专利名称：微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法
技术领域：
本发明属于垃圾堆肥在城市草坪建植技术领域中的应用，涉及采用微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法。
背景技术：
近年来，由生活垃圾引发的环境污染问题已成为社会广泛关注的焦点之一。随着我国人民生活水平的日趋提高，城市生活垃圾产生量也随之增加。将生活垃圾堆肥用作草 坪基质，不但可以避开食物链，同时又解决了垃圾的出路问题。垃圾堆肥具有良好的理化性质、丰富的养分，是替代土壤作为草坪基质的较理想材料。在我国人口众多，土地资源相对贫乏，以垃圾堆肥用作草坪基质更具有现实意义。一些草坪植物能够在重金属污染较重的基质中生长，且生长速度快、再生能力强，在化学方法和生物方法协同修复垃圾堆肥重金属中具有较大的应用价值。因此垃圾堆肥作为草坪基质的同时，其重金属又能得到草坪植物的修复，这样既增加了垃圾堆肥的应用潜力又提高了其使用的安全性。目前，我国已初步展开了将生活垃圾堆肥用于园林绿地基质或肥料的科研工作，垃圾堆肥通常以肥料的形式加入土壤，可以改善土壤性质，提高草坪草生物量、叶绿素含量等。但垃圾堆肥中含有高浓度的重金属，在其改善土壤、土壤植物和微生物的同时，也对它们产生危害。所以，提出若想将垃圾堆肥应用于实际必须去除其中的重金属的想法。垃圾堆肥施用过程中，如何防止或者减少重金属进入土壤和地下水产生，已成为要解决的一大问题。研究发现，添加EDTA可以显著提高重金属在供试草坪植物中的富集量。利用EDTA协同植物修复的同时，由于EDTA以及EDTA与重金属螯合形成的复合物具有很强的溶解性和生物毒性，且在土壤中很难被光、化学物质以及生物降解，所以很可能会引起污染深层土壤及地下水污染等环境问题。但是NTA (Nitrilotriacetic acid),在过去50年一直被应用于除垢剂，在分析化学中用作配位滴定剂和掩蔽剂，在催化动力学分析中常作为活化剂。然而关于微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法，未见文献报道。微生物修复技术弥补了植物修复法、化学浸提法、化学浸提协同植物修复等方法成本高、施用有局限性等缺点。实验证明弗兰克菌属对一定浓度的Cu、Co、Ni、Cd和Hg敏感性不强。Zhou等(2007)表明菌根能消减由玉米根系吸附的Cu向地上部运输。在微生物培养基中加入了不同浓度的Cu、Hg、Pb、Cd和Cr 5种重金属,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌进行胁迫培养，结果发现Hg、Cd毒性较强，2种细菌的增殖在高浓度时受到抑制，枯草芽孢杆菌更为敏感，当重金属浓度>50 mg/L后，5种重金属对两种细菌的毒性顺序为Hg>Cd>Cu>Cr ^ Pb。微生物修复的一个重要特性是能耐受高浓度的重金属离子，常见的如Cu、Zn、Ni等。针对这一特点，目前有研究者开始尝试采用复合菌群来联合进行修复。复合微生物由两种或两种以上微生物按合适比例共同培养组成，能够充分发挥群体的联合作用优势，实验表明接种复合微生物的垃圾堆肥其堆肥化效率显著提高，并且可以提高种子的萌发率。
发明内容
本发明通过对草坪堆肥基质渗漏体系中重金属富集、淋溶等的研究，系统地探讨在微生物、NTA强化植物修复的同时重金属淋溶迁移的潜在风险，并提出相应的防治方法。为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容
一种微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法，其特征在于按如下的步骤进行
(1)实验材料准备
试验选用多年生高羊茅arundinacea L.)为实验材料；生活垃圾堆肥取自天津市小淀堆肥厂；供试土壤取0-20 cm深的表层土；堆肥和园土经风干后分别过2 _筛备用；隔层材料为由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成；枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；淋溶液用(NH4)2SO4,Na2SO4,K2SO4,MgSO4' Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、H2SO4 配制出 SO42' NO3' Cl' NH+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+ 浓度分别为14. 96,6. 54、I. 68,3. 71,0. 82、I. 38,0. 64 和 0. 78 mg/L，并用 HCl 调配 pH 为 5. 5-6 的淋溶液备用；
(2)实验方法
1)草坪基质堆肥利用与隔层设置
选用PVC管直径为7. 5cm, 25cm的长管，管底部固定有直径为0. 2 mm的尼龙网以支撑管内的土和堆肥，将管吊起，管的下方配有锥形瓶接渗滤液；
2)在PVC管中装入500g风干的园土，铺平，再装入水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成，再装入280g堆肥，铺平于隔层之上；
3)微生物菌剂与草坪基质隔层体系的建立 将0.6 g高羊茅播于PVC管中，播种IOd后，
I中加入I. 4 mL蒸馏水；
II中加入0.7 mL牛肉膏蛋白胨培养基和0.7 mL高氏一号培养基；
III中加入I. 4 mL枯草芽孢杆菌；
IV中加入I. 4 mL放线菌；
V中加入0. 7 mL液体枯草芽孢杆菌和0. 7 mL液体放线菌的复合剂；
接菌后，草坪植物再生长30d，刈割，将刈割下的草坪植物地上部置于80°C的烘箱中烘干至衡重，记地上生物量；
4)刘割第二天用150mL人工淋溶液,相当于34. 0 mm的降水量,进行第一次淋洗，之后每7 d淋洗一次，每次150mL，共4次淋入600 mL，4次分别称重，并收集于同一个锥形瓶中，混合均匀待测；其中高羊茅种植期间均用自来水浇灌，保持其整体田间持水量为60-65%。种植期间室内的温度和相对湿度分别为14-25°C和30_55%，光照强度为350-800// mo I m 2 s 1 ；
5)利用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cr、Cu、Pb和Ni的含量变化。本发明所述的沸石为天然沸石，筛取粒径小于4_的；蛭石取自日本弘洋园公司，取粒径小于4mm的；锯末取自加工厂废弃下脚料，以上材料均80°C烘干至恒重，备用。本发明所述的枯草芽孢杆菌、放线菌均有市售。也可以采用天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥进行分离。其分离的方法为将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养，用接种针挑取活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50 mL液态的牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养12 h，获得本实验用枯草芽孢杆菌；用接种针挑取活化的放线菌菌种，接入装有50 mL液态的高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养96h，获得本实验用放线菌。本发明进一步公开了所述方法在增加重金属在植物体内的富集阻碍Cd，Cr, Cu和Ni的垂直迁移方面的应用；其方法是采用O. 7 mL液体枯草芽孢杆菌和O. 7 mL液体放线菌的复合剂以及水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成隔层。本发明的实验结果表明水平隔层铺与土壤至上、堆肥之下，可以减少垃圾堆肥中的有害物质和重金属向土壤中迁移，使草坪植物在化学螯合剂诱导下或者微生物协同下，增加其吸收堆肥中的重金属的时间和重金属在其体内的富集，并减少重金属向深层土壤的迁移。本发明采用的枯草芽孢杆菌(拉丁学名Bacillus subtil is )(保藏号CGMCC NO2548)，中北生物科技有限公司，对外可以提供。中国专利号为ZL200710062503. I。生理生化特性枯草芽孢杆菌菌体细胞为短杆状，有芽孢，在显微镜下观察菌体的大小为O. 4 0.8 μ mX 2. 3 3.7 μ m。菌体细胞呈较粗壮的杆状，排列不整齐。革兰氏染色呈阳性。在固体培养基表面，菌体形成半透明的浅黄色菌落，菌落粘稠，边缘不整齐。本发明公开的土壤放线菌发酵液与申请号200610122277. 7公开的相同。本发明采用天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥进行分离得出的枯草芽孢杆菌、放线菌与现有文献报道的特性相同，(保藏号CGMCC NO 2548 ；CCTCC NO M206067菌株)固未保藏。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌中具有应用潜力的菌种之一。近年来国内外对于芽孢杆菌应用方面的研究日益增多。放线菌可以促进植物新陈代谢，提高植物抗性。本发明将配制成不同浓度的枯草芽孢杆菌发酵液、放线菌发酵滤接种到草坪建植体系中。通过研究不同浓度的枯草芽孢杆菌发酵滤液、放线菌发酵滤液对高羊茅种子萌发的影响，为草坪植物的生态建植提供依据。本实验研究结果表明，综合来看复合微生物对增加重金属在植物体内的富集作用，和对阻碍Cd，Cr, Cu和Ni的垂直迁移都最为显著。其中枯草芽孢杆菌对阻碍Pb的垂直迁移最为显著。本发明更加详细的孩子被方法如下
I实验材料与方法
I.I 土壤、堆肥与草坪植物 (I)实验用植物
本试验选用我国北方比较常见的多年生高羊茅arundinacea L.)为实验材料。(2)实验用堆肥和土壤及其理化
生活垃圾堆肥取自天津市小淀堆肥厂。供试土壤取自天津师范大学实验地0-20 cm深的表层土。堆肥和园土经风干后分别过2 _筛备用。、
堆肥理化性质为pH 7. 62，有机质含量12. 12%，全氮5. 18%，有效磷77. 92 mg/Kg,饱和含水量0. 76 mL/g。其重金属Cd，Cr，Cu，Pb，Ni背景值分别为I. 97，67. 00,238. 73，172. 11,33. 42 //g/g。土壤性质为pH 8. 30，有机质含量 4. 68%，全氮 0. 21%，有效磷 22. 03mg/kg，饱和含水量0. 58 mL/g。其重金属Cd，Cr，Cu，Pb，Ni的背景值分别为0. 18，2. 13，9. 33, 5. 75, 2. 64 //g/g。I. 2隔层材料选择
本实验隔层材料为沸石、蛭石、锯末。沸石为天然沸石，筛取粒径小于4_的；蛭石取自日本弘洋园公司，取粒径小于4mm的。锯末取自加工厂废弃下脚料，以上材料均80°C烘干至恒重，备用。本实验隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成，装入PVC管中共高 4cm。I. 3菌剂的制备
实验用枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥。取10g新鲜堆肥加到90 mL的灭菌水中，配置适宜浓度的堆肥悬浊液，取混合均匀的悬浊液100
#L加入到相应的固体平板培养基上，适温培养，根据菌落形态，挑取和已知枯草芽孢杆菌和放线菌比较相似的菌落进行革兰氏染色法(鉴定细菌)、芽孢染色法(鉴定枯草芽孢杆菌)和印片法(鉴定放线菌)鉴定。根据鉴定结果，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。根据生长曲线获得微生物生长至稳定期的时间，得出枯草芽孢杆菌的稳定期为8_18h，放线菌的稳定期为84-108h。用接种针挑取活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50mL液态的牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养12 h，获得本实验用枯草芽孢杆菌；用接种针挑取活化的放线菌菌种，接入装有50 mL液态的高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养96h，获得本实验用放线菌。I. 4淋溶液制备
根据韩毓(2008)调查全天津市降水pH值范围为4. 00-8. 24，年均值为5. 59，属酸性降/K。本实验用(NH4)2SO4, Na2SO4, K2SO4, MgSO4, Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、H2SO4 配制出 SO42' NO3'Cr、NH+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+浓度分别为 14. 96,6. 54、I. 68,3. 71,0. 82、I. 38,0. 64 和 0. 78 mg/L，并用HCl调配pH为5. 59的淋溶液。I. 5实验方法
(I)草坪基质堆肥利用与隔层设置
PVC管直径为7. 5cm,将其分别截成21cm的短管6根，25cm的长管24根。所有管底部都固定有直径为0. 2 mm的尼龙网以支撑管内的土和堆肥，将管吊起，管的下方配有锥形瓶接渗滤液。土壤耕层为0_20cm的表层土。本实验模拟表层土,设置园土高12cm,堆肥高8cm。制备高为20cm的短管6根，高为24cm的长管24根。短管的制备先装入500g风干的园土，铺平，再装入280g堆肥，铺平于园土之上；长管的制备装入500g风干的园土，铺平，再装入水平隔层，再装入280g堆肥，铺平于隔层之上。 (2)微生物菌剂与草坪基质隔层体系的建立草坪植物选用多年生高羊茅。将0.6 g高羊茅播于PVC管中，每组3次重复，处理见表
I。播种10 d后，I中加入I.4 mL蒸馏水；II中加入0.7 mL牛肉膏蛋白胨培养基和0.7 mL高氏一号培养基；III中加入I. 4 mL枯草芽孢杆菌；IV中加入I. 4 mL放线菌；V中加入0. 7mL液体枯草芽孢杆菌和0.7 mL液 体放线菌的复合。接菌后，草坪植物再生长30 d，刈割(高羊茅均共生长40 d)，将刈割下的草坪植物地上部置于80° C的烘箱中烘干至衡重，记地上生物量。刘割第二天用150 mL人工淋溶液(相当于34. 0 mm的降水量)进行第一次淋洗,之后每7 d淋洗一次，每次150 mL，共4次淋入600 mL。4次分别称重，并收集于同一个锥形瓶中，混合均匀待测。草坪植物种植期间均用自来水浇灌，保持其整体田间持水量为60%。种植期间室内的温度和相对湿度分别为14-25°C和30-55%，光照强度为350-800// mo I nT2 s'表I微生物菌剂接种和隔层处理方案
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(4)重金属含量分析
高羊茅草样均称取0.2 g，用10 mL HNO3和2 mL HClO4在120_140°C下电热板消化，待棕黄色烟消去，所得溶液用1%硝酸定容到25 mL。渗滤液取20 mL，用8 mL HNO3和2 mL此104在120-140°C下电热板消化，待棕黄色烟消去，所得溶液用1%硝酸定容到50 mL。最后利用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属(Cd、Cr、Cu、Pb和Ni)含量。I. 6数据分析
数据分析用EXCEL2003和SPSS 14.0统计软件分析完成。
重金属富集量=重金属浓度*生物量干童。
童金属渗滤比率=(童金属琳洗总量/谁肥中童金属总量)*100%。
2结果与分析
2. I不同微生物菌剂和隔层设置对草坪植物生物量的影响
从表2可以看出隔层可以增加高羊茅的生物量。接种菌剂对草坪植物的生物量有显著的提高0X0. 05)。复合菌剂协同水平隔层(V )对提高高羊茅生物量的影响最为显著，分别比对处理I提高了 18. 8%和34. 2%。
表2不同处理对草坪植物生物量的影响(g/PVC)
权利要求
1.一种微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法，其特征在于按如下的步骤进行 (1)实验材料准备 试验选用多年生高羊茅arundinacea L.)为实验材料；生活垃圾堆肥取自天津市小淀堆肥厂；供试土壤取表层土 ；堆肥和园土经风干后分别过2 mm筛备用；隔层材料为由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成；枯草芽孢杆菌、放线菌分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的生活垃圾堆肥；淋溶液用(NH4)2S04、Na2S04、K2S04、MgS04、Ca(NO3)2、Mg (NO3) 2、H2SO4 配制出 SO42'NO3'Cl'NH+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+浓度分别为 14. 96,6. 54、I. 68、.3.71,0. 82、I. 38,0. 64 和 O. 78 mg/L，并用 HCl 调配 pH 为 5. 5-6 的淋溶液备用； (2)实验方法 .1)草坪基质堆肥利用与隔层设置 选用PVC管直径为7. 5cm, 25cm的长管，管底部固定有直径为O. 2 mm的尼龙网以支撑管内的土和堆肥，将管吊起，管的下方配有锥形瓶接渗滤液； .2)在PVC管中装入500g风干的园土，铺平，再装入水平隔层由下至上分别由20g沸石、.20g蛭石和20g锯末组成，再装入280g堆肥，铺平于隔层之上； .3)微生物菌剂与草坪基质隔层体系的建立 将O. 6 g高羊茅播于PVC管中，播种IOd后， I中加入I. 4 mL蒸馏水； II中加入O. 7 mL牛肉膏蛋白胨培养基和0.7 mL高氏一号培养基； III中加入I. 4 mL枯草芽孢杆菌； IV中加入I. 4 mL放线菌； V中加入O. 7 mL液体枯草芽孢杆菌和O. 7 mL液体放线菌的复合剂； 接菌后，草坪植物再生长30d，刈割，将刈割下的草坪植物高羊茅地上部置于80°C的烘箱中烘干至衡重，记地上生物量； .4)刘割第二天用150mL人工淋溶液,相当于34. O mm的降水量,进行第一次淋洗，之后每7 d淋洗一次，每次150mL，共4次淋入600 mL，4次分别称重，并收集于同一个锥形瓶中，混合均匀待测；其中高羊茅种植期间均用自来水浇灌，保持其整体田间持水量为60-65%;种植期间室内的温度和相对湿度分别为14-25 °C和30_55%，光照强度为.350-800// mo I m 2 s 1 ； .5)利用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cr、Cu、Pb和Ni的含量变化。
2.权利要求I所述的方法，其中沸石为天然沸石，筛取粒径小于4_的；蛭石取自日本弘洋园公司，取粒径小于4mm的；锯末取自加工厂废弃下脚料，以上材料均80°C烘干至恒重，备用。
3.权利要求I所述的方法，其中枯草芽孢杆菌、放线菌分离的方法为将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养，用接种针挑取活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50 mL液态的牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养12 h，获得本实验用枯草芽孢杆菌；用接种针挑取活化的放线菌菌种，接入装有50 mL液态的高氏一号培养基的250 mL三角瓶中，180 r/min适温培养96h,获得本实验用放线菌。
4.权利要求I所述方法在增加重金属在植物体内的富集阻碍Cd，Cr, Cu和Ni的垂直迁移方面的应用；其方法是采用O. 7 mL液体枯草芽孢杆菌和O. 7 mL液体放线菌的复合剂以及水平隔层由下至上分别由20g沸石、20g蛭石和20g锯末组成隔层。
全文摘要
本发明公开了一种微生物与高羊茅联合修复垃圾堆肥重金属渗漏体系的方法，它是,它是在直径为7.5cm，长25cm的PVC管中装入500g风干的园土，装入水平隔层60g，再装入280g堆肥；在管中播种0.6g高羊茅种子,播种30d后，将不同浓度的微生物菌剂和10-20mmol/kg堆肥的NTA钠盐水溶液施于堆肥表面，10d后刈割草，测定重金属Cd，Cr，Cu，Pb和Zn的含量变化。本发明的实验结果表明水平隔层铺与土壤至上、堆肥之下，可以减少垃圾堆肥中的有害物质和重金属向土壤中迁移，使草坪植物在化学螯合剂诱导下或者微生物协同下，增加其吸收堆肥中的重金属的时间和重金属在其体内的富集，并减少重金属向深层土壤的迁移。
文档编号A01G1/00GK102630475SQ201210134880
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者多立安, 贾丽娜, 赵树兰 申请人:天津师范大学