专利名称：产脲酶微生物及其固化地基中重金属的方法
技术领域：
本发明属于微生物及其固化重金属技术领域，具体涉及产脲酶微生物及其固化地基中重金属的方法。
背景技术：
重金属污染是指由于人类的生产和活动，致使环境中重金属含量明显高于其背景值，由于重金属离子具有长期滞留和不可降解的特性，对生态环境造成了极大破坏。随着大规模的城市扩张和建设，许多建筑物建设在废弃的工厂及垃圾场附近，地基中重金属污染严重。重金属元素能通过食物链最终进入生物体内，破坏生物体正常的新陈代谢，严重危害人体健康，已成为不可忽视的环境问题。传统的重金属处理方法主要包括化学沉淀法、离子交换法、蒸发浓缩法、电解法、活性炭和硅胶吸附法和膜分离法等，但这些方法存在去除不彻底、费用昂贵、产生有毒污泥 或其他废料等缺点。因此，研究与开发高效环保型的重金属处理技术和工艺成为研究的热点之一 O现代生物技术的发展，使微生物治理重金属污染逐渐受到重视。微生物处理法是利用细菌、真菌、藻类等生物材料及其生命代谢活动去除和/或积累重金属，从而降低土壤环境中重金属离子的浓度。同传统处理技术相比具有明显优势，如其处理成本低，处理效果好，生化处理后污染物残留量可达到很低水平，因而该技术成为最有发展潜力和市场前景的修复技术。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供产脲酶微生物及其固化地基中重金属的方法，采用本发明微生物固化地基中重金属，具有固化时间短、效果好、成本低，且不会对环境造成二次污染。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是产脲酶微生物圆孢芽孢八叠球菌Sporosarcina antarctica UR53、韩国芽孢八叠球菌 Sporosarcina koreensis UR47、芽抱八叠球菌 Sporosarcina sp. UR31 以及迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus UR41已于2012年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No. 5916、CGMCC No. 5915、CGMCC No. 5913、CGMCC No. 5914，该保藏中心简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101。所述的产服酶微生物Sporosarcinaantarctica UR53>Sporosarcina koreensisUR47>Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacillus lentus UR41 均呈捕圆杆状，有芽抱，无英膜，革兰氏阳性。在NH4-YE即酵母提取物20g/L，硫酸铵10g/L平板上，菌落呈圆形，表面湿润光滑，边缘整齐，菌落大小为l_2mm，菌落呈淡黄色，该菌在4°C -37°C的培养基温度及pH7_9. 5的范围下均能生长。
产脲酶微生物固化地基中重金属的方法，包括如下步骤步骤I :将微生物 Sporosarcina pasteurii、Terrabacter tumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31以及Bacillus lentus UR41单个菌落分别在25°C _37°C条件下在发酵培养基中发酵培养12-60小时得到六种菌液；步骤2 :向步骤I得到的六种菌液中分别加入浓度为O. 01-2mol/L的反应液尿素溶液，菌液体积与尿素溶液体积比为I : 1-1 : 20,再将加入反应液尿素溶液的菌液分别加入到含重金属浓度为O. lg/L-5g/L的重金属溶液中形成混合溶液,重金属溶液与含反应液尿素溶液的菌液体积比为I : 1-1 100，使混合溶液中形成微生物-重金属絮凝体，进而生成不溶于水的重金属碳酸盐。步骤I所述微生物Sporosarcina pasteurii来自于美国模式培养物集存库(American type culture collection),编号为 ATCCl 1859 ;所述微生物 Terrabacter tumescens来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,编号为AS. I. 2690步骤I所述发酵培养基包括酵母提取物10_20g/L，硫酸铵或氯化铵10g/L，pH为7-9. 5。本发明和现有技术相比，具有如下优点I、从已有产脲酶菌株、土样和水样中筛选能固化重金属的微生物，并对未知菌进行分子鉴定，为获得可有效治理重金属污染的微生物菌株提供候选资源；2、尿素在微生物所产生的脲酶的作用下，分解为铵根和二氧化碳，同时使细菌周围PH升高，促使溶液中形成微生物-重金属絮凝体，进一步生成不溶于水的重金属碳酸盐，从而使重金属离子被固化；具有重金属污染固化治理的时间短，效果好，在48小时之内就可以使重金属离子固化率达到90%以上；3、所用的营养液的成本低；4、本发明中所利用微生物为地基(土壤)中本身存在的微生物或其中某种微生物的培养物，营养物质也为天然物质，不会对环境造成二次污染。
图I为依据16S rDNA序列构建的产脲酶菌株系统发育树。图2为培养菌株的生物量(用OD6tltl值表示)及脲酶活性，横坐标为不同种类的产脲酶菌株，纵坐标为生物量及脲酶活性。图3为对不同种类重金属的沉淀移除率，横坐标为不同的种类的产脲酶菌株，纵坐标重金属的固化移除率。图4为重金属沉淀曲线，横坐标为时间，以小时为单位，纵坐标重金属的固化移除率。图5为重金属的固化物的扫描电镜照片；其中图5a为重金属镍的固化物的扫描电镜照片；图5b为重金属铜的固化物的扫描电镜照片；图5c为重金属铅的固化物的扫描电镜照片；图5d为重金属钴的固化物的扫描电镜照片；
图5e为重金属锌的固化物的扫描电镜照片；图5f为重金属镉的固化物的扫描电镜照片。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。实施例产脲酶具有固化重金属能力菌株的分离筛选I、样品采集Sporosarcina pasteurii 来自于美国模式培养物集存库(American typeculture collection),编号为 ATCCl 1859, Terrabacter tumescens来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为AS. I. 2690。2、产脲酶菌株的分离和筛选产脲酶菌株分离自清华大学花圃采集土壤样品。细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性，显红色。本实验利用这一特性，将试验样品先在37°C、5M高浓度尿素条件下富集培养24 h后，杀死不能耐受和利用高浓度尿素的各种微生物营养体细胞，再将处理后的培养液进行梯度稀释，涂布脲酶筛选培养平板，37°C下培养，挑取使培养基颜色变红的菌株，划线分离单菌落，获得的微生物为产脲酶微生物，并利用16S rDNA方法进行鉴定，分别命名为Sporosarcinaantarctica UR53，Sporosarcina koreensis UR47，Sporosarcina sp. UR31, Bacilluslentus UR41 ;图I为依据16S rDNA序列构建的产脲酶菌株系统发育树。产脲酶菌株的培养基重金属固化I、菌株培养配制发酵培养基酵母提取物10_20g/L，硫酸铵或氯化铵10g/L，pH为7-9. 5，将IOOml发酵培养基装入500ml培养瓶中灭菌,分别从平板中挑取单个菌落Sporosarcina pasteurii、 Terrabacter tumescens、 Sporosarcina antarctica UR53、 Sporosarcinakoreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacillus lentus UR41 分别接种于发酵培养基中，在30°C温度下培养，转速为150rpm-250rpm。培养16小时后收集菌液，检测六种菌液的生物量(用0D_值表示)和脲酶活性，检测结果如图2所示。2、重金属的固化分别取六种菌液1ml，加入等体积O. 5mol/L的尿素溶液制成混合溶液，每种菌液制备六种平行样，再将体积为2ml的混合溶液分别加入到体积为O. 5ml，浓度为2g/L的重金属溶液NiCl2、CuCl2、PbCl2、CoCl2、ZnCl2以及CdCl2中，结果表明，所有产脲酶菌株对以上六种重金属的固化去除率都在88%以上，UR47对铜和铅的固化去除率最高，UR31对钴和锌的固化去除率最高，Terrabacter tumescens对镍和镉的固化去除率最高,结果如图3所示。在实验中还分别取菌液Sporosarcina koreensis UR47>Sporosarcina sp.UR31、Terrabacter tumescens,分别加入不同浓度的尿素溶液,菌液体积与尿素溶液体积比分别为I : 1，1 10,1 20，使尿素终浓度为O. 25mol/L，取含尿素溶液的Sporosarcinakoreensis UR47溶液的两个试样，分别加入浓度为O. 5g/L的铜溶液，浓度为5g/L的铅溶液，两个试样分别与铜溶液和铅溶液的体积比为I : 10和I : 100;取含尿素溶液的Sporosarcina sp. UR31溶液的两个试样，分别加入钴和锌溶液，取含尿素溶液的Terrabacter tumescens溶液的两个试样,分别加入镍和镉溶液，金属溶液的浓度和体积比与Sporosarcina koreensis UR47和金属溶液加入相同。结果表明在不同的菌液、尿素、重金属离子浓度条件下，重金属离子的沉积率都在88%以上。3、重金属固化速率分别分析Sporosarcina koreensis UR47 对铜和铅，Sporosarcina sp. UR31 对钴和锌，Terrabacter tumescens对镍和镉的固化去除率随时间的变化,结果如图4所示,这六种重金属的固化过程均主要发生在加入菌液的前20分钟，在48小时达到最大值。对所形成重金属固化物的分析I、重金属固化物的分析对沉淀物质进行XRD分析，所形成的重金属固化物均为重金属碳酸盐。对沉淀物 进行电镜观察，结果如图5所示，其中图5a，图5d是重金属Ni和Co固化物，呈六面体状，边长10-40 μ m ;图5b，图5f是重金属Cu和Cd的固化物，呈球状，直径5_10 μ m ;图5c和图5e是重金属Pb和Zn的固化物，呈针状长度在20-50 μ m。2、重金属固化物的耐酸性质分析微生物所形成的重金属固化物，暴露于空气中，会受到环境中酸雨的威胁，因此，需要检测其耐酸性质。用一系列pH值的硫酸来测试所形成重金属固化物的耐酸性质，pH值分别为0. 5,1. O, I. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O, and 5.5。从 pH 5.5 的硫酸开始测试，滴一滴硫酸到粘结的砂柱上，用放大镜仔细观察两分钟，观察是否有气泡生成。如果没有气泡生成，则可以耐受此PH的酸，然后用下一个pH值的硫酸继续实验，直到有气泡生成，则耐酸能力为产生气泡的前一个硫酸的pH值。结果见表1，六种重金属固化物的耐受酸pH值均为2. 0，能在酸雨环境中稳定存在。表I重金属固化物的耐酸实验结果(+ :无气泡产生-:有气泡产生)
权利要求
1.产服酶微生物Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31 以及Bacillus lentus UR41 已于2012年3月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No. 5916,CGMCC No. 5915、CGMCC No. 5913,CGMCC No. 5914，该保藏中心简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2.根据权利要求I所述的产脲酶微生物Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacillus lentus UR41 均呈椭圆杆状，有芽孢，无荚膜，革兰氏阳性。在NH4-YE即酵母提取物20g/L，硫酸铵10g/L平板上，菌落呈圆形，表面湿润光滑，边缘整齐，菌落大小为l_2mm，菌落呈淡黄色，该菌在40C _37°C的培养基温度及pH7-9. 5的范围下均能生长。
3.产脲酶微生物固化地基中重金属的方法，其特征在于包括如下步骤 步骤 I :将微生物 Sporosarcina pasteurii、Terrabacter tumescens、Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31 以及 Bacilluslentus UR41单个菌落分别在25°C _37°C条件下在发酵培养基中发酵培养12-60小时得到六种菌液； 步骤2 向步骤I得到的六种菌液分别中加入浓度为0. 01-2mol/L的反应液尿素溶液，菌液体积与尿素溶液体积比为I : 1-1 : 20,再将加入反应液尿素溶液的菌液分别加入到含重金属浓度为0. lg/L-5g/L的重金属溶液中形成混合溶液,重金属溶液与含反应液尿素溶液的菌液体积比为I : 1-1 100，使混合溶液中形成微生物-重金属絮凝体，进而生成不溶于水的重金属碳酸盐。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤I所述微生物Sporosarcinapasteurii来自于美国模式培养物集存库(American type culture collection),编号为ATCCl 1859 ;所述微生物Terrabacter tumescens来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为AS. I. 2690
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤I所述发酵培养基包括酵母提取物10-20g/L，硫酸铵或氯化铵10g/L，pH为7-9. 5。
全文摘要
产脲酶微生物Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31以及Bacillus lentus UR41已于2012年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.5916、CGMCC No.5915、CGMCC No.5913、CGMCC No.5914，所述产脲酶微生物固化地基中重金属的方法，将上述四种微生物及微生物Sporosarcina pasteurii和Terrabacter tumescens发酵培养基中发酵培养得到菌液，向菌液中加入反应液尿素，然后加入到含重金属的溶液中形成混合溶液使混合溶液中形成微生物-重金属絮凝体，进而生成不溶于水的重金属碳酸盐；采用本发明微生物固化地基中重金属的方法，具有固化时间短、效果好、成本低，且不会对环境造成二次污染。
文档编号C12R1/07GK102703341SQ201210120838
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者李萌, 程晓辉, 郭红仙 申请人:清华大学