专利名称：细菌Paenibacillus polymyma SHL-1及其在防治墨兰茎腐病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物农药领域，具体涉及一株细菌作彻/如以7ΛΛ5SHL-I及其制备的生物制剂与在防治墨兰茎腐病中的应用。
背景技术：
■兰、Cymbidium.幻·/^/ ·^)在我国具有悠久的栽培历史，主要分布在广东、广西、 福建、浙江、四川、云南等地。在花卉产业中，墨兰属于高档盆花主栽品种，具有极高的经济价值和观赏价值。近年来，随着墨兰种植面积的扩大，各种病虫害也不断出现，成为影响墨兰生产的限制因子之一。墨兰茎腐病(/^sari Mj^^r )，又叫枯萎病，是墨兰生产中重要的病害，为害严重时可导致植株枯死，给墨兰的生产造成严重威胁。在广东省各市、县 (区)调查发现，该病害在墨兰种植基地发生普遍，为害严重，部分花场发病率高达30%，给墨兰生产造成严重影响。类芽孢杆菌属QPaenibacUIus)是由Ash等于1993年建立的新属，包括11个原属芽孢杆菌属的种，其模式种为多粘类芽孢杆菌iP—illus polymyxa).研究表明， 多粘类芽孢杆菌可以产生肽类、蛋白质类、核苷类等多种有抗菌作用的代谢产物，对多种植物病害具有防治作用。Kavitha等(2005)从多粘类芽孢杆菌VLB16发酵液中分离到一种分子量为37KDa且耐高温的蛋白质，该蛋白能抑制稻瘟病菌(Meigrmportlw orj^ae)、稻纹枯病菌O^izoc■so/a/ji)菌丝生长。孙长坡研究发现，A polymyma Cp_S316对包括黄瓜枯萎病菌(/^sari腫ozj^por腫f. sp. 腫eri/ 腫)在内的8种病原真菌禾口 4禾中病原细菌都具有强烈的拮抗作用。Khan等报道了 A还可以通过固氮和溶磷作用为宿主植物提供营养成分，促进植株生长，提高植物的抗病性等。可见，多粘类芽孢杆菌 polymyma )抗菌谱广，有效代谢产物多样，具有开发成为生物农药的潜力。
发明内容
本发明的目的在于针对现有生物防治墨兰茎腐病技术的不足，提供一种具强烈抑 lifi^ffl Paenibacillus polymyma SHL-I0本发明的另一个目的在于提供由上述细菌Pami力aciBttsSHL-1的发酵液制备而得的生物制剂。本发明的另一个目的在于提供上述生物制剂的制备方法。本发明的另一个目的在于提供上述细菌Pami如《7ΛΛ5SHL_1及其发酵液在墨兰茎腐病防治中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
SHL-I菌株是经常规组织分离法分离自石斛兰叶片。该菌株在LB培养基上培养48 h 后观察，其单菌落为圆形，白色，表面光滑，不透明，略隆起，边缘整齐无皱褶。该菌在PH7.0 的LB培养液中，28 V,200 r/min振荡培养Mh，发酵液呈浑浊状，菌体粘连成絮状，24h 4 发酵液开始变澄清，絮状菌体散开。该菌株经16S rDNA序列分析，其序列与GenBank 中登陆号为HQ317186. 1饱Paenibacillus polymyxa同源性达99% ；经BIOLOG细菌鉴定系统软件分析表明，SHL-I菌株仅与数据库中的多粘类芽孢杆菌QPaenibacillus polymyma ) 匹配良好，其相似性Similarity (SIM)为0. 834，位距Distance (DIS)为2. 48，可能性 Probability (PROB)为99%。已于2011年12月2日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为 CCTCC M 2011441。一种生物制剂，是由拮抗细菌菌株PamihciBm polymyma SHL-I经液体发酵制备而得，其制备方法为Paenibacillus polymyma SHL-I接种至pH7. 0的LB液体培养基，于下200 r/min振荡培养48 h，即可获得。实验证明上述生物制剂对墨兰茎腐病菌有强烈的抑菌作用，平均抑菌带为 12. Omm ；该菌株的发酵液对白掌疫病菌沩orasp.)、一品红疫病菌沩ora sp.)、非洲菊白绢病黨iSclerotium rolfsii、、大叶伞菌核病IiSclerotinia sclerotiorum)及蝴蝶兰花梗腐烂病菌、Fusarium fujikuroi )有抑菌效果，其中对白掌疫病的平均抑菌带达到9. 3mm，对蝴蝶兰花梗腐烂病菌的平均抑菌带达到9. 8mm，具有广谱的抑菌作用。因此，本发明的细菌作彻/如以7ΛΛ5/70^737應SHL-I及其发酵液可用于墨兰茎腐病的防治。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的生物制剂对墨兰茎腐病菌具有强烈的抑制作用，而且该生物制剂来源环保无毒性，对生态环境影响小；2.本发明采用的Paenibacillus polymyma SHL-I菌株，其培养条件要求低，且对多种病原真菌具有抑菌作用，具有很好的开发应用前景。
图1 % Paenibacillus polymyma SHL-I在LB培养基上的单菌落背面图； 图2%PewnibeiCilluS polymyma SHL-I发酵液对墨兰茎腐病菌的抑制作用。
具体实施例方式各种培养基配方
PDA培养基称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水IOOOml煮沸半个小时，纱布过滤， 再加10 20g葡萄糖和17 20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，121°C灭菌20分钟后， 冷却后贮存备用。LB培养基胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g,Nacl 10 g，琼脂粉15 g，定容至1000 mL，pH 7.2。以上材料不加琼脂粉即为LB液体培养基。实施例1 Paenibacillus polymyma SHL-I培养液对墨兰茎腐病菌的抑制活性 SHL-I菌株是经常规组织分离法分离自石斛兰叶片。该菌株在LB培养基上培养48 h
后观察，其单菌落为圆形，白色，表面光滑，不透明，略隆起，边缘整齐无皱褶。该菌经16S rDNA序列分析，其序列与GenBank中登陆号为HQ317186. 1饱Paenibacillus polymyxa同源性达99% ；经BIOLOG细菌鉴定系统软件分析表明，SHL-I菌株仅与数据库中的多粘类芽孢杆菌(/ ^/力aci/^As polymyma )匹配良好，其相似性Similarity (SIM)为0. 834，位距Distance (DIS)为 2. 48，可能性 Probability (PROB)为 99%。采用抑菌圈法测定该菌株活体菌液的活性。将细菌菌株接种于LB培养液中，于观 200 r/min振荡培养48 h。用内径为0.6 mm的打孔器在PDA培养基上打孔，孔内加入
细菌菌液80 μ L，在距该孔3 cm处接种墨兰茎腐病菌菌块。以加入LB液体培养基为对照， 每个处理重复3次，25 °C恒温培养箱内培养，当对照菌落直径达到6 cm时，测量抑菌带宽度。经测定SHL-I菌株活体菌液对代ozj^^r 具有明显抑制作用，产生平均带宽为12.0 mm的抑菌带，使靠近拮抗菌一侧的代ozj^^r 菌丝停止生长。因此，本实施例中的一株对墨兰茎腐病菌具有拮抗活性的菌株SHL-I，命名%PewnibeiCilluS polymyma SHL-I，并于 2011年12月2日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2011441。实施例2 Paenibacillus polymyma SHL-I 培养液的抗菌谱
以几种花卉真菌病害病原菌为对象，通过抑菌圈法测定Paenibacillus polymyma SHL-I菌株的抗菌谱。将细菌菌株接种于LB培养液中，于观200 r/min振荡培养48 h。 用内径为0.6 mm的打孔器在PDA培养基上打孔，孔内加入细菌菌液80 μ L，在距该孔3 cm 处分别接种白掌疫病菌、一品红疫病菌、非洲菊白绢病菌、大叶伞菌核病菌及蝴蝶兰花梗腐烂病菌菌块。以加入LB液体培养基为对照，每个处理重复3次，25 °C恒温培养箱内培养， 当对照菌落直径达到6 cm时，测量抑菌带宽度。表1 PaenibacUlus polymyma SHL-I发酵液对5种病原菌的抑制作用
供试菌擁处理1抑茵帮处 理2(ram) 理3平均_菌带(nm)白掌疫病10.09 0P.0議一 1 红疫病4.03.23.53.57非洲菊白鍋病4.04,03.33.77大叶伞茵核病4.24.53.84-17_蝶兰花《腐烂病10.010.09.83
由表1可以看出，PamihciB^s polymyma SHL-I对这几种病害的病原菌都有抑菌作用，说明该菌株抗菌谱广。
权利要求
1.UMPaenibacillus polymyma SHL-1，该菌株于2011年12月2日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2011441。
2.一种生物制剂，其特征在于该生物制剂是由细菌PamiAaciBtts polymyma SHL-I经液体发酵培养制备而得。
3.权利要求2所述生物制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤-.■mPaenibacilliis polymyma SHL-I接种至pH7. 0的LB液体培养基，于下200 r/min振荡培养48 h，即可获得。
4.权利要求1所述细菌Pami如CiBmSHL-I或其代谢产物在防治墨兰茎腐病中的应用。
全文摘要
本发明公开一株细菌PaenibacilluspolymymaSHL-1及其制备的生物制剂与在防治墨兰茎腐病中的应用。细菌PaenibacilluspolymymaSHL-1，于2011年12月2日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCM2011441。本发明将PaenibacilluspolymymaSHL-1接种至pH7.0的LB液体培养基中，于28℃下200r/min振荡培养48h，即可获得生物制剂。该生物制剂对墨兰茎腐病菌具有强烈的抑制作用，且来源环保无毒性，对生态环境影响小；另外，其培养条件要求低，对多种病原真菌具有抑菌作用，具有很好的开发应用前景。
文档编号A01N63/02GK102433285SQ20111043783
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者向梅梅, 张云霞, 施祖荣, 黄江华 申请人:仲恺农业工程学院