专利名称：一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的新菌株及其筛选方法。
背景技术：
黄瓜疫病(CucumberPhytophthoraBlight)是由黄瓜疫霉菌iPhytophthorame I on is)引起的一种土传病害,发生时来势凶猛，蔓延迅速，常年造成大面积黄瓜死亡，对黄瓜生产的影响很大。该病原菌不仅能够危害黄瓜，还能够侵染南瓜、丝瓜、西瓜以及葫芦、甜瓜、哈密瓜、苦瓜等葫芦科植物。黄瓜疫病在黄瓜整个生长过程中的任何时期、任何部位均可患病。病原菌可以通过多种途径进行传播，主要为害果实、叶片和茎，特别是茎基部。幼苗期发病，茎基部开始出现水溃状软腐或猝倒，呈暗绿色或褐色，病部软化、缢缩，I 2天内其上部叶片萎蔫下垂，茎基部病斑呈黑暗色，幼苗枯萎而死。叶片发病时，呈现圆形或者近圆形水溃状病斑，病斑边缘为暗绿色，中间为褐色，病斑扩展迅速，干燥时为青白色。叶柄受害叶片下垂，易破碎， 湿度大时叶片软腐易脱落，在病部可看到稀疏灰白色菌丝。果实染病时，从蒂部开始，出现圆形水溃状内陷病斑，初为暗绿色，潮湿时果实表面有白色霉层(病原菌孢囊梗及孢子囊)，会有难闻的腥臭气味发出。黄瓜疫霉病菌主要是通过病菌的孢子囊、厚垣孢子以及菌丝体的形式在病残体内过冬，形成一个初侵染源。在次年春季可以产生新的繁殖体进行传播。在一定条件时，疫霉菌侵入寄主植物后能够在发病部位产生大量的孢子囊并释放游动孢子，游动孢子能够借助气流水或接触传播，引起病害扩散。病菌的主要传播途径是风和雨水，带病种苗、土壤及灌溉水，当温度达到25 28°C时，有一定湿度时，疫霉菌经过24小时潜育期后，孢子囊释放大量游动孢子并经一定的气流传播。黄瓜疫病是一种发病周期短、蔓延速度快的卵菌病害。病害发生的主要关键是湿度，其次是温度，所以在高温高湿的天气，疫霉菌很容易侵染黄瓜以及其它葫芦科植物使其致病。发病程度与降雨量的大小成正比。反正，则弱。其次，土壤中的温度也是导致疫病的条件之一，卵孢子在土壤中的存活时间很长，但很难在培养基上生长，当达到一定温度时，卵孢子能够萌发产生芽管形成孢子囊从而释放游动孢子，发病越重。通过选用抗病品种、加强肥水管理等措施，可以有效地减少和推迟黄瓜疫病的发生，化学药剂也是防治黄瓜疫病的主要方法。但是长期单一使用某一化学药剂，容易产生抗药性，影响防治效果。同时，化学药剂对环境影响大以及对人体健康的潜在危害。因此，筛选对黄瓜疫霉菌有抑制作用的微生物是防治黄瓜疫病的最佳途径。
发明内容
针对上述问题，本发明人从湖南省张家界国家森林公园金鞭溪采集土壤样品，利用高氏一号培养基通过稀释平板法获得放线菌的单菌落，再采用平板对峙法筛选对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌，该菌对人畜无致病性，能安全地用于黄瓜疫病的生物防治。同时，该菌对稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、烟草黑胫病菌、柑橘炭疽病菌也有一定的抑制作用。本发明提供的技术方案是一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌，其是保藏号为CGMCC 6191的绛红褐链霉菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该放线菌(绛红褐链霉菌,拉丁名焊cm purpeofuscus)已于2012年6月i日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，其保藏号为CGMCC 6191，经检测存活。同时，本发明还提供所述对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌的筛选方法，其步骤如下
(1)从土壤中采集放线菌样品，采集土样时，先去除表土，取5-20cm深处的土样；
(2 )利用稀释法进行分离，将土样放入装有小玻璃珠和无菌水的瓶中，震荡，静置后，稀释，制备10_4、10-5、10-6稀释液，吸取稀释液滴加到高氏一号培养基平板上，涂布均匀，将培养皿放在温箱倒置培养；
(3)筛选对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌
采用平板对峙法筛选对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌将纯化的放线菌菌株，用高氏一号培养基培养，黄瓜疫霉菌PDA培养基上培养4、天后,裁成菌丝块,移入含PDA培养基的培养皿中央，四周对称放置放线菌，培养4飞天后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的放线菌，保存。本发明具有以下有益效果
本发明放线菌是发明人从湖南省张家界国家森林公园金鞭溪土壤样品中分离而得，经鉴定为绛红褐链霉菌iStreptomyces purpeofuscus X418),该菌对人畜无致病性,能安全地用于黄瓜疫病的生物防治。同时，该菌对稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、烟草黑胫病菌、柑橘炭疽病菌也有一定的抑制作用。目前国内还很少有黄瓜疫霉菌拮抗菌的报道，尤其是没有报道绛红褐链霉菌对黄瓜疫霉菌的抑制作用。因此，该拮抗菌株具有很好的应用前景。
图1为土壤中放线菌的分离结果。图2为对峙筛选抑制黄瓜疫霉菌的放线菌。图3为放线菌的培养性状。图4为放线菌X418的16S rDNA扩增结果。图5为放线菌X418的16S rDNA序列分析结果。图6为放线菌X418对黄瓜疫病的防治作用(左边为对照，右边为施用放线菌发酵液)。
具体实施方式
实施例1 :
本发明对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌的筛选方法如下1、土壤样品的采集
从湖南省张家界国家森林公园金鞭溪附近随机采集土样4份。采集土样时，先去除表土，取5-20cm深处的土样约200g，分装标记后带回实验室。
2、放线菌的分离
利用稀释法进行分离。称取土样10克，放入装有小玻璃珠和无菌水90ml的三角瓶中，震荡20分钟稀释液。静置30秒后，依次稀释10倍，制备ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6稀释液，分别吸取稀释液O.1ml滴加到高氏一号培养基(可溶性淀粉20克、琼脂20克、K2HPO4 O. 5克、NaClO. 5 克、KNO3 I 克、MgSO4*7H20 O. 5 克、FeSO4 O. 01 克、蒸馏水 1000 毫升，pH 7. 2 7. 4)平板上，涂布均匀，将培养皿放在28°C的温箱倒置培养。分离结果请见图1。3、拮抗放线菌的筛选
采用平板对峙法(in vitro)筛选拮抗黄瓜疫霉菌的放线菌，筛选结果请见图2。将纯化的放线菌菌株，用高氏一号培养基培养，黄瓜疫霉菌PDA培养基上培养5天后，用直径O. 7cm打孔器裁成菌丝块，移入直径7. 5cm的培养皿中央(含PDA培养基)，四周对称放置4种放线菌。28°C下培养7天后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的放线菌，保存。4、放线菌发酵液对黄瓜疫霉菌的抑制作用
将筛选到拮抗效果好的菌接种于高氏一号液体培养基中，28°C摇床培养7天过滤，在用细菌过滤器过滤。取发酵液3ml与27ml PDA混合均匀，倒3个平板，用直径O. 7 cm打孔器分别打出直径一致的试验菌丝块接种于直径7. 5cm的培养皿中央，28°C培养，以无菌水处理为对照。重复3次，3天后测得发酵液对黄瓜疫霉菌的抑制率为73. 8%。
5、拮抗菌的鉴定
(1)形态特征
在高氏一号琼脂平板上划线插片，28°C培养7-10天后，分别用光学显微镜和电子显微镜观察插片上的气生菌丝、基内菌丝及孢子的形态特征。发现菌丝体初为白色，后变为烟灰白。菌落表面干燥、多皱，正反面颜色不一致。气生菌丝丰富，多分枝。基内菌丝有分支、无横隔、无断裂。孢子丝长而直，孢子长圆形，柱形，表面光滑
(2)培养特征
放线菌X418在高氏一号培养基上气生菌丝生长丰茂，绒状，烟灰白，有红褐色可溶色素。在PDA培养基上气生菌丝白色。淀粉琼脂培养基上气生菌丝初白色，有微绛红色色素。燕麦粉琼脂培养基上气生菌丝灰色，基内菌丝反面褐色，有时暗褐色至红褐色。察氏琼脂培养基上气生菌丝丰富，白色(图3)。(3)生理生化实验
参照《链霉菌鉴定手册》分别对放线菌X418进行明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、纤维素上生长、H2S产生及碳源利用等各项试验。发现放线菌X418能够使明胶液化、牛 奶凝固、胨化慢、淀粉水解强。在纤维素上不生长。产生H2S。MR-VP呈阴性结果。产生过氧化氢酶。利用L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖、乳糖、山梨糖、葡萄糖，不利用鼠李唐、山梨醇、甘露醇。(4 ) 16S rDNA测序及序列分析
请参见图4-6，用CATB方法提取放线菌基因组的DNA。用16S rDNA的通用引物即正向引物5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (请见SEQ ID NO. 2所示)、反向引物5’ -GGYTACCTTGTTACGACTT-3’ (请见 SEQ ID NO. 3 所示)对基因组 DNA 进行 PCR 扩增。PCR反应体系为20μ1，其中10XPCR缓冲液2Pl、10mmol/L dNTP O. 8μ1、引物O. 5μ1、模板DNAlPl、Taq 酶 O. 5μ1、(ΜΗ20 14. 7μ1。PCR 扩增条件94°C预变性 5min，94°C 变性 40s，51°C复性40s，72°C延伸90s，30个循环，最后72°C延伸5min。得到1500bp左右的片段(图4)。经试剂盒纯化后，与T载体进行连接，再转化到大肠杆菌，挑克隆子，菌液PCR验证，送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列为1429bp (请见SEQ ID NO.1所示)。将所得序列于GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对,发现与绛红褐链霉菌iStreptomycespurpeofuscus)(图5)的16S rDNA有非常高的一致性(99%)，表明该菌为绛红褐链霉菌。
实施例2
2012年2月10日开始育黄瓜苗，品种为蔬研白玉。用50°C温水将黄瓜种子浸泡10分 钟，再26°C过夜。2月11日将种子包在纱布中，26°C保温催芽。2月12日准备苗盘、播种，放入光照培养箱中白天27°C 12h、晚上16°C 12h，保持RH80%。2月29日，黄瓜幼苗出现2片真叶时开始接种黄瓜疫霉菌的孢子囊，孢子囊浓度为5X IO3个游动孢子/毫升。接种前先将苗盘浇透水，采用灌根接种法取2ml接种悬浮液加到植株根部周围。将接种后的黄瓜幼苗分为2组。一组在根部灌注2ml稀释20 X高氏一号培养液,另一组在根部灌注2ml稀释20X的放线菌X418高氏一号发酵液。将处理后的黄瓜幼苗置于黑暗保湿(RH为100%)24h，以后每天光照14h，保持土壤湿润近饱和，接种期间湿度控制在26°C左右。7d天调查发病情况。根据黄瓜抗疫病鉴定技术规程(NY/T 1857. 4-2010)进行分级调查，发现通过施用放线菌X418高氏一号发酵液，使黄瓜疫病的病情指数降低75%，也就是通过施用稀释20X的放线菌X418高氏I号发酵液，对黄瓜疫病的防治效果为75%。(图6)
本发明所述的放线菌，采用平板对峙法检测对其他植物病原菌的抑制作用，发现对稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、烟草黑胫病菌、柑橘炭疽病菌也有一定的抑制作用，实验结果如下表I。表I
指示菌抑菌带水稻稻瘟病菌12mm辣椒疫霉病菌9mm烟草黑胫病菌2mm柑橘炭疽病菌6mm辣椒炭疽病菌3. 5mm
权利要求
1.一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌，其是保藏号为CGMCC 6191的绛红褐链霉菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.—种权利要求1所述的对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌的筛选方法，其特征在于包括如下步骤 (I)从土壤中采集放线菌样品，采集土样时，先去除表土，取5-20cm深处的土样； (2 )利用稀释法进行分离，将土样放入装有小玻璃珠和无菌水的瓶中，震荡，静置后，稀释，制备10_4、10_5、10_6稀释液，吸取稀释液滴加到高氏一号培养基平板上，涂布均勻，将培养皿放在温箱倒置培养； (3)筛选对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌 采用平板对峙法筛选对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌将纯化的放线菌菌株，用高氏一号培养基培养，黄瓜疫霉菌PDA培养基上培养4-5天后,裁成菌丝块,移入含PDA培养基的培养皿中央，四周对称放置放线菌，培养4-5天后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的放线菌，保存。
3.—种权利要求1所述的对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌在黄瓜疫病生物防治中的应用。
4.一种权利要求1所述的对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌在稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、烟草黑胫病菌、柑橘炭疽病菌生物防治中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法，其是保藏号为CGMCC6191的绛红褐链霉菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该放线菌是一种能安全、无毒、有效的防治黄瓜疫霉菌(Phytophthoramelonis)的拮抗放线菌。该菌对人畜无致病性，能安全地用于黄瓜疫病的生物防治。同时，该菌对稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、烟草黑胫病菌、柑橘炭疽病菌也有一定的抑制作用。目前国内还很少有黄瓜疫霉菌拮抗菌的报道，尤其是没有报道绛红褐链霉菌对黄瓜疫霉菌的抑制作用。因此，该拮抗菌株具有很好的应用前景。
文档编号A01P3/00GK103013852SQ20121038220
公开日2013年4月3日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者易图永, 解娜, 王运生 申请人:湖南农业大学