专利名称：一种堆肥发酵滤液对土壤线虫多样性的防控方法
技术领域：
本发明属于环境保护技术领域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌种的应用。更具体的说是一种堆肥发酵滤液对土壤线虫多样性的防控方法。
背景技术：
堆肥化(Composting)是指在有控制的条件下，使有机废弃物在微生物(主要为细菌)作用下，发生降解，并同时使有机物向稳定的腐殖质方向转化的过程。堆肥化后的产物称之为堆肥(Compost)。堆肥过程可以将混合物的体积有效地减少40%-50%，并且可以依靠在高温阶段中代谢产生的热量杀死垃圾中的病原物质。堆肥不是一项新的技术，但用这种方法处理城市固体垃圾，符合环境的利益，因为在堆肥过程中清除或者减少了城市固体垃圾中的毒性并使得最终的产物可以被用来进行再利用。堆肥的程序包括原料的预处理、原料发酵和后处理，堆肥过程受水分、氧含量、C/N比、温度、pH和通风情况等因素的影响。微生物种类繁多，自然界中仅有极少数的微生物得到鉴定，能够存活、培养的种类更是少之又少，至多为微生物总量的1%。目前，国内外对于堆肥中的微生物进行了一系列理论和实践的研究。对于应用堆肥可能出现的环境问题也已经引起了人们的重视，但如何解决这些问题还缺少细致深入的研究，目前，如何提高城市生活垃圾堆肥的质量，解决堆肥应用过程中可能产生的环境问题一直是相关科研人员研究关注的热点。对于堆肥中的微生物组成及堆肥过程中的微生物变化的研究已有诸多报道，但对于将堆肥中微生物分离、应用于其他基质的研究却少有报道。苏云金芽孢杆菌是目前国际上生产量最大并成功地用于防治农、林、贮粮害虫和一些卫生害虫的微生物杀虫剂，苏云金芽孢杆菌在形成芽孢的同时，可以形成一种由杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体，它的主要杀虫活性成分是伴孢晶体蛋白。研究发现，这种蛋白对多种农林害虫具有特异性杀伤作用。昆虫取食芽孢晶体混合物后，晶体在昆虫体内的中肠碱性环境和蛋白酶的作用下被降解形成杀虫活性蛋白，研究结果表明这些毒蛋白单独作用或不同蛋白间协同作用对昆虫具有不同程度的毒杀作用，进一步加强苏云金芽孢杆菌在防治和控制害虫危害方面的研究，对于保护人类生存环境实现可持续发展具有重大意义。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前产量最大、使用最广的生物杀虫剂。 关于采用苏云金芽孢杆菌发酵滤液用来调节草坪基质线虫的方法尚为见文献报道。线虫是一类世界性分布的重要植物病原物，其寄生范围广，环境适应性强，几乎每种作物都受到线虫的侵害。随着人们环保意识的增强，利用杀线虫微生物开发生物杀线虫剂，具有十分巨大的经济效益与环境效益。目前国内外已有研究报道说明不同的微生物对线虫的活动有抑制作用。黄福常等研究发现不同浓度，不同PH值的黑曲霉发酵滤液均具有杀线作用，其中以发酵原液PH为3. O时杀线效果最佳，其杀线作用为100%。Neidig等研究发现荧光假单胞菌的次生代谢产物对食细菌类线虫有强烈的抑制作用，从而减少土壤中细菌的天敌数量。徐华潮等(2010)在室内条件下测定了 17株苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白对松材线虫的杀线活性，发现菌株020、RBT-200701的伴胞晶体蛋白对松材线虫有明显的毒杀作用，其校正死亡率分别大于80%和70%。本实验通过向草坪土壤基质中加入苏云金芽孢杆菌的发酵过滤液，研究了不同堆肥微生物过滤液对土壤线虫的影响，为土壤线虫的生物防治提供依据。
发明内容
本发明采用的苏云金芽孢杆菌(拉丁名feci77w5·菌种保藏号CFCC10206，保藏单位中国林业微生物菌种保藏管理中心，对外可以提供。生理生化特性细胞呈革兰氏阳性，杆状，大小为I. 0-1. 2X3-5 μ m。形成半孢晶体，对阿拉伯糖甘露醇不产酸产淀粉酶，硝酸盐还原到亚硝酸盐。苏云金芽孢杆菌毒性对人、畜低毒，大鼠口服急性LD5tl 852. 7-856. 7毫克/公斤， 对家禽、鸟类、鱼、畜等低毒。本发明将配制成不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液接种到草坪建植体系中。通过研究不同浓度的苏云金芽孢杆菌发酵滤液对土壤线虫的防治方法，为草坪植物的建植提供依据。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案
一种堆肥发酵滤液对土壤线虫多样性防控方法，其特征在于按如下的步骤进行
(I)苏云金芽孢杆菌的分离苏云金芽孢杆菌本身有市售；也可以分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；本发明从生活垃圾堆肥所得到的苏云金芽孢杆菌生理生化性质与市售的苏云金芽孢杆菌相同，分离的方法如下
1)将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10—1浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6几种浓度的堆肥稀释液；分别用移液枪吸取O. I毫升浓度为10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀释液，注入到牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照；用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整牛肉膏蛋白胨固体培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板倒置于37°C恒温培养箱中培养I天；
2)苏云金芽孢杆菌发酵液的制备
A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培养；选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；根据生长曲线获得微生物生长至稳定期的时间，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每mL菌液中的活菌数；
B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中，180 r/min37°C培养8 12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每 mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为O. 22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；其中苏云金芽孢杆菌的菌落数(个)
权利要求
1.一种堆肥发酵滤液对土壤线虫多样性的防控方法，其特征在于按如下的步骤进行(I)苏云金芽孢杆菌的分离1)将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10—1浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6几种浓度的堆肥稀释液；分别用移液枪吸取O. I毫升浓度为10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀释液，注入到牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照；用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整牛肉膏蛋白胨固体培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板倒置于37°C恒温培养箱中培养I天；2)苏云金芽孢杆菌发酵液的制备A.将分离出的苏云金芽孢杆菌菌种纯化培养2代；然后接入装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培养，选用600nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线，根据生长曲线获得苏云金芽孢杆菌生长至稳定期的时间；B.取纯化苏云金芽孢杆菌菌种，接入装有50mL高氏一号液体培养基的250mL三角瓶中，180 r/min37°C培养8 12 h至稳定期，取稳定期的菌种采用显微镜直接计数法计算每 mL菌液中的活菌数，将稳定期的菌液进行抽滤，抽滤后将菌液通过孔径为O. 22um的微孔滤膜，获得的过滤液则为微生物发酵后的过滤液；3)稀释苏云金芽孢杆菌发酵液取一部分过滤液分别稀释至4倍滤液和8倍滤液，备用；4)堆肥发酵滤液对土壤线虫防控以高14cm直径20cm塑料花盆为容器构建草坪建植体系，每个花盆中分别加入2kg草坪土壤,播种饱满的高羊茅草种3g，待草坪植物生长5cm时，分别向花盆中加入IOml苏云金芽孢杆菌发酵液，草坪培植75d后，分离鉴定各处理线虫的种类及数量，分析线虫多样性特征；其中的纯化培养2代培养指的是用接菌环直接挑起待纯化的菌落，接种到事先准备好的高氏一号平板固体培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，将培养皿倒置于37°C恒温培养箱中培养I天，此过程为纯化一代，从纯化一代的菌种中挑取菌落再重复此过程为纯化二代。
全文摘要
本发明公开了一种堆肥发酵滤液对土壤线虫防控的方法，它是在直径为6.5cm的培养皿中加入30g草坪土壤，分别向土中加入150μl不同浓度的含有苏云金芽孢杆菌的堆肥微生物发酵滤液，对照组加入无菌液体培养基，每个培养皿中均匀的撒入50粒饱满的高羊茅种子，室温种植，待种子萌发后测定各项指标。实验结果表明向草坪土壤基质中加入苏云金芽孢杆菌发酵液不仅可以抑制土壤线虫的总量，抑制植物寄生类线虫的生长，改变土壤线虫的群落组成，同时可以增强草坪植物的抗逆性，促进草坪植物的生长。
文档编号A01N63/02GK102599195SQ20121005198
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者多立安, 程田, 赵树兰 申请人:天津师范大学