水稻组成型启动子及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程【技术领域】，特别是涉及到一种水稻组成型表达启动子，含有该启动子的植物表达载体和转化子，本发明还涉及上述启动子在植物转基因工程中的应用。本发明提供一种水稻组成型表达启动子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。发明人将含有该启动子DNA序列和GUS基因的植物表达载体经农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因植株，经染色鉴定，GUS基因在水稻各个组织和器官中均有表达，因此本发明提供的启动子能够驱动外源基因在植物中组成型表达，从而培育出理想的、品质更加优良的水稻品种。
【专利说明】水稻组成型启动子及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及一种水稻组成型表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因的表达。
【背景技术】[0002]水稻是分子生物学研究的模式植物之一，也是世界上最重要的粮食作物之一。而组成型启动子为植物基因工程中应用最早、最为广泛的一类启动子。所谓组成型启动子即是在所有组织器官和发育阶段都能够启动基因表达的启动子，具有持续性，不表现时空特异性，RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的。
[0003]目前植物基因工程中普遍使用的组成型启动子主要为花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因NOS启动子，以及玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子。花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子，是植物基因工程现阶段仍在广泛使用的组成型启动子之一，但是CaMV35S启动子具有潜在的增强子的作用，由于其被广泛的用于做筛选标记的启动子，所以很容易导致其它组织特异性表达启动子的特异性丧失(Singer et al.，2011)。除此之外，在单子叶植物中，CaMV35S启动子的表达强度比Ubiquitin启动子要低一些。至于根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Nos启动子和章鱼碱合成酶基因Ocs启动子，它们虽然来自细菌，但都具有植物启动子的特性，比如Clontech公司开发的PBI系列载体就是用Nos启动子来驱动报告基因表达的。
[0004]水稻actin I (Act I)启动子在单子叶植物转化系统中也被广泛运用。另一种研究和使用广泛的组成型启动子是Ubiquitin类启动子,此类启动子在单子叶植物中表达稳定，强度高，正越来越多地被运用到植物基因工程中，目前有文献报道的有玉米来源的 Ubiquitin 启动子(Chrisetnse et al.，1992)、大豆来源的 poly-ubiquitin 启动子(Hernandez-Garcia et al.，2009)、水稻来源的 poly-ubiquitin(Bhattacharyya etal., 2012)启动子和 Switchgrass 来源的 poly-ubiquitin 启动子(Mann et al., 2012)等。
[0005]在转基因育种或用于研究基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。一方面，为了精确的控制目的基因的表达水平；另一方面，为了避免同时使用同一个类型启动子驱动多个外源基因而导致基因沉默或共抑制的现象，需要不同的启动子。目前，一些新的组成型启动子也被陆续分离出来并得到运用，如带了转运肽的ibAGPl启动子(Kwak et al.，2007)在双子叶植物的转化方面就有很强的优势，油棕榈来源的TCTP基因启动子在油棕榈的转化系统中就有很好的运用前景(Masura et al.，2011)。在过去的十年中，从水稻中已获得了大量优良的功能基因，而对组成型启动子的报道却相对较少，其数量远远不能匹配基因数量的增长。众所周知，水稻是我国的主粮之一，因此，分离鉴定天然或者人工合成组成型启动子对我国水稻转基因育种具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明旨在提供一种驱动外源基因在水稻各部位组成型表达的启动子并获得含有该启动子序列的转化子、植物表达载体、宿主菌，以及所述启动子、转化子、植物表达载体、宿主菌的应用 。
[0007]本发明所提供的水稻组成型表达启动子，来源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare),其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或者为下述之一:
[0008]具有SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列；
[0009]具有在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或
[0010]一个以上的核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物，并与SEQ ID N0:1
[0011]所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
[0012]具体而言，发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到基因启动子序列，其结构包括转录起始位点在内的2100bp的DNA序列，将称之为pCON启动子。
[0013]在本发明的一种优选技术方案中，提供一种重组载体，其通过将包含上述核苷酸序列的组成型启动子与载体相结合而构成。
[0014]在本发明的一种优选技术方案中，提供一种转化子，其特征在于，所述转化子含有上述水稻组成型表达启动子PCON或植物表达载体及宿主。
[0015]在本发明的另一种优选技术方案中，所述转化子为细胞系、愈伤组织或转基因植株。
[0016]在本发明的另一种优选技术方案中，提供一种宿主菌，其含有所述启动子、或者含有所述的植物表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0017]在本发明的另一种优选技术方案中，提供了所述植物组成型表达启动子在培育转基因植物中的应用中，所述转基因植物为水稻。
[0018]在本发明的另一种优选技术方案中，提供了一种上述技术方案中的组成型表达启动子的在植物转基因工程中的应用，其中，将所述启动子与目标基因融合，转化到植物细胞、植物组织或植物器官中，并将相应植物培育成植株，实现目标基因在植物中各个部位表达，从而达到对植物品质的改良。优选地，所述植物为水稻。
[0019]本发明的具体内容是:
[0020]从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到基因启动子序列，其结构包括转录起始位点在内的2100bp的DNA序列，我们称之为pCON启动子，该序列经酶切后连接到植物双元表达载体PCAMBIA1381上，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测，发现转基因植株整体上的Gus基因表达水平较高，各个组织和器官都显蓝色，证明该2100bp启动子序列具有驱动基因表达的活性。
[0021]本发明提供的启动子序列可与植物双元表达载体连接，可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后可驱动靶标基因在水稻中的组成型表达，提高外源基因在植物中的表达量，增加转基因的效果，对作物性状产生积极的影响。
[0022]本发明的技术效果表明，所克隆的水稻启动子pCON能够调控基因在水稻各个组织和器官均有表达，在实际应用中具有一定的价值，在转基因育种或用于研究基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。组成型启动子在植物基因工程的研究中发挥着巨大的作用，并且在研究未知基因的功能如过量表达该基因方面仍然有很大的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1中的A部分为植物表达载体PCAMBIA1381的示意图；
[0024]图1中的B部分为利用pCON启动子驱动⑶S表达的载体pCAMBIA1381_pC0N示意图。
[0025]图2A-C为利用pCON启动子驱动Gus基因表达情况的分析，其中，图2A为野生型水稻各部位Gus染色结果，图2B为35S染色结果，图2C为pC0N_pCAMBIA1381转基因水稻各部位Gus染色结果；并且，在图2A-2C中的字母所表示的部分如下:A表示根、B表示茎、C表示叶、D表示叶鞘、E表示叶枕、F表示花、G表示种子、H表示胚乳横切面。
【具体实施方式】
[0026]现结合实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
[0027]实施例1、含有酶切位点的pCON启动子的获得
[0028]步骤1、引物的设计
[0029]根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativaL cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻pCON基因的上游2IOObp序列设计扩±曾引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点，在本实施例中以水稻双元表达载体PCAMBIA1381 (来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为:正向引物5’端带E.coRI,酶切位点(GAATTC),反向引物5’端带Hindlll，酶切位点酶切位点(AAGCTT),引物序列如下:
[0030]正向引物:GAATTCTCGATACGATCATCGGGGTTGT E.coRI
[0031]反向引物:AAGCTTGACGGCGGCGAGCTATTGGCGG HindIII
[0032]由深圳华大基因公司合成。
[0033]步骤2、启动子pCON的获得
[0034]以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、正向引物扩增启动子pCON，按常规PCR体系，扩增程序如下:
[0035]95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s, 72°C延伸 2min30s，35 个循环；最后 72°C延伸 IOmin0
[0036]回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2100bp，并连接到T载体上，按照热激法转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，再经菌落PCR筛选获得阳性克隆，然后，挑取单克隆摇菌液提质粒，用E.coRI和HindIII进行双酶切验证。验证正确的克隆即为所要获得的启动子pCON，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0037]实施例2、植物表达载体的构建和农杆菌的转化
[0038]将实施例1获得的克隆中提取质粒，用E.coRI和HindIII双酶切，回收启动子pCON片段。同时用E.coRI和HindIII双酶切回收pCAMBIA1381片段，将上述的两个片段用T4连接酶进行连接，得到启动子pCON与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1381-pC0N(如图1),利用冻融法将该植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，提取阳性质粒，用E.coRI和HindIII进行酶切验证。[0039]对照:转CaMV35S:gus作为正对照，同时以Tnos:gus作为负对照。利用冻融法将表达载体pCAMBIA1381转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105,操作步骤及验证同pCAMBIA1381-pC0N的转化方法。
[0040]实施例3、利用启动子pCON驱动Gus报告基因在水稻中表达
[0041]步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0042]成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有I滴Tween20的50%次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4%)溶液浸泡种子40min (150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C暗培养Ild后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5d后用于农杆菌转化。农杆菌介导的遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al.An efficient and high-throughput protocolfor Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.D0I10.1007/s00299-012-1275-3.)等中描述的方法。
[0043]共获得43 株 pC0N-pCAMBIA1381 植株，26 株 35S_pCAMBIA1381 植株和 38 株Tnos-pCAMBIA1381 植株。
[0044]步骤2、⑶S组织化学染色
[0045]参照Jefferson (Jefferson RA et al.GUS fusion: β -Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6:3901-3907)等的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37°C染色24h。脱色时在37°C条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。
[0046]通过⑶S组织染色，检测启动子pCON在水稻转基因植株中对⑶S的启动活性。结果显示，正对照CaMV35S:gus转基因植株的根、茎、叶等各组织均有明显染色(图2A);而负对照Tnos::gus转基因水稻植株各组织中，均未检测到Gus基因的活性(图2B) ；pC0N::gus转基因水稻植株各组织器官经⑶S染色后呈现蓝色，且染色与正对照CaMV35S:gus的转基因植株的染色程度相当(图2C)。结果说明，启动子pCON能够驱动Gus基因在水稻中特异性高水平的表达。该结果表明启动子PCON为组成型启动子。
【权利要求】
1.一种水稻组成型表达启动子，其特征在于:该启动子包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一种水稻组成型表达启动子，其特征在于:所述水稻组成型表达启动子为下述之 具有SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列； 具有在所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上的核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物，并在高严谨条件下与SEQID NO:1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
3.一种植物表达载体，其特征在于:所述植物表达载体含有权利要求1或2所述启动子。
4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为重组载体，所述重组载体是将权利要求1或2所述的启动子的核苷酸编码序列插入水稻双元表达载体PCAMBIA1381的多克隆位点所得到的。
5.一种转化子，其特征在于:所述转化子含有权利要求1或2所述启动子、或者含有根据权利要求3或4所述的植物表达载体。
6.根据权利要求5所述的转化子，其特征在于:所述转化子为细胞系、愈伤组织或转基因植株。
7.一种宿主菌，其特征在于:所述宿主菌含有权利要求1或2所述启动子、或者含有权利要求3或4所述的植物表达载体；其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。
8.一种根据权利要求1 或2所述的启动子在植物转基因工程中的应用，其特征在于，将含有权利要求1或2所述的启动子的核苷酸编码序列的重组表达载体转入单子叶植物水稻愈伤组织，以启动下游基因的表达。
【文档编号】A01H5/00GK103540595SQ201310214044
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年6月1日 优先权日:2013年6月1日
【发明者】杨剑波, 魏鹏程, 李娟 , 张银萍, 李 浩, 李莉 申请人:安徽省农业科学院水稻所