一种黄伞液体菌种与多糖的研究的制作方法
【专利摘要】一种黄伞液体菌种与多糖的研究,属于食用菌栽培学【技术领域】，涉及对黄伞液体菌种与多糖的研究,液体菌种具有生产周期短，菌龄一致，出菇整齐的特点，它是通过深层培养技术得到的，是生长在液体培养基中用于繁殖下一代菌种或栽培的菌丝体。液体菌种具有固体菌种所不能比拟的特点和优势。在我国还未有黄伞大规模栽培的报道，而有一些零散的栽培也仅限于固体菌种的栽培，在制种方式上就大大制约了黄伞的进一步发展，因此就迫切需要用液体菌种来代替固体菌种的栽培。
【专利说明】一种黄伞液体菌种与多糖的研究【技术领域】
[0001]本发明属于食用菌栽培学【技术领域】，涉及对黄伞液体菌种与多糖的研究。
【背景技术】
[0002]生物工程作为生物科学领域的一部分，在二十一世纪将具有广泛的发展和应用前景。随着世界自然科学的研究的发展，我国食用菌的研究领域不断拓宽。作为生物工程之一的发酵工程是生物工程的基础，深层发酵技术是发酵工程的应用，它是在抗生素发酵技术基础上发展起来的，自四十年代末期逐步应用于食用菌，系列研究表明，食用菌深层发酵技术有广泛的应用前景。
[0003]黄伞[Pholiota adipose (Fr.) Quel.],又名柳蘑、黄蘑、多脂鳞伞，是真菌门(Eumycota),担子菌纲(Basidiomycetes)，伞菌目(Agaricaies),球盖燕科(Strophariaceae)的一种食用兼药用真菌。该菌菌肉肥厚，味好，滑嫩爽口，可与牛肝菌媲美，是一种风味独特、别具一格的珍菇。其子实体富含蛋白质、脂肪和碳水化合物以及多种维生素和无机盐，对人体健康十分有益，尤其是子实体表面的一层粘液，经生化分析证明是一种核酸，有益于人体精力和脑力的恢复。子实体通过有机溶剂提取的多糖体，对小鼠肉瘤180和艾氏腹水癌的抑制率达80%~90% ;除此外还可预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌和结核杆菌的感染。黄伞在日本市场很受欢迎，在我国也是都市酒楼菜馆的时尚佳肴。因此有着广阔的发展前景，在我国还未有黄伞大规模栽培的报道，而有一些零散的栽培也仅限于固体菌种的栽培，在制种方式上就大大制约了黄伞的进一步发展，因此就迫切需要用液体菌种来代替固体菌种的栽培。
[0004]“液体菌种”与“固体菌种”是相对而言的，通过深层培养技术得到的，它指的是生长在液体培养基中用于繁殖下一代菌种或栽培的菌丝体。液体菌种具有固体菌种所不能比拟的特点和优势:
生产周期大大缩短
制备液体菌种一般只需:3~7天，周期短，速度快；而培养一瓶固体栽培种需30-50天。此外，以液体菌种作为原种来扩大培养栽培种时，也比采用固体菌种快的多，而且用此法生产的固体菌种具有各瓶菌丝生长速度均匀，死菌(菌丝不萌发)率低等优点。用这种栽培种进行床栽、袋栽、砖栽、地栽，其产菇(耳)的质量和产量均等同或高于使用固体原种的栽培种。也可将液体菌种直接当作栽培种，接种于培养料内生产，这要比固体菌种早熟10-20天。因为液体菌种有流动性，各个菌丝球和菌丝片断可以流散在不同的部位萌发，发育点多，减少了接种的污染(用固体种污染率为5%，而用液体种污染率只是1%)，同时长满袋所需的时间也就大大缩短。
[0005]菌龄一致，出菇(耳)整齐，便于管理
由于固体菌种是靠接种块上的菌丝蔓延长成的，另外接种只能在培养基表面，这样不但培养菌种的速度慢，而且处在菌种瓶上部和下部的菌丝体菌龄差异很大，一般相差20-30天。往往当下部菌丝长到瓶底时，处在上部的菌丝就接连老化。而液体菌种则不一样，它们生长发育均匀一致，菌龄整齐，深层培养3~7天时的菌丝体正值旺盛生长期，接种后萌发快，发育健壮。用其拌料栽培，其菌丝体生长速度一致，现蕾及出菇时间较一致，便于管理、采收与加工。对熟料栽培的种类尤其是袋栽更为适合，因此同样的培养基采用液体菌种接种，其养菌时间仅为固体种的1/2。这样更为缩短养菌期提供了保证。
[0006]菌种的成本低
采用该工艺发酵生产液体菌种，产量高、原料便宜，成本较固体菌种要低。
[0007]接种方便
呈流质状态的液体菌种便于接种工艺的机械化、自动化，有利于工作效率的提高。便于进行大规模工厂化生产，并在很大程度上降低了劳动强度。
[0008]便于获得更多的目的产物
一些不能进行人工栽培的野生菌可通过深层发酵获取目的产品，如多糖、氨基酸等。
【发明内容】
[0009]黄伞深层培养系统的优化研究 I材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种黄伞由山东省食用菌工作站提供 1.1.2母种培养基
加富PDA:马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，麦麸滤液5%，蛋白胨0.5%，Vbi0.001%，KH2PO40.3%, MgSO40.25%.1.1.3 一级摇瓶培养基
马铃薯 20%,麦麸滤液 3%，葡萄糖 1%，蛋白胨 0.2%，KH2PO40.2%，MgSO4 0.1%，VB10.001%
1.1.4碳源供试培养基
马铃薯 20%，蛋白胨 0.2%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，Vbi0.001%，碳源。分别用 1% 的葡萄糖、红糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉替换其中的碳源。
[0010]1.1.5氮源供试培养基
马铃薯 20%，葡萄糖 1%，KH2PO4 0.2%，MgSO4 0.1%，Vbi0.001%，氮源。分别用 0.2% 的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NH4N03、NH4C1、(NH4)2SOjP 3%的麦麸滤液替换其中的氮源。.1.1.6碳氮比供试培养基
蛋白胨0.3%,KH2PO40.2%,MgSO40.10Zo7VB10.001%，葡萄糖。以蛋白胨为基数固定含氮量，折算葡萄糖含碳量，根据碳氮比10:1、20:1、30:1、40:1、50:1分别加入葡萄糖。
[0011]1.2 方法
1.2.1培养基制备
马铃薯削皮后切成块，与麦麸一起放入水中，煮沸后维持25min左右。八层纱布过滤后取滤液，然后分别加入各药品，定容。固体培养基分装入试管，装量为试管的1/ /3，121°C灭菌0.5h取出摆斜面。液体培养基分装于500ml锥形瓶，每瓶装150ml，121°C灭菌0.5h.。
[0012]1.2.2菌种活化
将保藏的菌种无菌操作接至斜面，25°C下培养一周左右，此时菌丝长满斜面，即可使用。[0013]1.2.2液体菌种的制备
无菌操作从斜面上取大小相近的0.5 cm X 0.5 cm的母种块，接种于液体培养基中(菌块要薄尽量使菌块漂浮在液面上)。每瓶接种4飞块。25°C静置24h，然后置于25°C，160 r/min左右旋转式摇床上培养6天左右。
[0014]1.2.3接种二级摇瓶无菌操作，接种量为10%，置于旋转式摇床上25°C，160r/min培养4~5天。每组设6次重复。
[0015]1.2.4结果处理
①菌球体积比的测定将发酵液倒入量筒中，充分静止后，测量菌球体积，计算其体积比。
[0016]②菌球的数目和大小测定用移液管从量筒中分别吸取Iml发酵液放入3个培养皿中，培养皿下方衬以方格纸，测量菌球直径并记录菌球数目。
[0017]③菌丝生长量的测定将发酵液用脱脂棉过滤后，再用蒸馏水冲洗数次，浙干，然后在60°C烘箱中烘干至恒重，用电子分析天平称重。
④碳氮比试验发酵液pH值的测定用精密pH计,测定发酵前的pH值和发酵后的pH值。
[0018]2结果与分析
2.1不同的碳源对黄伞液体培养的影响
2.1.1碳源试验结果见表1 表1不同碳源对黄伞液体培养的影响
【权利要求】
1.黄伞液体菌种与多糖的研究，其特征在于黄伞液体培养基最适碳氮源的筛选、黄伞液体培养基的正交试验研究、不同碳氮源浓度对黄伞深层培养的影响、黄伞深层培养条件的研究、黄伞液体菌种发酵罐培养的研究、黄伞多糖提取工艺的研究、黄伞多糖抗疲劳的研究、不同培养基对黄伞菌丝生长及出菇的影响、黄伞液体菌种发菌特点及栽培方式的研究。
2.如权利要求1所述的黄伞液体培养基最适碳氮源的筛选，其特征在于通过对设计的有关配方的试验，筛选出最适合黄伞生长的碳源、氮源及碳氮比，结果为最适宜的碳源是葡萄糖，最适宜的氮源是蛋白胨、麦麸、牛肉膏，最适宜的碳氮比是40:1。
3.如权利要求1所述的黄伞液体培养基的正交试验研究，其特征在于筛选出较优的碳源、氮源，设计三因素四水平的正交试验，筛选黄伞的最适培养基，最适培养基为马铃薯20%、红糖1%、酵母膏0.2%、MgS040.1%、KH2P040.2%、VB10.001%，按此试验方案进行培养，黄伞菌丝体的产量为17.52g/L。
4.如权利要求1所述的不同碳氮源浓度对黄伞深层培养的影响，其特征在于适宜黄伞深层培养的碳源浓度为2.0%、3.0%和2.5%，适宜氮源浓度为0.3%、0.1%和0.2%，最适培养基为马铃薯 20%、葡萄糖 2.0%、蛋白胨 0.l%、MgS040.10%、KH2P040.20%、维生素 BI 0.001%。
5.如权利要求1所述的黄伞深层培养条件的研究，其特征在于通过对黄伞液体菌种培养进行不同温度、不同PH值、不同转速、不同瓶装量、不同粘度和不同接种量的设定，测得黄伞深层培养的最佳条件是:温度为25~28°C，pH为5.0~6.0，转速为15(Tl80r/min，瓶装量为210mL/500mL，粘度为添加(H).5%的琼脂(一般不必添加)，接种量为15%左右。
6.如权利要求1所述的黄伞液体菌种发酵罐培养的研究,其特征在于通过对5L发酵罐的试验可以看出，黄伞深层培养的PH值先上升后下降，尔后又上升；溶氧则随着菌丝体的生长逐渐下降，到最低点后又开始缓慢回升，菌丝体的干重一直呈上升的趋势，达到最大值后就不再增加，还原糖则一直下降，由此可以初步判断黄伞发酵的终点为60hr左右。`
7.如权利要求1所述的黄伞多糖提取工艺的研究，其特征在于研究结果表明，子实体多糖提取的最佳条件:料液比1:40，浸提温度120°C，浸提时间2h ;而菌丝体多糖提取的最佳条件:料液比1:30，浸提温度100°C ;浸提时间4h。
8.如权利要求1所述的黄伞多糖抗疲劳的研究，其特征在于黄伞高浓度组(lmg/ml)多糖能延长最大收缩幅度下降到10%的时间，中浓度组(0.2mg/ml)多糖和低浓度组(0.02mg/ml)多糖都能延长最大幅度下降到90%、50%、10%的时间，因此，黄伞菌丝体多糖具有延缓疲劳作用。
9.如权利要求1所述的不同培养基对黄伞菌丝生长及出菇的影响，其特征在于根据黄伞在不同培养基上的生长状况，筛选了适宜于其生长的母种培养基、液体培养基和栽培料培养基，结果表明，母种培养基的最优配方为:马铃薯20%，红糖2%，蛋白胨0.5%，维生素B10.001%,琼脂2%，液体培养基的最优配方为:马铃薯20%，红糖2%，酵母膏0.5%，KH2P040.25%，MgS04 0.15%，维生素B10.001%，栽培料培养基的最优配方为:棉籽壳28%，木屑50%，麦麸20%，白糖1%，生石灰1%。
10.如权利要求1所述的黄伞液体菌种发菌特点及栽培方式的研究，其特征在于黄伞液体菌种的萌发时间、生长速度、满袋时间及污染率很明显优于固体菌种，黄伞液体菌种的栽培方式以脱袋立埋方式最好。
【文档编号】A01G1/04GK103733873SQ201310213973
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年6月3日 优先权日:2013年6月3日
【发明者】蔡德华 申请人:鲁东大学