利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法：在表达外源基因的同时，利用内源性miRNA作为前体，定向抑制水稻中除草剂解毒酶表达，从而获得安全、可选择灭杀的转基因水稻。具体为：将外源基因表达框与定向抑制解毒酶的amiRNAs表达框构建在同一个植物表达载体上；所述amiRNA表达框包括由启动子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和终止子功能性连接而成。本发明通过定向沉默水稻中参与除草剂解毒和脱毒代谢酶基因的表达，从而获得了一种能安全选择消灭转基因水稻的方法。
【专利说明】利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，以及所用的基因、质粒属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]转基因农作物目前已经在世界上许多国家大量推广，我国也在大力发展、推广转基因技术和转基因研究。当下，利用转基因农作物作为生物反应器来生产药用蛋白、工业酶等研究工作也开展得如火如荼(Larrick and Thomas, Current Opinion in Biotechnology, 2001, 12:411-418)。种植这些转基因农作物存在其可能混入非转基因农作物从而导致混入人食物中的重要健康安全隐患以及转基因漂移等生态安全隐患，因此，发明一种简便、控制转基因农作传播方法具有重大的现实意义。
[0003]细胞色素P450是一类利用NADPH所传递的电子去催化分子氧活化的血红素蛋白，占植物基因的1%，是植物中一类重要的酶。它在植物体内介导一系列氧化反应，其功能涉及木质素、留醇、内萜、生物碱、脂肪酸和许多起植保素功效的次生物质合成代谢，以及天然和人工合成的许多外源抗生素(如除草剂)等物质的降解和除毒代谢等，在植物生长发育、防御病虫害和适应逆境中有着特别重要的作用。细胞色素P450是一个超基因家族， 植物中命名的已超过1000个，水稻中可能的有500多个，截止目前，生物学功能被确切验证的植物P450基因只有40个左右，目前的研究显示P450在水稻自身防御中具有重要作用，是茉莉酸途径中的一类重要氧化酶，参与合成二萜、羟色胺等多种用于防御的此生代谢产物(Fujiwara T et al, Joural of Biology Chemistry, 2010285:11308-11313; Reub en J P et al, Phytochemisty2006, 67:2307-2317)。CYP81A6 基因是水稻 P450 基因家族中苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因，故水稻对苯达松、磺酰脲类除草剂有良好的抗性 (Siminiszky, Phytochemistry Reviews5:445-458;Pan et al, Plant Molecular Biology, 2006, 61:933-943;Werck-Reichhart et al, Trends in Plant Science5:116-123)。将水稻解毒的P450基因用反义RNA或RNAi技术与目的基因以及其它相关构建于同一载体，就可以在表达目的基因的同时获得可以选择灭杀的转基因植物(生物反应器)。
[0004]目前应用的反义RNA或RNAi沉默技术尽管能够达到选择灭杀转基因水稻的目的， 但是它存在很多的问题，其中最重要有“脱靶效应”:水稻中P450基因是一个超基因家族， 其彼此间的同源性很高，在构建RNA或RNAi沉默载体产生转基因水稻时，dicer酶酶切前体siRNA (dsRNA)不是单一位点酶切，会产生大量siRNA，可能会造成目的基因脱靶；同时， 水稻被注释的基因只有60%左右，由于RNA聚合酶`的作用，可能会产生次生的siRNA，产生 “非靶标效应”，在沉默靶基因的同时，也导致非靶标基因也被沉默，从而可能导致一些有益农艺性状的消失以及一些不可预知的水稻功能缺失(Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690 ；Norman Warthmann et al, PLoS ONE, 2008, 3 (3);张晓辉等，自然科学进展，2009，10:1029-1036)。所以急需一个特异性高、安全、无明显副作用的沉默技术以及方法。[0005]miRNAs (microRNAs)是一种高度保守的、长度为18-25个核苷酸的单链RNA小分子，广泛存在于真核生物中，最早在1993年于秀杆线虫中被发现。miRNAs前体与沉默目标基因存在I个至几个碱基的不完全配对或完全配对，在dicer酶的作用下，miRNAs前体偏好产生并聚集一种sRNA双链结构(miRNA-miRNA*)，然后与整合到沉默复合体(RISC)中，最后与靶基因的mRNA3’未翻译区结合，完全匹配的导致mRNA降解而达到靶基因沉默，不完全配对的导致mRNA转录抑制而达到祀基因沉默(Norman Warthmann et al, PLoSONE, 2008, 3(3);Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690)。miRNA沉默技术特异性高、效率高、遗传稳定、作用时间长、体内稳定、高RNA启动子兼容性、无明显毒性等优点(Shao Yao Ying, MicroRNA Protocols, 2006, Humana press Inc;KrisshnaraoAppasani, MicroRNAs:From Basic Science to Disease Biology,2008, CambridgeUniversity Press)，其在功能基因组学研究、基因治疗、动植物抵抗外源病毒等领域具有广泛的应用前景。amiRNAs (artificial micoRNAs)是利用内源性miRNA前体产生sRNA来实现基因沉默。2002年amiRNAs沉默技术第一次在人细胞系中应用，之后在多种植物和动物中应用。
[0006]目前还没有一个既能表达外源蛋白同时又能安全、可选择灭杀的转基因水稻(生物反应器)的方法。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻方法；本发明通过定向沉默水稻中参与除草剂解毒和脱毒代谢酶基因的表达，从而获得了一种能安全选择消灭转基因水稻的方法。 [0008]为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，在表达外源基因的同时，利用内源性miRNA作为前体，定向抑制水稻中除草剂解毒酶表达，从而获得安全、可选择灭杀的转基因水稻。
[0009]作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的改进:将外源基因表达框与定向抑制解毒酶的amiRNAs表达框(amiRNA表达抑制框)构建在同一个植物表达载体上；
[0010]amiRNA表达框包括由启动子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和终止子功能性连接而成。
[0011]作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进:表达的外源基因为医用蛋白基因、工业酶基因、抗虫基因或抗除草剂基因。
[0012]作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进:作为前体的内源性miRNA命名为0S-528，其多核苷酸序列为SEQ ID N0:1。
[0013]作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进:除草剂解毒酶基因为CYP81A6，其多核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
[0014]作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进:在水稻中表达外源基因(目的基因)的同时定向抑制苯达松或磺酰脲类除草剂解毒基因CYP81A6的表达，所得的转基因水稻就能被苯达松或磺酰脲类除草剂选择灭杀；
[0015]即，将目的基因(外源基因)表达框和苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6表达抑制框连接在同一个载体上，转化时它们在同一个T-DNA片段上导入植物染色体中。
[0016]作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进ー步改进:
[0017]amiRNAs核苷酸序列为以下:
[0018]miRl-F:AGTCAATACATGAGTTCGTCCGGCAGGAGATTCAGTTTGA ；
[0019]miRl-R:TGCCGGACGAACTCATGTATTGACTGCTGCTGCTACAGCC ；
[0020]miRl1-F:CTCCGGAgGAAgTCATGTATTGATTCCTGCTGCTAGGCTG ；
[0021]miRll-R:AATCAATACATGAcTTCcTCCGGAGAGAGGCAAAAGTGAA0
[0022]备注说明:
[0023]amiRNAs存在1_2个碱基错配，小写字体代表的是错配碱基；带下划线的字体代表的是设计的人工miRNAs。
[0024]作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进ー步改进:所得的载体为1300-35S-Ubq-1174-Ubq_CYP81A6i，将所述1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i载体导入水稻中，最终获得抗草甘膦而对除草剂苯达松敏感的转基因水稻。
[0025]备注说明:1174相当于ー个外源基因。
[0026]本发明是一种利用`人工小分子RNAs (artificial microRNAs, amiRNAs)获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法。
[0027]具体而言，本发明采用的技术方案是:
[0028]在表达目的基因(外源基因)的同时，利用amiRNAs方法，抑制转基因水稻中參与除草剂解毒、脱毒基因的表达，获得可被安全选择灭杀的转基因水稻。
[0029]具体地，所述目标除草剂为苯达松或磺酰脲类除草剤，它们是农业上常用的除草剂，对多种阔叶杂草具有良好的除草能力，水稻具有对这两种除草剂的解毒酶CYP81A6，故对这两种除草剂有良好的抗性(Siminiszky, Phytochemistry Reviews5:445-458;Panet al,Plant Molecular Biology, 2006, 61:933-943;Werck-Reichhart et al, Trendsin Plant Science5:116-123)。故在水稻中表达目的基因的同时定向抑制苯达松或磺酰脲类除草剂解毒基因CYP81A6的表达，转基因水稻就可以被苯达松或磺酰脲类除草剂选择灭杀。2002年amiRNAs沉默技术第一次在人细胞系中成功应用，随后在多种植物和动物中应用，尽管其功能机制还有待于进一歩的研究，但由于amiRNAs沉默技术特异性高、效率高、遗传稳定、作用时间长、体内稳定、高RNA启动子兼容性、无明显毒性等优点(Shao Yao Ying, MicroRNA Protocols,2006, Humana press Inc;KrisshnaraoAppasani, MicroRNAs:From Basic Science to Disease Biology,2008,CambridgeUniversity Press),其已成为新一代沉默技术的代表(Norman Warthmann et al, PLoSONE,2008, 3(3);Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690)。amiRNA表达抑制框可以由一个启动子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段、終止子等功能性连接而成。启动子可选择玉米泛素启动子Zmub1-1 (Christensen and Quail, TransgenicRes, 5:213-8),或水稻泛素启动子(Wang and Oard, Plant Cell Reports, 22:129-134),或水稻 Actin 启动子(McElroy et al, Plant Cell2:163-171 )，或 CaMV35S 启动子，或其它在水稻中有活性的启动子，終止子可为广泛利用的CaMV35S終止子、Nos終止子等。[0030]在本发明中，为使得到的转基因水稻能稳定传代，目的基因表达框与定向抑制的苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6的表达框紧密连锁。这种连锁在本发明中是通过插入DNA片段的构建来实现:即将目的基因表达框和苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6表达抑制框连接在同一个载体上，转化时它们在同一个T-DNA片段上导入植物染色体中。例如利用农杆菌转化时，则是连接在同一个T-DNA片段中；利用基因枪方法时，则连接在同一个载体上的同一个DNA插入片段中。
[0031]具体地:
[0032]1.内源miRNA至少具有以下核苷酸序列编码:SEQ ID NO:1。
[0033]2.被抑制表达苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6至少具有以下核苷酸序列编码:SEQ ID NO:2。
[0034]3.amiRNAs至少具有以下核苷酸序列:
[0035]
【权利要求】
1.利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于:在表达外源基因的同时，利用内源性miRNA作为前体，定向抑制水稻中除草剂解毒酶表达，从而获得安全、可选择灭杀的转基因水稻。
2.根据权利要求1所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于:将外源基因表达框与定向抑制解毒酶的amiRNAs表达框构建在同一个植物表达载体上； 所述amiRNA表达框包括由启动子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和終止子功能性连接而成。
3.根据权利要求2所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于:表达的外源基因为医用蛋白基因、エ业酶基因、抗虫基因或抗除草剂基因。
4.根据权利要求3所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于:作为前体的内源性miRNA命名为0S-528，其多核苷酸序列为SEQ ID N0:1。
5.根据权利要求4所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于:除草剂解毒酶基因为CYP81A6，其多核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
6.根据权利要求5所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在干:在水稻中表达外源基因的同时定向抑制苯达松或磺酰脲类除草剂解毒基因CYP81A6的表达，所得的转基因水稻就能被苯达松或磺酰脲类除草剂选择灭杀。
7.根据权利要求6所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于:
8.根据权利要求7所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于:所得的载体为1300-35S-Ubq-1174-Ubq_CYP81A6i，将所述.1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i载体导入水稻中，最终获得抗草甘膦而对除草剂苯达松敏感的转基因水稻。
【文档编号】C12N15/84GK103602705SQ201310558050
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】刘明宏, 沈志成 申请人:浙江大学