水稻OsMADS27基因在促进直根系植物侧根生长中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻OsMADS27基因在促进直根系植物侧根生长中的应用，所述水稻OsMADS27基因的碱基序列如SEQ?ID?No.1所示。所述应用包括：将水稻OsMADS27基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；将重组表达载体转化受体植物。本发明通过克隆水稻OsMADS27基因，并利用该基因对拟南芥等直根系植物进行遗传转化，使之过表达外源水稻OsMADS27基因，从而能够促进植物侧根的发生和生长，试验结果显示，外源NO3-与OsMADS27基因对受体植物的生长促进作用是协同的。本发明有助于研究与水稻侧根发育相关的氮素关键调控基因，对能够高效吸收养分的植物品种的筛选和选育具有重要意义。
【专利说明】水稻0sMADS27基因在促进直根系植物侧根生长中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，尤其涉及水稻〇sMADS27基因在促进直根系植物 侧根生长中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，我国是世界上最大的水稻生产和消费国。 杂种优势的成功利用使得水稻产量得到了极大的提高，为解决世界范围内的粮食危机做出 了巨大的贡献。但是，自20世纪80年代以来，杂交水稻的产量就处于徘徊不前的局面。氮 肥在水稻生产中的投入正成为增产的有力措施之一，但是大量氮肥的投入，不仅降低了氮 素利用效率，同时也带来了资源的浪费以及水体的富营养化等一系列环境问题。目前人们 在两个方面进行调节来提高氮素利用效率，一是提高根质膜对NH 4+的吸收能力；二是改进 对氮敏感性高的根部结构，即扩大根的吸收面积。因此，研究水稻根系响应氮素营养的分子 机制，充分挖掘水稻自身吸收利用氮素的潜力以提高水稻氮素利用效率，不仅对于解释植 物根系生长的可塑性具有重要的理论意义，而且对于提高水稻单位面积的产量具有重要的 生产实践价值。
[0003] 根系作为植物的一个重要的吸收、合成、固定和支持器官，在作物的生长发育过程 中起着重要的作用，健壮的根系能够为植物生长提供充足的养分和水分，是植物高产的基 础。目前，国际上己将根系研究作为进一步提高农作物生产力的一个极具潜力的基础性科 研课题。水稻根系既是吸收养分和水分的重要器官，也是很多物质同化、转化或合成的场 所，还是与地上部进行物质交流的代谢器官。其生长情况与活力会直接影响整个水稻的生 长发育、营养水平和产量水平。并且，在资源富集的条件下，根系分枝的增加与提高环境中 的资源精确吸收利用密切相关，所以对于根系吸收营养机制的研究非常依赖于对于内在和 外在的营养因子如何影响根系分枝的了解。
[0004] 上述研究结果虽然为研究氮素对水稻根的形态建成及根系对氮素的吸收利用积 累了非常有价值的原始资料，但是这些研究大多数都集中在现象的观察和物质含量的变化 测定方面，而没有深刻解释变化的内因，因此离认识氮素与水稻根系的生长之间的关系的 本质还存在很大的距离。因此，借鉴模式植物中养分吸收利用研究的思路和技术手段，分离 和鉴定水稻中与氮素吸收相关的关键基因，对于阐明水稻的氮素吸收利用及其调节的分子 机制具有重要的理论意义，同时也对与利用现代生物技术手段培育氮素高效吸收利用的水 稻新品种具有潜在的实践价值。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了水稻0sMADS27基因在促进直根系植物侧根生长中的应用，在拟南 芥等直根系植物中外源表达水稻〇sMADS27基因能够促进侧根的发生和生长。
[0006] 水稻0sMADS27基因在促进直根系植物侧根生长中的应用，所述的水稻0sMADS27 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0007] 所述应用包括：
[0008] (1)将所述水稻0sMADS27基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；
[0009] (2)将所述重组表达载体转化受体植物。
[0010] 重组表达载体的构建可采用常规方法，如可采用Gateway系统（Invitrogen公司） 将水稻0sMADS27基因连入植物表达载体中。
[0011] 所述的植物表达载体可选用PH2GW7或PK2GW7。
[0012] 转化受体植物时，可采用农杆菌介导转化的方法，所述农杆菌具体可以为农杆菌 GV3101、EHA105 等。
[0013] 本发明中，所述受体植物为拟南芥等直根系植物；所述拟南芥为Columbia型。
[0014] 利用所述水稻0sMADS27基因对拟南芥等直根系植物进行遗传转化，经测试发现， 转基因植株第一侧根的发生时间较野生型提前了，主根和侧根的生长速度比野生型要快， 从而能够促进直根系植物幼苗的早期生长发育。
[0015] 本发明还提供了一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目的基 因，所述目的基因的碱基序列如SEQ ID No. 1所示。所述重组表达载体的构建方法同上。
[0016] 所述重组表达载体中，启动所述水稻0sMADS27基因表达的启动子为强启动子。作 为优选，所述强启动子为35S。强启动子能够强启动子能够有效提高外缘基因的表达水稻， 启动水稻0sMADS27基因过表达，可促进侧根的发生和生长。
[0017] 所述原始载体即为上述的植物表达载体，可选用PH2GW7或pK2GW7。
[0018] 本发明还提供了一种包含所述植物表达载体的转化子。
[0019] 所述转化子的宿主菌可以为农杆菌，具体可以为农杆菌GV3101或EHA105。
[0020] 利用所述转化子侵染受体植物，即可实现重组表达载体向受体植物的转化。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0022] 本发明通过克隆水稻0sMADS27基因，并利用该基因对拟南芥等直根系植物进行 遗传转化，使之过表达外源水稻0sMADS27基因，从而能够促进直根系植物侧根的发生和生 长，促进直根系植物幼苗的早期生长发育，在外源NCV存在的情况下，促生长效果更为显 著，试验结果显示，外源NCV与0sMADS27基因对受体植物侧根的生长促进作用是协同的。
[0023] 本发明有助于研究与水稻侧根发育相关的氮素关键调控基因，对能够高效吸收养 分的植物品种的筛选和选育具有重要意义，同时也可为解释水稻氮素利用的生理机制、提 高水稻的氮素利用效率及其品种遗传改良提供理论依据和技术支撑，具有重要的理论意义 及潜在的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为不同浓度ΚΝ03和0sMADS27基因过量表达对转基因拟南芥的生长促进作用 效果图；
[0025] 其中，first LRs表示第一侧根，PR表示主根，PR彡2cm表示主根长度大于等于2cm， AdvancemenU% )表示生长促进率（％);"**"表示与野生型拟南芥相比差异显著，"***" 表示与野生型拟南芥相比差异极为显著。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步阐释。
[0027] 实施例1制备转基因拟南芥
[0028] (1)取水稻幼苗的根，液氮研磨，加入TRIzol试剂（Invitrogen公司），提取RNA。 取0. 5 μ g RNA进行反转录反应得到cDNA。
[0029] (2)根据Genbank上的0sMADS27基因序列设计特异引物，分别在引物5'端加上 Sal I和Not I限制性酶切位点，序列如下：
[0030] 上游引物：5, -GCGTCGACATGGGGAGGGGGAAGATTGT-3'（SEQ ID No. 2);
[0031] 下游引物：5' -TTGCGGCCGCTCATGGATTCAACTGTAACC-3'（SEQ ID No. 3)。
[0032] (3)以全长cDNA为模板进行PCR扩增。
[0033] 采用高保真酶 PrimeSTAR? HS DNA Polymerase (TaKaRa Code :DR010A)体系：
[0034] 5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μ 1,
[0035] dNTP Mixture (各 2. 5mM) 4 μ 1，
[0036] 上游引物（10 μ M) 1 μ 1，
[0037] 下游引物（10 μ Μ) 1 μ 1，
[0038] 模板 cDNAlyl，
[0039] PrimeSTAR? HS DNA PolymeraseO. 5 μ 1,
[0040] 灭菌蒸馏水加至总体积50 μ 1。
[0041] PCR循环条件为：98°C预变性5分钟，98°C变性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸90 秒，扩增30个循环，最后72 °C延伸10分钟，结束反应。
[0042] (4)将PCR产物回收后通过酶切连接到Gateway克隆系统入门载体pENTRlA，转化 大肠杆菌DH5 α，测序并分析，〇sMADS27基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0043] (5)将测序正确的含0sMADS27全长CDS的pENTRlA质粒与过量表达载体pH2GW7 进行LR交换反应。
[0044] 使用 Gateway LR Clonase TM Enzyme Mix (Invitrogen 公司，Cat. No. 11791-019)， 体系如下：
[0045] Entry clone (入门载体）50_150ng，
[0046] Destination vector (目的载体）150ng，
[0047] 5 XLR Clonase Reaction Buffer2 μ 1，
[0048] ddH20 up to8 μ 1,
[0049] 加入2 μ 1 LR Clonase enzyme mix,短暂润旋两次混勻，轻微离心，于25°C水浴 8h，然后加入Ιμ? Proteinase K solution (蛋白酶K溶液）混匀，37°C放置10分钟结束 反应。
[0050] 取5μ 1反应产物转化大肠杆菌DH5ci，挑取单菌落经PCR验证阳性克隆，阳性克隆 培养后提取质粒进行双酶切验证，获得重组表达质粒。
[0051] (6)转化农杆菌
[0052] 从_80°C冰箱中取出ΕΗΑ105感受态细胞，置于冰上解冻，取2μ 1左右的重组表 达质粒加到感受态细胞中，混匀后置于冰上30min，再将离心管内的所有混合物加到预冷 的电击杯内，冰上放置。打开伯乐电转仪，程序调至Agr，吸取lml的LB液体营养基，将电 击杯凸点朝内推入电转仪，按一下plus键，听到蜂鸣声，迅速拿出电击杯，并向电击杯中加 入lml的LB液体营养基，重悬细胞，转移至1. 5ml的离心管内，放在eppendorf混合仪内 28°C，700rpm摇2. 5h以上，涂布于抗性YEP平板上（Rif (利福平）50mg/L，Spec (盐酸大观 霉素）100mg/L)，28°C倒置培养2个晚上以至长出单菌落。
[0053] (7)挑取长出的农杆菌单克隆至含有相应抗生素的5mL YEP液体培养基中（相应 抗生素为Rif50mg/L specl00mg/L)，28°C150rpm振荡培养48小时。将新鲜菌液接种至 200ml的含有相应抗生素的YEP液体培养液内，28°C，160rpm扩培养至0D 6(?为1. 2-1. 6,4°C 下以4000rpm离心15min后收集菌块，将菌块重悬于渗透缓冲液内（MgCl210mM，鹿糖5%, SilwetO. 05% )，使菌液的0D_为0· 6-0. 8,放置在冰上。
[0054] (8)用拟南芥花浸法转化拟南芥：
[0055] 1)将果荚去除干净的、剩下花序的拟南芥整株与穴盘一起倒扣于农杆菌的菌液 里，浸苗5min，期间不断地摇晃菌液；
[0056] 2)侵染完后，取出植株，侧放于托盘内，覆盖避光的黑色塑料布，放置在生长室内， 24h后揭开；
[0057] 3)将拟南芥植株置于自然光照的条件下进行培养，每周浇1-2次水。待种子成熟 后，收获L代种子；
[0058] 4)将收获的TQ代种子杀菌消毒后，种植在MS+50mg/L Hygromycin的固体培养基 内，4°C黑暗春化3d后，将培养皿置于人工气候箱内培养，观察拟南芥植株的生长状况。具 有潮霉素抗性的转基因种子将会在筛选培养基内生长，而非转基因的种子萌发后不久就白 化死去。
[0059] 实施例2转基因拟南芥的侧根生长观察统计
[0060] 拟南芥是主根系植物，先长主根，待主根生长一段时间后再发侧根。对获得的转基 因拟南芥（实施例1的?；代种子种植后获得的T3代纯合体）在含不同浓度ΚΝ03的B5改 良培养基上的根系生长情况进行统计。
[0061] 点有转基因拟南芥的板子先放于4°C冰箱两天，然后坚直放入生长室中，每天检查 根系情况，标记第一侧根发生的时间及主根到达2cm的时间，计算转基因拟南芥相对于野 生型拟南芥的第一侧根和主根生长促进率。
[0062] Advancement (生长促进率，％ )的计算公式为：
[0063] Advancement (生长促进率，％ ) = (m cmtraL-d n)/m rantraLX 100% ;
[0064] 其中，m _tMl表示野生型拟南芥的第一侧根发生时间（天数）或主根到达2cm的 时间（天数），d n表示转基因拟南芥的第一侧根发生时间（天数）或主根到达2cm的时间 (天数）。
[0065] 统计结果见表1和图1。
[0066] 表 1
[0067]
【权利要求】
1. 水稻0SMADS27基因在促进直根系植物侧根生长中的应用，其特征在于，所述水稻 OsMADS27基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括： (1) 将所述水稻0sMADS27基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体； (2) 将所述重组表达载体转化受体植物。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述受体植物为拟南芥。
4. 一种重组表达载体，包括原始载体以及插入所述原始载体的目的基因，其特征在于， 所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
5. 如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，启动所述水稻基因0sMADS27表达 的启动子为强启动子。
6. 如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述的启动子为35S。
7. 如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述原始载体为pH2GW7或 pK2GW7〇
8. -种包含如权利要求4?7任一所述重组表达载体的转化子。
9. 如权利要求8所述的转化子，其特征在于，宿主菌为农杆菌GV3101或EHA105。
【文档编号】A01H5/00GK104140971SQ201410352797
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】甘银波, 于春燕, 苏莎, 刘一华, 刘伯涵 申请人:浙江大学