专利名称：一种葡萄无性系品种的育种方法
技术领域：
本发明涉及到果树育种技术领域，具体指利用现代生物技术(物理诱变)手段获得葡萄优良无性系品种即一种葡萄无性系品种的育种方法。
背景技术：
葡萄为葡萄科、葡萄属植物，起源于黑海和地中海沿岸，是分布最广泛、适应性最强的果树之一，目前全世界已形成数千个品种。在我国，北起黑龙江，南至海南岛，各省市均有栽培。目前国内外对葡萄新品种选育的方法主要有杂交育种、芽变选种，随着现代生物技术的发展，使用组织培养技术、诱变技术、分子标记技术和转基因技术等新型育种技术培育新品种已经成为可能，但成功报道的例子甚少。自然界葡萄容易产生芽变，目前栽培中部分优良品种由自然芽变选择培育成功， 但自然芽变概率较低，利用人工诱变可以大大提高葡萄的变异概率，是选育葡萄优良品种的良好途径，但是利用人工诱变育种葡萄的方法还鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的状况，提供一种葡萄无性系品种选育的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种葡萄无性系品种选育的方法，通过人工物理诱变的方式，获得抗病、早熟、优质的葡萄优良单株，该方法包括育种目标的的确定、育种材料的选取、物理诱变剂量的选择、苗木的培养、变异单株的筛选、变异性状的分子鉴别等，具体包括下述步骤(1)育种目标的确定以抗病、早熟、优质为主要育种目标；(2)育种材料的选取一般选择具有良好经济性状(如产量等)但在某些性状(如成熟期、抗病性等需要改良的形状)需要改良的品种；诱变种子从品种纯正、已经进入盛果期、生长健壮、无病虫害的植株上采集；具体为当葡萄果实完全成熟(浙江省一般在8 10 月份)，选择果穗整齐、果粒发育良好的果实采集种子；种子采集后选择饱满的种子，用清水反复冲洗洗净粘在种子表面的果肉，然后用20%多菌灵1000倍液浸泡15分钟消毒，再用清水冲洗后在阴凉处晾干；晾干的种子以5份沙子(沙子相对湿度60%左右)、1份种子混合后置于4 5°C的冰箱中贮藏；第二年2 3月将种子进行分组，每300粒为一组，分为6 组，其中1组为对照，5组用于辐照处理；(3)物理诱变剂量的选择通过预备试验，采用100、150、200、250、300Gy (5组用于
辐照处理，每组对应一组辐射强度)的6tlCo Y射线分别对应五组要辐照处理的种子进行急性辐射，以无辐射处理为对照，剂量率为lOGy/min ；(4)种子的播种种子播种于育苗床上；育苗床基质为体积比6 4的泥炭和谷壳的混合物，基质装盆前用高压灭菌锅进行消毒，育苗基质含有有机质30 45g · kg—1，碱解氮 100 130mg · kg-1，速效磷 80 95mg · kg-1，速效钾 200 230mg · kg-1, ρΗ6· O 7· 5 ；苗床底部铺8 IOcm厚的卵石、再铺4 6cm厚的沙子，上层铺25 30cm厚育苗基质；将处理和对照的种子均勻播种于苗床上，行株距IOX IOcm;播种后注意苗床基质相对湿度保持60 70% ；(5)苗木的管理播种后14 15天发芽，当小苗长至5 6叶时定植于大棚设施中；畦宽2. 5m，定植前挖定植沟，定植沟内加疏松且已经消毒的土壤，株距0. 5m，大棚内的温度保持20 25°C，大棚内土壤相对湿度保持60 65%，空气相对湿度保持65 75%， 培育3 6年后植株开花结果；(6)变异单株的筛选在苗木生长期间，仔细观测不同处理的生物学、植物学性状，选择与对照(对照组苗木)在抗性、植物学和生物学特性等方面有明显差异的单株；(7)变异性状的分子鉴别选择优良单株，采集该优良与对照的幼嫩叶片，利用 ISSR或者SSR标记技术进行变异基因分析；(8)优良单株的区域试验和推广通过生物学、植物学性状以及结果特性的观测， 结合分子鉴别，获得优良单株；将该单株进行无性繁殖，选择不同的区域进行试验，以明确其适种范围，并总结适合该单株的一整套栽培措施。上述步骤中育苗基质优选含有有机质38g · kg—1，碱解氮IlOmg · kg—1，速效磷 87mg · kg-1，速效钾 237mg · kg-1, ρΗ6· 3。上述步骤中苗床底部优选铺IOcm厚的卵石、再铺5cm厚的沙子，上层铺25cm
厚育苗基质。上述步骤中播种后苗床基质相对湿度优选保持60%。上述步骤(7)中利用ISSR或者SSR标记技术进行变异基因分析其葡萄最优 ISSR-PCR 的最佳反应体系20μ L PCR 反应体积中，MgC121. 75mmol/L, dNTPsO. 20mmol/L, Taq 聚合酶 1.0U，引物 0. 2ymol/L，10XBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2μ L ；PCR反应程序94°C预变性5min，94°C变性45s，50 60°C退火lmin，72°C延伸 1. 5min，进行40个循环，最后72°C延伸7min。)其中引物为利用(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA)8T、(GA)8C、(CT)8Τ、(CT)8Α、 (CT) 8G、(CA) 8Α、(CA) 8G、(TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA、 (GA) 8YT、(GA) 8YC, (CT) 8RG、(CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 等供沈条引物( 条引物同时使用)能扩增出清晰的谱带且重复性较好。上述步骤(8)所述的无性繁殖如扦插、嫁接等。本发明的优点和有益效果1.本发明成功采用6tlCo Y射线人工诱变，获得变异概率高、操作安全稳定的葡萄育种。2.本发明的葡萄育种方法，通过确定照射剂量、剂量率、照射后种子的播种环境条件控制、苗木的管理、筛选、变异性状的分子鉴别、优良单株的区域试验和推广等，得到一套完整的抗病、早熟(成熟期可提早10 15天)、优质的葡萄人工诱变育种方法，成功实现了葡萄人工诱变育种。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述(以“鄞红”葡萄品种诱变选育新品种为例)，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例以“鄞红”为例，“鄞红”为宁波地区推广的优良品种，属欧美杂交种，其树势强，叶色浓，叶面光滑无毛。一般穗重500 700克。果实椭圆形，平均粒重12克左右。果皮紫红色，风味浓郁。宁波地区大棚保护地栽培之成熟期一般为7月底至8月中旬。(1)育种目标的确定以早熟为主要育种目标，其它特性与“鄞红”相近。(2)育种材料的选取诱变种子从品种纯正、已经进入盛果期、生长健壮、无病虫害的“鄞红”植株上采集。当葡萄果实完全成熟，浙江省一般在8月中旬左右，选择果穗整齐、果粒发育良好的果实采集种子，种子采集后选择饱满的种子，用清水反复冲洗洗净粘在种子表面的果肉，然后用20 %多菌灵1000倍液浸泡15分钟消毒，再用清水冲洗后在阴凉处晾干。晾干的种子用5份沙子(沙子相对湿度60%左右)、1份种子混合后置于5°C左右的冰箱中贮藏；第二年2 3月将种子进行分组，每300粒为一组，分为6组，其中1组为对照 (不进行辐照处理)，5组用于辐照处理。(3)物理诱变剂量的选择通过预备试验，采用100、150、200、250、300Gy(即需要
辐照处理的5组用于辐照处理种子，每组对应一种辐照强度)的6tlCo Y射线处理，以无辐射处理为对照，剂量率为lOGy/min。(4)种子的播种种子(辐照处理和未辐照处理的种子)播种于育苗床上；育苗床基质为体积比6 4的泥炭和谷壳的混合物，基质装盆前用高压灭菌锅进行消毒，基质含有有机质 38g · kg—1，碱解氮 IlOmg · kg—1，速效磷 87mg · kg—1，速效钾 237mg · kg—1，ρΗ6· 3。苗床底部一般铺IOcm左右厚的卵石、再铺5cm厚左右的沙子，上层铺育苗基质，约25cm厚。将处理和对照的种子均勻播种于苗床上，行、株距10 X IOcm0播种后注意苗床基质相对湿度保持60%左右。(5)苗木的管理播种后15天左右发芽，当小苗长至5 6叶时定植于大棚设施中。一般畦宽2. 5m，定植前挖定植沟，定植沟内加疏松且已经消毒的土壤，株距一般0. 5m, 大棚内的温度一般保持20 25°C，温度过高时注意通风，大棚内土壤相对湿度保持60 %左右、空气相对湿度保持70%左右，一般培育3年后植株开花结果。(6)变异单株的筛选在苗木生长期间，仔细观测不同处理的生物学、植物学性状，选择与对照在抗性、植物学和生物学特性等方面有明显差异的单株。(7)变异性状的分子鉴别根据育种目标，选择成熟期较早且其余经济性状同“鄞红”相似的优良单株，采集该优良单株与对照组单株的幼嫩叶片，利用ISSR或者SSR标记技术进行变异基因分析；葡萄ISSR-PCR 的反应体系20μ L PCR 反应体积中，MgC121. 75mmol/L, dNIPsO. 20mmol/L，Taq 聚合酶 1. 0U，弓 | 物 0. 2 μ mol/L，IOXBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2μ L ；所述PCR反应的反应程序为94°C预变性5min，94°C变性45s，50-60°C退火lmin， 72°C延伸1.5min，进行40个循环，最后72°C延伸7min。采用的引物为(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA)8T、(GA)8C、(CT)8Τ、(CT)8Α、(CT)8G、 (CA) 8Α、(CA) 8G、(TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA, (GA) 8YT、 (GA) 8YC, (CT) 8RG、(CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 共洸条引物，扩增出清晰的谱带且重复性较好。(D = (A, G，T)，V = (A，C，G)，R = (A, G)，Y = (C，T))(8)优良单株的区域试验和推广通过生物学、植物学性状以及结果特性的观测， 结合分子鉴别，获得优良单株。我们以“鄞红”葡萄诱变，获得一优良单株，其综合性状与“鄞红”形似，但成熟期比 “鄞红”可提早15天左右；将该单株进行无性繁殖(如扦插、嫁接)，在宁波地区进行三点二年试验，试验结果表明适合宁波地区推广，并总结了适合该单株的一整套栽培措施。
权利要求
1.一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于通过人工物理诱变的方式，获得抗病、早熟、优质的葡萄优良单株。
2.根据权利要求1所述的一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于育种方法的具体步骤包括(1)育种目标的确定以抗病、早熟、优质为主要育种目标；(2)育种材料的选取选择具有良好经济性状但在某些性状需要改良的品种，诱变种子从品种纯正、已经进入盛果期、生长健壮、无病虫害的植株上采集；当葡萄果实完全成熟， 选择果穗整齐、果粒发育良好的果实采集种子，种子采集后选择饱满的种子，用清水反复冲洗洗净粘在种子表面的果肉，然后用20 %多菌灵1000倍液浸泡15分钟消毒，再用清水冲洗后在阴凉处晾干；晾干的种子用5份沙子、1份种子混合后置于4 5°C的冰箱中贮藏；第二年2 3月将种子进行分组，每300粒为一组，分为6组，其中1组为对照，5组用于辐照处理；(3)物理诱变剂量的选择通过预备试验，采用100、150、200、250、300Gy的6tlCoγ射线分别对应五组要辐照处理的种子进行急性辐射，以无辐射处理为对照，剂量率为IOGy/ min ；(4)种子的播种种子播种于育苗床上；育苗床基质为体积比6 4的泥炭和谷壳的混合物，基质装盆前用高压灭菌锅进行消毒，育苗基质含有有机质30 45g · kg—1，碱解氮 100 130mg · kg-1,速效磷 80 95mg · kg-1,速效钾 200 230mg · kg-1, ρΗ6· 0 7· 5 ；苗床底部铺8 IOcm厚的卵石、再铺4 6cm厚的沙子，上层铺25 30cm厚育苗基质；将处理和对照的种子均勻播种于苗床上，行株距IOXlOcm ；播种后注意苗床基质相对湿度保持 60 70% ；(5)苗木的管理播种后14 15天发芽，当小苗长至5 6叶时定植于大棚设施中； 畦宽2. 5m，定植前挖定植沟，定植沟内加疏松且已经消毒的土壤，株距0. 5m，大棚内的温度保持20 25°C，大棚内土壤相对湿度保持60 65%，空气相对湿度保持65 75%，培育 3 5年后植株开花结果；(6)变异单株的筛选在苗木生长期间，仔细观测不同处理的生物学、植物学性状，选择与对照在抗性、植物学和生物学特性方面有明显差异的单株；(7)变异性状的分子鉴别选择优良单株，采集该优良与对照的幼嫩叶片，利用ISSR或者SSR标记技术进行变异基因分析；(8)优良单株的区域试验和推广通过生物学、植物学性状以及结果特性的观测，结合分子鉴别，获得优良单株；将该单株进行无性繁殖，选择不同的区域进行试验，以明确其适种范围，并总结适合该单株的一整套栽培措施。
3.根据权利要求2所述的一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于所述步骤 (4)中育苗基质含有有机质38g · kg—1，碱解氮IlOmg · kg—1，速效磷87mg · kg—1，速效钾 237mg · kg-1, pH6. 3。
4.根据权利要求2所述的一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于所述步骤中苗床底部铺IOcm厚的卵石、再铺5cm厚的沙子，上层铺25cm厚育苗基质。
5.根据权利要求2所述的一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于所述步骤中播种后苗床基质相对湿度保持在60%。
6.根据权利要求2所述的一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于所述步骤(7)中利用ISSR或者SSR标记技术进行变异基因分析其葡萄ISSR-PCR的反应体系为20μ LPCR 反应体积中，MgCl2L 75mmol/L，dNTPs 0. 20mmol/L, Taq 聚合酶 1. 0U，引物 0. 2 μ mol/L, IOXBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2 μ L0
7.根据权利要求6所述的一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于所述PCR反应的反应程序为94°C预变性5min，94°C变性45s，50 60°C退火lmin，72°C延伸1. 5min， 进行40个循环，最后72°C延伸7min。
8.根据权利要求6所述的一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于所述的引物为(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA) 8T、(GA) 8C、(CT) 8Τ、(CT) 8Α、(CT) 8G、(CA) 8Α、(CA) 8G、 (TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA, (GA) 8YT、(GA) 8YC, (CT) 8RG、 (CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 共 26 条引物。
9.根据权利要求2所述的一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于步骤(8)所述的无性繁殖为扦插或嫁接。
全文摘要
本发明公开一种葡萄无性系品种的育种方法，其特征在于通过人工物理诱变的方式，获得抗病、早熟、优质的葡萄优良单株。具体为育种目标确定→采集饱满成熟的种子→物理诱变——剂量100-300Gy的60Coγ射线、以剂量率为10Gy/min→种子播种→3～6年苗木培育→单株选择通过生物学、植物学性状、经济特性等的观测选择→变异性状的基因分析→优良单株区域试验→栽培措施总结→推广。本发明的方法获得的优良单株具有抗病、早熟、优质等优点。
文档编号A01H1/04GK102524055SQ201210005630
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴月燕, 崔鹏, 王忠华 申请人:浙江万里学院