一种抑制水稻2-pgk基因表达的植物表达载体及培育低植酸水稻的方法

专利名称：一种抑制水稻2-pgk基因表达的植物表达载体及培育低植酸水稻的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种抑制水稻2-PGK基因表达的植物表达载体及培育低植酸水稻的方法。
背景技术：
植酸(PA,phytic acid),又名肌醇六磷酸(myo-inositol-l, 2, 3,4, 5,6-hexakisphosphate,简写InsP6或IP6),是禾谷类、豆类、油料等作物种子中磷的主要储存形式，通常占种子干重的I. 0%，占种子全磷量的75±10%。以禾谷类、豆类等作物的种子作为主食的人类和饲用动物，由于缺乏消化植酸的酶类，排泄物中磷的含量很高，极易造成土壤和环境水体富营养化；同时植酸与Zn2+、Ca2+、Fe3+等形成的植酸盐不能被人类所吸收利用，长期食用禾谷类的亚洲人群易患微量元素缺乏症。虽然，在养殖业中可通过向饲料中添加植酸酶或者磷来满足动物对磷的需求，但是这无疑增加了成本，同时要造成了潜在的环境磷污染。如何解决植酸存在导致的环境问题和人类微量元素缺乏症成为摆在科学工作者面前的一个难题。通过遗传育种或者基因工程技术获得植酸含量适当下降、其他农艺性状没有显著变化的作物，不仅能够在源头上解决植酸造成的环境污染问题，同时对于降低畜牧业生产投入，增加农民收入有重要的社会现实意义。早在1996年，V. Raboy等采用就化学诱变剂处理玉米获得了两类低植酸突变体Ipal和lpa2，植酸含量分别下降66%和30%。随后，国内外育种工作者应用Y射线和化学诱变剂处理，在大麦、水稻、小麦、大豆等作物中获得了一系列低植酸突变体和品种。然而，进一步研究发现伴随着种子植酸含量的下降，作物的其他农艺性状也会发生改变，如作物产量下降、种子活力降低、植株形态发生变异，甚至还会影响到植物对生物或非生物胁迫的抗性,严重的还会致死。因此，同时获得作物种子植酸含量下降、其他农艺性状没有发生显著变异的低植酸品种成为育种者的首要任务。到目前为止，对植物植酸代谢合成途径已经研究的比较清楚，参与植酸代谢的多个功能基因已经克隆MIS (myo-inositol-3-phosphate synthase,肌醇-3-憐酸合成酶)基因是植酸合成途径的首个酶，它的作用是将光合作物产物葡萄糖-6-磷酸转化成ID-肌醇-3-磷酸,为植酸合成提供肌醇环；MIK (myo-inositol kinase,肌醇激酶)基因和IMP (inositol monophosphatase,肌醇单磷酸酶)基因负责肌醇和3-磷酸肌醇之间转化，对两个基因的调控可能会对植酸的合成途径起调节作用；植物的IPK (inositolphosphatekinase,肌醇磷酸激酶)主要负责肌醇的磷酸化，通过比较多种作物的IPK活性发现其具有磷酸化多种肌醇底物的能力，但是不具有磷酸化肌醇环2’位置的能力；IPKl (inositol-pentakisphosphate 2-kinase,肌醇多憐酸-2激酶)是目前发现唯一可以磷酸化肌醇五磷酸肌醇环2’位置的酶；MRP (multidrug resistance protein,多药抗性蛋白)是一种转运蛋白，其承担着运输植酸到贮藏小泡的功能，已经在水稻、玉米、大豆中克隆得到；除上述基因外，还有负责将植酸水解为肌醇和无机磷的植酸酶基因，目前已在多种作物中发现。到目前为止，研究最为详细的植酸合成基因是MIPS，通过基因沉默技术在多种作物中获得了相应的低植酸突变体。Ruth Keller等(1998)应用组成型启动子和反义RNA技术，获得了 MIPS基因表达水平下降的转基因土豆，分析发现转基因土豆叶片中肌醇的含量下降；AlineC. S. Nunes等(2005)通过RNAi技术沉默MIPS基因使大豆中的植酸含量下降了 94. 5% ；Mio Kuwano等(2008)通过反义RNA技术在种子特异性启动子的驱动下，获得了植酸含量下降、其他农业性状没有显著变异的转基因水稻。此外，Shi等(2007)应用RNAi技术，在玉米种子特异性启动子01el6和Glb驱动下，通过沉默MRP4基因获得种子植酸含量下降的玉米和大豆。目前还没有通过amiRNA技术沉默植酸合成代谢相关基因，培育低植酸水稻或其他作物的报道。

发明内容
本发明提供了一种植物表达载体，利用该植物表达载体能特异性地抑制水稻种子中相应植酸合成代谢相关基因的表达，从而获得性状稳定的低植酸水稻植株。一种amiRNA抑制水稻2-PGK基因表达的植物表达载体，包括插入原始载体的amiRNA结构单元和特异性启动子,所述特异性启动子为启动子01eosinl8,其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。所述水稻2-PGK基因的Gramene位置序列号为LOC 0s02g57400. I。本发明植物表达载体使用种子特异性启动子OleosinlS，可以使基因沉默事件仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效地避免其他组织部位植酸合成受到影响。所述原始载体可以是pCAMBIA1301-35SN或其他可用于农杆菌转化的双元载体。所述amiRNA结构单元包括中间的环和形成发夹结构的茎，所述茎由amiRNA抑制片段和其不完全互补片段构成。所述amiRNA抑制片段为2-PGK基因cDNA序列的部分序列，其喊基序列可以如SEQ ID No. 2所不。本发明还提供了一种培育低植酸水稻的方法，包括(I)构建所述的植物表达载体；(2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；(3)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗后，移栽至大田，筛选获得低植酸水稻植株。其中，所述植物表达载体的构建方法为(I)将amiRNA抑制片段和其不完全互补片段替换水稻内源性miRNA前体osaMIR528中的茎，得到amiRNA结构单元；(2)将amiRNA结构单元插入原始载体的启动子的下游；(3)将启动子01eosinl8替换原始载体的启动子。所述农杆菌可以选择为EHA105根瘤农杆菌。为了获得性状稳定的转基因低植酸植株，可以对获得的低植酸水稻植株多代种植，筛选性状稳定的单株。其中，所述amiRNA结构单元构建的具体步骤为(I)利用WMD3平台获得构建沉默2-PGK基因的amiRNA引物(I，II，III，IV)；(2 )以pNW55 (含水稻osaMIR528 )为模板，分别利用引物11+通用引物G-4368、弓丨物I+引物IV、引物III+通用引物G-4369进行PCR扩增，获得amiRNA结构单元的环结构、amiRNA抑制片段及其不完全互补片段；(3)以上述PCR产物为模板，利用通用引物G-4368+G-4369进行重叠PCR，获得所述amiRNA结构单兀。其中，引物I、II、III、IV的碱基序列为I :5，-agTAAGTATTAATCAAGACCCTGcaggagattcagtttga-3，；II :5，-tgCAGGGTCTTGATTAATACTTActgctgctgctacagcc-3，；III :5，-ctCAGGGACTTCATTAATACTTAttcctgctgctaggctg-3，；IV :5，-aaTAAGTATTAATGAAGTCCCTGagagaggcaaaagtgaa-3，；通用弓丨物G-4368、G-4369的碱基序列为G-4368 :5’ -CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’ ； G-43695，-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3，。所述启动子01eosinl8的制备方法为(I)提取水稻成熟叶片基因组DNA ；(2)以所述总DNA为模板，利用引物01el8_F和01el8_R进行PCR扩增。所述引物01el8_F和01el8_R如下01el8-F:5’ -AAGCTTATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’ ；01el8-R :5’ -GGTACCTGCTAAGCTAGCTAGCAAGATGA-3’。与现有技术相比，本发明的有益效果为(I)本发明提供的方法利用种子特异性启动子01eosinl8和amiRNA技术控制水稻种子中植酸合成相关基因的表达，使基因沉默事件仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效避免影响水稻其他组织部位植酸合成。(2)利用本发明提供的方法能够获得稳定的转基因低植酸水稻品系，并且与其他非转化阴性系在株高、穗长、千粒重等其他农艺方面无显著差异，保证了转基因低植酸水稻的整体品质。


图IA为01eosinl8_T载体的菌落PCR扩增验证结果图。图IB为mi-2-PGK-T载体的菌落PCR验证结果图。图2为pmi-2-PGK载体结构示意图。图3为转化水稻愈伤组织的⑶S显色图。其中，“ + ”表示转基因阳性，表示非转基因阴性。图4为转基因水稻叶片⑶S显色图。其中，“ + ”表示转基因阳性，表示非转基因阴性。图5为种子无机磷显色反应示意图。其中，“ + ”表示转基因阳性，表示非转基因阴性。
具体实施方式
通过构建2-PGK基因的amiRNA获得低植酸水稻l、mi-2-PGK结构单元的获得(I) mi-2-PGK 引物的设计在Gramene网站上搜寻水稻品种日本晴2-PGK基因序列号(L0C_0s02g57400. I),将 0s02g57400. I 输入到 Web MicroRNA Designer platform(WMD3)平台获得构建沉默2-PGK基因的amiRNA引物，引物的碱基序列分别为I :5，-agTAAGTATTAATCAAGACCCTGcaggagattcagtttga-3，；II :5’ -tgCAGGGTCTTGATTAATACTTActgctgctgctacagcc-3’ ；III :5，-ctCAGGGACTTCATTAATACTTAttcctgctgctaggctg-3，；IV :5，-aaTAAGTATTAATGAAGTCCCTGagagaggcaaaagtgaa-3，；通用引物G-4368 :5’ -CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’ ；G-4369 :5’ -GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’ ；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司负责合成。(2) mi-2-PGK结构单元的扩增以pNW55为模板，根据下表通过PCR扩增获得构建mi-2_PGK结构单元的环结构、ami-2-PGK抑制片段及其不完全互补片段；然后再以环结构、mi-2-PGK抑制片段及其不完全互补片段为模板I: I: I摩尔比混合，通过重叠PCR获得ami-2-PGK结构单元，构建程序见表I。ami-2-PGK片段的碱基序列如SEQ ID No. 2所示。表I mi-2-PGK结构单元的构建程序
①以pNW55为模板引物产物大小(bp)PCR程序G-4368^ II 1+iVIii +G-4369^568725995'C, 2 mi η 98°C, 15s, 55°C, 34个循环；680C, 7 min ο30s，681,30s,②以上述PCR产物为模板(摩尔比1:1:1)引物产物大小(bp)PCR程序G-4368+G-4369^5495V, 2 min；98'C, 15s，550C, 34个循环；68 °C，7 min ο30s，68。。，30s,PCR反应体系为
权利要求
1.一种amiRNA抑制水稻2-PGK基因表达的植物表达载体，包括插入原始载体的amiRNA结构单元和特异性启动子，其特征在于，所述特异性启动子为启动子Oleosin 18，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.如权利要求I所述的植物表达载体，其特征在于，所述原始载体为PCAMBIA1301-35SN。
3.如权利要求I所述的植物表达载体，其特征在于，所述amiRNA结构单元包括中间的环和形成发夹结构的茎，所述茎由amiRNA抑制片段和其不完全互补片段构成，所述amiRNA抑制片段的碱基序列如SEQ IDNo. 2所示。
4.一种培育低植酸水稻的方法，其特征在于，包括(1)构建如权利要求I 3任一所述的植物表达载体；(2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；(3)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗后，移栽至大田，筛选获得低植酸水稻植株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体的构建方法为(1)将amiRNA抑制片段和其不完全互补片段替换水稻内源性miRNA前体osaMIR528中的莖，得到amiRNA结构单元；(2)将amiRNA结构单元插入原始载体的启动子的下游；(3)将启动子Oleosin18替换原始载体的启动子。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将低植酸水稻植株多代种植，获得性状稳定植株。
全文摘要
本发明公开了一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法，该植物表达载体包括插入原始载体的amiRNA结构单元和特异性启动子，所述特异性启动子为启动子Oleosin 18，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该方法包括(1)构建所述植物表达载体；(2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；(3)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。本发明利用种子特异性启动子Oleosin 18控制基因表达，使基因沉默仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效避免水稻其他组织部位植酸合成受到影响。
文档编号A01H5/00GK102925480SQ20121043089
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者李文旭, 舒庆尧, 赵海军, 谭媛媛, 卢海平 申请人:浙江大学