专利名称：自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型及其制备方法
技术领域：
本发明涉及转基因小鼠动物模型领域，更具体地讲，涉及一种自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型及其制备方法。
背景技术：
诸多流行病学和临床观察研究结果表明，高同型半胱氨酸血症 (hyperhomocysteinemia, HHcy)增加心脑血管疾病和动脉粥样硬化发生的风险，血浆Hcy 每升高3umol/L，缺血性心脏病发生率增加11%，卒中发生率增加19%。Hhcy是动脉粥样硬化发生的始动因素之一，其诱发的动脉粥样硬化的炎症反应进程一旦启动，最终会导致不可逆的动脉粥样硬化斑块的形成。
虽然一些循证医学证据(2005年公布的NORVIT试验和2006年报道的H0PE2试验) 表明叶酸联合B族维生素降低血Hcy水平对业已形成动脉粥样硬化患者一级终点的改善并无明显作用，但是降低血Hcy水平，有可能改善仅有高同型半胱氨酸危险因素(尚未形成动脉粥样硬化斑块)所致的血管内皮功能损伤，从而阻遏动脉粥样硬化的发生和/或发展。 Hhcy对心脑血管系统造成的损害仍不容小觑。到目前为止，Hhcy导致动脉粥样硬化的机制仍未完全阐明。
最近国内外研究表明，Hcy可能通过促进氧化应激，介导炎症和免疫反应，促平滑肌细胞增殖，影响血管内皮功能，激活血小板凝血系统，影响脂代谢等机制参与AS的发生发展。深入研究同型半胱氨酸致动脉粥样化损伤的作用机制以及采取有效的干预措施，迫切需要一种能最真实地反映人类动脉粥样硬化疾病进展过程且重复性好的动物模型。目前国际上普遍采用的建立HHcy动物模型的方法主要有1、饮食中添加高蛋氨酸/同型半胱氨酸或叶酸、维生素B12缺失诱导HHcy形成；2、采用基因缺陷小鼠常用于敲除的基因有核心家庭胱硫眯β-合酶(CBQ、甲烯四氢叶酸还原酶(MTHFR)、载脂蛋白E (ApoE)0采用饮食诱导的方法成本较低，但是个体差异较大，重复性差，可控性低；而将同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶作用缺失后形成的HHcy模型因其性状稳定，重复性好，已被广泛应用。纯合CBS基因缺陷小鼠的血浆Hcy水平可以达到正常水平的40倍以上，伴有严重的生长发育迟滞，肝脂肪变性，晶状体错位。杂和CBS基因缺陷小鼠血浆Hcy升高在2倍以上，且不伴有各种生长缺陷，因此成为研究轻度HHcy的理想模型。但是，多项研究表明，虽然出现了内皮损伤，在CBS基因缺陷小鼠模型上并未观察到动脉粥样硬化病理损害发生。MTHFR基因缺陷小鼠的表现型与CBS基因缺陷小鼠相似，但发生动脉粥样硬化的倾向更大。纯合和杂和的MTHFR基因缺陷HHcy小鼠经饮食诱导后都可以观察到类似动脉粥样硬化早期病变的主动脉脂质沉积，而小鼠的血脂水平都在正常范围，因此，MTHFR基因缺陷小鼠似乎可以成为单纯轻度Hcy增高致动脉粥样硬化的动物模型。
研究发现，给予高蛋氨酸或同型半胱氨酸饮食后，apoE基因缺陷小鼠可以形成大且结构复杂的多发动脉粥样硬化斑块。且饮食诱导对斑块大小和数量的影响在前三个月即可出现，因此apoE基因缺陷小鼠可以用来研究HHcy在动脉粥样硬化硬化早期阶段的影响。 目前也已有研究成功构建了 apoE基因缺陷小鼠HHcy动脉粥样硬化模型，并指出高蛋氨酸诱导两月后已有动脉粥样硬化病理改变，并发现其动脉粥样硬化斑块是不稳定的。
综上所述，三种基因缺陷小鼠模型均各有利弊。虽然MTHFR基因缺陷或者apoE基因缺陷HHcy小鼠可以观察到类似动脉粥样硬化早期病变的主动脉脂质沉积，但也必须经过饮食诱导。饮食诱导无非是在饮水或食物中添加蛋氨酸/同型半胱氨酸，或者使叶酸或维生素B12缺乏。这种方法可控性差，个体差异较大。一定浓度的蛋氨酸灌胃可以控制小鼠摄入的蛋氨酸剂量，但对小鼠的刺激较大，非药物因素致死率增加。因此建立一种重复性高、可控性好的HHcy动脉粥样硬化模型势在必行。发明内容
本发明的目的是，提供一种自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型的制备方法。
本发明的第二个目的是，提供一种利用上述制备方法制备获得的转基因小鼠动物模型。
为了实现上述目的，本发明提供了一种自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型的制备方法，包括以下步骤(1)选取U9/S6/SvEv品系雄性小鼠的ES细胞SCR012作为基因打靶所用细胞，并构建 Mthfr打靶载体；(2)利用电穿孔法进行基因打靶，筛选阳性ES克隆；(3)利用显微注射方法将阳性ES克隆植入C57BL/6J小鼠的囊胚；(4)利用嵌合体制备方法将注射后的囊胚移植入C57BL/6J雄性小鼠与CBA雌性小鼠的杂交一代假孕小鼠受体子宫内；(5)将嵌合率大于50%的成熟小鼠与C57BL/6J雌性小鼠进行交配，后代小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定，获得Mthfr基因剔除杂合小鼠。
为实现本发明第二个目的，本发明提供一种利用上述制备方法获得的转基因小鼠动物模型，所述转基因小鼠动物模型为apoE和Mthfr双重基因缺陷的HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型。
本发明的优点在于，apoE和MTHFR双重基因缺陷的HHcy动脉粥样硬化模型更好地结合了两种基因缺失模型的特性，既可使其能够自发形成HHcy血症并发展为动脉粥样硬化，又最大程度地避免了除Hcy以外其他致动脉粥样硬化因素的作用。该动物模型重复性高、可控性好，易于饲养繁殖，弥补了现有动物模型的不足，且更稳定、更符合临床特点， 为HHcy相关动脉粥样硬化的发生机制研究及干预措施的探索提供了更好的平台。利用这个平台，对于HHcy动脉粥样硬化相关性以及药物治疗的研究将进一步深入且更加科学。
图1为打靶质粒构建示意图。
图2为质粒酶切鉴定图，打靶载体用EcoRI、HindIII酶切，目的条带分别为 EcoRI :173bp、5641bp、7407bp ；HindIII :5999bp、7222bp。
图3为ES克隆鉴定结果PCR电泳图，Marker: Ikb ladder ;PCR阳性条带4071bp。
图4为ES克隆鉴定结果PCR电泳图，Marker: Ikb ladder ;PCR阳性条带2779bp。
图5为小鼠尾巴DNA PCR 5’ arm鉴定图。
图6为小鼠尾巴DNA PCR 3’ arm鉴定图。
图7为apoE和MTHFR双重基因缺陷小鼠及对照组小鼠。
图8为各组小鼠血浆Hcy浓度，与ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR(+\_)小鼠Hcy水平显著增高，呈现统计学意义(P<0. 05)。
图9为各组小鼠血浆TC、TG水平，其TC、TG水平较野生型和MTHFR (+\_)小鼠有显著升高，但与ApoE(_\_)小鼠相比无明显差异。
图10为各组小鼠主动脉根部形态学改变(X 200)，其中图10AU0B为4月龄野生型小鼠和ApoE(-\_)小鼠，其主动脉内膜光滑，内弹力膜呈波浪状；图IOC为MTHFR(+\_)小鼠，其主动脉内膜增厚，欠光滑，但未见斑块生成；图IOD为ApoE (-\-)*MTHFR(+\_)小鼠， 其主动脉根部出现斑块，体积较大，表面覆盖一层薄的纤维帽，并有大量炎性细胞浸润，斑块中胶原比例明显增高，且有斑块内埋藏纤维帽和斑块内出血。
图11为各组小鼠主动脉根部BiP和CHOP mRNA表达，RT-PCR结果表明，与ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE(-\-)*MTHFR(+\_)小鼠主动脉根部 BiP 和 CHOP 的 mRNA 表达水平显著增高，半定量结果有统计学意义(P<0. 05)。
图12为各组小鼠主动脉根部BiP和CHOP蛋白水平的表达，Western-blot的结果表明，与 ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR(+\_)小鼠主动脉根部 BiP 和CHOP的蛋白表达水平显著增高，有统计学意义(P<0. 05)。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明提供的自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型的制备方法的具体实施方式
，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1、制备自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型 1.选取基因打靶所用细胞U9/S6/SvEv品系雄性小鼠ES细胞SCR012。
2.构建Mthfr打靶载体质粒(见图1)，质粒酶切鉴定(见图2)。
3.将打靶载体线性化将80ug Mthfr KO Vector质粒DNA用NotI(酶用量100U) 酶切线形化，酶切体积200ul、37°C消化过夜；走胶分离纯化，(胶回收试剂盒用QIAquick Gel Extraction Kit (Cat No. 28706))；随后乙醇沉淀，IOOul 无菌的 PBS 重悬。
4. ES细胞打靶及筛选E S细胞SCR012 ；DNA量35 μ g ；电转仪型号Bio — Rad Gene Pulser (Cat. No. 165-2105)；电穿孔条件电压240 ν，电容500 μ F;实际通电时间 10. 5ms，实际电压256 ν ；克隆筛选条件300 μ g/ml G418、2uM GanC筛选8天；挑取抗性克隆共96个，提供DNA样本96份。
5. ES细胞基因组鉴定 1)鉴定策略(图1)5，PCR鉴定鉴定引物5L&ne0R，目的片段为4071bp，退火温度65°C ； PCR 引物序列Neo-R: CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA ；5L: GTGGCCCCACACTCTTCAAAGTTT。
3，PCR鉴定鉴定引物3R&neoF,目的片段为2779bp,退火温度:65°C ； PCR 引物序列Neo-F: CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC ；3R: CATGAAGGCCAGGCCAGGGTATTGG。
2) ES克隆鉴定结果共鉴定药物抗性克隆96个，其中双臂均发生正确同源克隆数12个，阳性率为12. 5%。 PCR电泳图见图3、图4。
6.利用显微注射方法将阳性ES克隆植入小鼠的囊胚。显微注射用囊胚来源于 C57BL/6J小鼠超数排卵，自然受孕，体内发育至囊胚阶段。
利用嵌合体制备方法将注射后的囊胚移植入C57BL/6J( $ )与CBA(早)的杂交一代假孕小鼠受体子宫内。将嵌合率大于50 %的成熟小鼠与C57BL/6J雌性小鼠进行交配，后代灰色小鼠经提取尾基因组DNA进行鉴定(鉴定策略同上)，获得本发明所述小鼠7只。
小鼠尾巴DNA PCR鉴定见图5、图6。
鉴定的引物和条件重组-Pl :GGGGAACTTCCTGACTAGGG ； 公共-P2:ATAACACGTTCCAGGCGAAG ； 野生-P3 CCCAGGGATGGATAACAGTG ；条带大小homo:560bp heter 560+354bp wt 354bp tm: 60 度 30s，30cycles。
实施例2、验证ApoE/MTHFR双重基因缺陷小鼠是否会导致自发性HHcy相关动脉粥样硬化(1)检测模型Hcy和血脂谱的测定如图 8 所示，与 ApoE(-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE(-\-)*MTHFR(+\_)小鼠 Hcy 水平显著增高，呈现统计学意义(P<0. 05);如图9所示，其TC、TG水平较野生型和MTHFR(+\_) 小鼠有显著升高，但与ApoE (-\-)小鼠相比无明显差异。
(2)各组主动脉根部病理形态学改变如图10所示，主动脉根部切片经H&E染色后发现，4月龄野生型小鼠和ApoE(-\_)小鼠的主动脉内膜光滑，内弹力膜呈波浪状(图10A，10B) ;MTHFR(+\_)小鼠的主动脉内膜增厚，欠光滑，但未见斑块生成(图10C);ApoE (-\-)*MTHFR(+\_)小鼠主动脉根部出现斑块， 体积较大，表面覆盖一层薄的纤维帽，并有大量炎性细胞浸润，斑块中胶原比例明显增高， 且有斑块内埋藏纤维帽和斑块内出血(图10D)。
(3)各组小鼠主动脉根部BiP和CHOP mRNA表达如图 11 所示，RT-PCR 结果表明与 ApoE (_\_)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR (+\-)小鼠主动脉根部BiP和CHOP的mRNA表达水平显著增高，半定量结果有统计学意义(Ρ<0· 05)。
(4)各组小鼠主动脉根部BiP和CHOP蛋白质水平的表达如图12所示，Western-blot的结果表明与ApoE (_\_)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (-\") *MTHFR(+\_)小鼠主动脉根部BiP和CHOP的蛋白表达水平显著增高，有统计学意义 (P<0.05)。
综上，根据本发明提供的制备方法获得的apoE和MTHFR双重基因缺陷小鼠模型，由两种基因缺失效应叠加，更好地结合了两种基因缺失模型的特性，既可使其能够自发 HHcy并发展为动脉粥样硬化，又最大程度地避免了除Hcy以外其他致动脉粥样硬化因素的作用，弥补了先前各种动物模型的不足，且更稳定、更符合临床特点，为HHcy对动脉粥样硬化的影响及干预措施的研究提供了更好的动物模型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种自发性HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型的制备方法，包括以下步骤(1)选取U9/S6/SvEv品系雄性小鼠的ES细胞SCR012作为基因打靶所用细胞，并构建 Mthfr打靶载体；(2)利用电穿孔法进行基因打靶，筛选阳性ES克隆；(3)利用显微注射方法将阳性ES克隆植入C57BL/6J小鼠的囊胚；(4)利用嵌合体制备方法将注射后的囊胚移植入C57BL/6J雄性小鼠与CBA雌性小鼠的杂交一代假孕小鼠受体子宫内；(5)将嵌合率大于50%的成熟小鼠与C57BL/6J雌性小鼠进行交配，后代小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定，获得Mthfr基因剔除杂合小鼠。
2.利用权利要求1所述的制备方法获得的转基因小鼠动物模型，其特征在于，所述转基因小鼠动物模型为apoE和Mthfr双重基因缺陷的HHcy相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型。
全文摘要
本发明公开了一种apoE和Mthfr双重基因缺陷的高同型半胱氨酸血症相关动脉粥样硬化转基因小鼠动物模型及其制备方法，该动物模型更好地结合了两种基因缺失模型的特性，既可使其能够自发形成HHcy血症并发展为动脉粥样硬化，又最大程度地避免了除HHcy以外其他致动脉粥样硬化因素的作用。该动物模型重复性高、可控性好，易于饲养繁殖，弥补了现有动物模型的不足，且更稳定、更符合临床特点，为HHcy相关动脉粥样硬化的发生机制研究及干预措施的探索提供了更好的平台。
文档编号A01K67/027GK102517333SQ20111043769
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者陆国平, 陈桢玥 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院