化培养基为香蕉+10%马铃薯，壮苗生根培养基为1/2改良 MS+20%香蕉+活性炭0. 5% ；其中改良MS用KNO3减半，NH4NO3减半。
2.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于所述蒴果消毒先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫，然后采用75%的酒精灭菌3min，无菌水冲洗3 遍后再用0. 升汞溶液进行表面消毒10min-15min，分两次进行，第一次消毒5-8min，不断震荡后用无菌水清洗3-5遍，再用0. 升汞消毒5-7min后用无菌水清洗3_5遍。
3.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于移栽是生根组培苗在培养瓶内培养45天以后炼苗30天，再移栽于温室大棚。
4.根据权利要求1所述组培繁殖方法，其特征在于移栽基质为白水苔或锯末、松树皮， pH 为 5. 8。
5.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于移栽在早上8-11点，温度 18-25 °C下进行。
6.根据权利要求书1-5中的任意一项所述的组培繁殖方法，其特征在于所述蒴果消毒先用5%洗衣粉水浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫，然后采用75%的酒精灭菌 3min，无菌水冲洗3遍后再用0. 1 %升汞溶液进行表面消毒10min-15min，分两次进行，第一次消毒5-8min，不断震荡后用无菌水清洗3_5遍，再用0. 1 %升汞消毒5-7min后用无菌水清洗3-5遍。将蒴果置于消毒后的滤纸上，切去两端后纵切，将种子均勻撒播于原球茎诱导培养基即改良MS+10%香蕉+10%马铃薯+蛋白胨中，pH为5. 8，改良MS用KNO3减半， NH4NO3减半；1. 5个月后将长出的原球茎放入分化培养基即B5+10%香蕉+10%马铃薯中进行苗分化，1. 5个月后将形成的小苗放入壮苗及生根培养基即1/2改良1/2改良MS+20%香蕉+活性炭0. 5%中，瓶内培养45天生根后进行组培苗炼苗30天，移栽于白水苔或锯末、松树皮、湿度40% -50%, pH为5.8的基质苗床上，大棚内湿度为60% -80%，每天早晚各喷水一次。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种铁皮石斛无菌苗无激素培养及快速繁殖的方法。内容包括，铁皮石斛无菌种子萌发，原球茎的形成及分化，以及壮苗与生根的培养技术。选取成熟的蒴果，无菌播种到原球茎培养基，1.5个月后将长出的原球茎放入分化培养基中进行苗分化，1.5个月后将形成的1cm小苗放入壮苗及生根培养基中，2个月后可观察到生长一致、株高约6-8cm的瓶苗，每颗瓶苗至少5条发达的根系。与传统繁殖方式相比，本方法采用无激素培养，极大提高了种苗繁殖速度，苗生长健壮，假鳞茎明显，发根多，移栽成活率高，生产成本低，不存在诱变、污染等食品安全问题，且繁殖速度快，生根苗健壮，移栽成活率高，达到了产业化生产水平。
文档编号A01H4/00GK102422811SQ201110293419
公开日2012年4月25日 申请日期2011年10月6日 优先权日2011年10月6日
发明者杨晓寅, 罗桂芬, 马知遥 申请人:红河州巨丰生物科技有限公司