专利名称：一种植物维管组织特异表达启动子及其表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及杨树基因工程技术领域，具体涉及分离得到的杨树(PopulusdeltoidesXP. euramericana cv. ‘Nanlin895’)抗真菌蛋白基因类奇甜蛋白/ / 基因的启动子，其能够驱动一个多核苷酸序列或目的基因在植物细胞中高水平表达，并且在植物维管组织中特异表达。
背景技术：
杨属{Populus )植物作为木本植物中的模式植物，具有优良的实验特性，包括容易进行种间杂交和无性繁殖；生长迅速，并已建立完善的遗传转化体系；基因组相对较小，约450-550Mbp ;易于进行遗传研究。因此，模式植物-杨树的基因表达调控的研究，为弄清木本植物的生长发育调控机理提供证据。启动子是位于结构基因5’端上游的一段DNA序列，能与RNA聚合酶及转录因子特异结合，控制基因转录起始时间和表达的程度，是基因转录最主要的一种调节方式。启动子中包含多种重要的顺式作用元件，其类型直接影响着基因的表达量及表达位点。因此，启动子的分离与分析是研究基因表达调控的关键所在。目前在植物表达载体中使用的大多为组成型的强启动子来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actin启动子,花椰菜叶病毒CaMV 35S启动子和胭脂碱氨酸合成酶Nos启动子。组成型启动子可以使外源基因持续恒定的表达，但是外源基因的组成型表达不仅造成资源的浪费，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因还可能引起基因沉默或共抑制现象，此外还会引发转基因植物安全性问题，因此，有必要在杨树基因工程中采用组织器官特异性或逆境胁迫诱导型启动子，这样既可以是外源基因在杨树特异组织器官中或受到逆境胁迫时高效表达，又不影响植物体的正常生长发育。目前，已经克隆的在杨树组织器官中特异表达或诱导型启动子还比较少。李强等分别从欧洲黑杨和美洲黑杨中克隆到机械损伤诱导表达_Win3基因启动子WINP和WIDP，结果表明二者控制的GUS基因的表达不仅在损伤部位，还具有系统的因伤诱导效应。蒋浩等克隆到杨树树皮储藏蛋白BSP基因启动子，通过烟草转基因验证，该启动子具有韧皮部表达特性，介导⑶S基因在转基因烟草韧皮部特异表达。张爽等从三倍体毛白杨-93中分离得到了 MDCesAP这一木质部纤维素合酶基因启动子，结果表明MDCesAP为木质部特异性启动子。霍秀文等利用PCR方法从拟南芥基因组DNA中扩增得到了转录因子上游的DNA片段，初步表明该启动子为诱导型启动子。随着杨树的广泛栽培，病害的发生越来越严重，在我国，主要的杨树病害有叶锈病、杨树黑斑病、杨树炭疽病、白粉病、黑星病、溃疡病、烂皮病、枝瘤病、干腐病、紫根病等等，已严重威胁杨树的生长和木材质量，单纯依靠常规育种和喷洒农药的方法已不能从根本上解决问题。随着世界生态环境的日益加剧，以及地理和气候的限制，杨树抗性育种显得更加迫切。因此，寻找一周期短、效率高的新育种方法的工作已刻不容缓，并引起国内外林业研究者的普遍关注。
到目前为止，已经研究可用于林木抗真菌病基因工程的诱导型启动子几乎没有，因此，抗真菌基因启动子的研究对于杨树生长和木材质量的提高有着非常重要的作用。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种植物维管组织特异表达启动子，可用于杨树抗 真菌病基因工程育种，可以驱动目的基因在植物细胞中高效表达，并且在植物维管组织中特异表达。本发明的另一目的是提供一种上述植物维管组织特异表达启动子的表达载体。本发明还有一目的是提供一种上述植物维管组织特异表达启动子的应用。技术方案为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为
一种植物维管组织特异表达启动子，核苷酸序列如SEQ NOl所示。含有植物维管组织特异表达启动子的表达载体。所述的表达载体为pJIT166-pPeTLP2-GFP融合表达载体和pBin-pPeTLP2_GUS融合表达载体。所述表达载体中的GUS或GFP可以被多种目的基因取代，例如抗虫的Bt毒素蛋白基因和胰蛋白酶抑制剂CpTi基因。所述的植物维管组织特异表达启动子在杨树维管组织中特异表达抑制真菌基因中的应用。所述的表达载体在杨树维管组织中特异表达抑制真菌基因中的应用。所述的植物维管组织特异表达启动子在培育抗真菌病杨树新品种中的应用。所述的表达载体在培育抗真菌病杨树新品种中的应用。本发明采用同源克隆-PCR的方法，克隆了杨树抗真菌类奇甜蛋白PeTLP2基因的翻译起始位点上游调控序列2078bp，该启动子命名为pPeTLP2。通过plantCARE软件进行了 pPeTLP2的启动子顺式元件及其功能的预测。其中含有各种激素响应、光响应顺式元件，另外还有真菌诱导物响应元件Box-Wl，以及诱导物响应元件EIER。由于类奇甜蛋白(PeTLP2)基因可以抑制真菌根霉(Rhizopus sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、桔青霉(Penicillium citrinum)和链格抱(Alternaria sp.)。因此可以人为 pPeTLP2 可能属于真菌诱导型启动子。本发明根据启动子pPeTLP2序列，设计正反向引物，分别引入SacI和SalI酶切位点，构建了启动子pPeTLP2与绿色荧光蛋白(GFP)融合的瞬时表达载体pJIT166-pPeTLP2-GFP，通过基因枪转化方法，将pJIT166-pPeTLP2_GFP融合表达载体转入洋葱表皮细胞，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的分布情况，从而验证启动子pPeTLP2的活性，并分析启动子pPeTLP2在植物细胞中的亚细胞定位。结果表明，启动子pPeTLP2在洋葱表皮细胞中能够驱动报告基因GFP的高效表达，驱动效率类似于2个串联35S启动子的活性；另外，启动子pPeTLP2可以驱动报告基因在洋葱表皮细胞中细胞核、细胞质、以及质膜上表达，而不在细胞壁上表达。因此，启动子pPeTLP2在植物细胞中可以高效表达，作用位置包括细胞核、细胞质和质膜上。本发明根据启动子pPeTLP2序列，设计正反向引物，分别引入Sal I和SacI酶切位点，构建了植物表达载体pBin-pPeTLP2-GUS，通过农杆菌介导的floral-dip法，将pBin-pPeTLP2-GUS融合表达载体转入拟南芥中，通过组织化学法⑶S染色，观察启动子pPeTLP2在植物细胞中的表达情况，以及植物组织定位情况。首先通过PCR的方法检测转基因Tl代植株。本发明使用了 3对不同的引物来检测拟南芥转基因植株，包括npt II基因特异性引物、pPeTLP2特异引物和udiA (CTS)特异引物，分别扩增得到521bp、2078bp和441bp的特异片段。另外,还通过Southern杂交进一步分析了启动子pPeTLP2转入拟南芥基因组的拷贝数，结果表明，启动子pPeTLP2成功整合到拟南芥基因组中。最后通过GUS染色，进一步确认pBin-pPeTLP2-GUS融合蛋白已经稳定转染拟南芥基因组，而且该启动子只作用于根、茎和叶的维管部位，其他部位不表达。本发明涵盖上述两种植物表达载体瞬时表达载体pJIT166-pPeTLP2_GFP和植物表达载体pBin-pPeTLP2-GUS。表达载体中的报告基因GFP或⑶S可以被多种目的基因取代。而目的基因以正义或反义与启动子连接均可。
有益效果本发明的维管组织特异性启动子，能将目的基因的表达限制在维管组织部分，这就有效避免了外源蛋白在其他组织中的积累及减轻某些有毒物质对植物的毒害，使目的基因在植物维管组织中高效特异持久表达。应用本发明的启动子在杨树育种工程中，可用来培育抗真菌病杨树新品种，为利用基因工程手段增强杨树对真菌病的抗性方面奠定基础，拓宽转基因技术在杨树育种领域的应用前景。
图I是通过plantCARE软件对启动子pPeTLP2序列中顺式作用元件预测结果图；图中，每一个顺式元件均有元件名称的标注，序列末端为起始密码子ATG;从上至下连续分为图1_1和图1~2 ；
图2是pJIT166-pPeTLP2-GFP瞬时表达载体结构 图3是pPeTLP2启动子亚细胞定位研究结果图；图中，a，b，C，阳性对照35S (2X)GFP ；d，e, f，pPeTLP2: :GFP融合表达载体；g，h，i，利用20%蔗糖溶液，对发现绿色荧光的阳性细胞(对应于d，e, f)进行质壁分离；a，d，g，GFP视场；b，e, h，明亮视场；c，f，i，组合视场；图4是pBin-pPeTLP2-GUS表达载体结构 图5是pBin-pPeTLP2-GUS表达载体通过农杆菌介导转化拟南芥阳性转基因植株的PCR检测结果图；图中，上521bp的npt II基因；中2078bp的pPeTLP2启动子片段；下441bp的udiA ( β -葡萄糖醛酸酶(⑶S))基因；
图6是pBin-pPeTLP2-GUS表达载体通过农杆菌介导转化拟南芥阳性转基因植株的的Southern杂交分析结果图；图中，M,marker (bp);P,阳性对照；N,阴性对照；L1_L7 :拟南芥转基因Tl代阳性植株；
图7是pBin-pPeTLP2-GUS表达载体通过农杆菌介导转化拟南芥阳性转基因植株的⑶S组织化学染色分析结果图；图中，a，阳性植株LI ;b，阳性植株L3 ;c，阳性植株L5 ;d，未转化的野生型拟南芥植株作为阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明，实施例中所使用的方法，除有特别说明外，均参照分子生物学实验手册或其他现有技术进行。实施例I启动子pPeTLP2序列的获得
本实施例根据已经测序了的杨树-毛果杨(Populus trichocarpa)基因组数据库(http://www. phytozome. net/search. php method=Org_Ptrichocarpa)中的基因 Pt0LP25 '上游序列，设计了一对特异引物pPeTLP2-F (5 ' -TATCCTCTTCCGCCACCGTGTT-3 ')，pPeTLP2-R (5' -GGCCGTTGCATTCGATTCTGTT-3 ')，从‘南林 895’ 基因组中分离到 PeTLP2基因翻译起始位点上游调控序列2078bp，该启动子命名为pPeTLP2，序列如SEQ NOl所示。PCR具体过程如下
模板制备利用CTAB法提取‘南林895’杨叶片DNA，以该DNA为模板进行PCR扩增；20 μ L PCR 反应体系10ng 模板 DNA，I μ L pPeTLP2_F (10 μ M)，I μ L pPeTLP2_R(10μΜ),2μ L PCR Buffer (10X ), I. 5μ L dNTP (2. 5mM), I. 2μ L MgCl2 (25mM),0. 3μ LPCR聚合酶，ddH20补足。PCR 反应程序95 °C，5min ；94 °C，45s, 56 °C，45s, 72 °C，lmin, 29cycles ；72 °C，IOmin ； 10°C,IOmin0获得目的片段之后，连接测序载体PMD T-18载体(TAKARA公司产品)，将样品送上海英骏测序公司测序，从而得到pPeTLP2启动子序列。通过plantCARE软件进行了 pPeTLP2的启动子顺式元件及其功能的预测，结果如图I和表I所示，其中含有各种激素响应、光响应顺式元件，另外还有真菌诱导物响应元件Box-Wl，以及诱导物响应元件EIER。类奇甜蛋白(PeTLP2)基因可以抑制真菌根霉(Rhizopus sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、桔青霉(Penicillium citrinum)和链格抱(Alternaria sp.)。因此可以认为pPeTLP2启动子属于真菌诱导型启动子。表I显示启动子pPeTLP2序列中顺式作用元件功能预测表
权利要求
1.一种植物维管组织特异表达启动子，核苷酸序列如SEQ NOl所示。
2.含有权利要求I中所述植物维管组织特异表达启动子的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于；所述的表达载体为pJIT166-pPeTLP2-GFP融合表达载体或pBin-pPeTLP2_GUS融合表达载体。
4.据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的GUS或GFP可被抗虫的Bt毒素蛋白基因取代，或被胰蛋白酶抑制剂CpTi基因取代。
5.权利要求I所述的植物维管组织特异表达启动子在杨树维管组织中特异表达抑制真菌基因中的应用。
6.权利要求2所述的表达载体在杨树维管组织中特异表达抑制真菌基因中的应用。
7.权利要求I所述的植物维管组织特异表达启动子在培育抗真菌病杨树新品种中的应用。
8.权利要求2所述的表达载体在培育抗真菌病杨树新品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物维管组织特异表达启动子及其表达载体和应用，植物维管组织特异表达启动子为真菌诱导型启动子，核苷酸序列如SEQNO1所示。含有植物维管组织特异表达启动子的表达载体为pJIT166-pPeTLP2-GFP融合表达载体和pBin-pPeTLP2-GUS融合表达载体。该植物维管组织特异表达启动子可以驱动目的基因在转基因植株的维管部位高效特异表达，在其他部位不表达。应用本发明的启动子在杨树育种工程中，可用来培育抗真菌病杨树新品种。
文档编号A01H5/00GK102876678SQ20121038284
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者诸葛强, 王立科, 杨立恒, 周洁, 于娟, 董静 申请人:南京林业大学