专利名称：一种成年大鼠窦房结精确定位和取材的方法
技术领域：
本发明涉及一种实验材料的取材方法，具体涉及对成年大鼠窦房结快速定位及精确取材的方法，本发明还涉及对成年大鼠窦房结连续切片肉眼精确定位方法。
背景技术：
大鼠是最常用的实验动物之一。在医学实验研究中，大鼠的窦房结定位是一项技术难题。窦房结(sinoatrialnode,以下或简称SAN)是哺乳动物心脏正常节律的起搏点，正常的SAN功能是心脏泵功能得以实现的前提条件。大鼠的窦房结解剖位置隐蔽，体积小， 仅通过肉眼观察难以发现，然而其在心脏自律性活动中却占有非常重要的位置。关于成年大鼠SAN的位置和切取方法，目前尚存争议。有研究报道，人及大多数哺乳类动物的SAN位置大致位于上腔静脉与右心耳交界处以下，结的长轴与界沟平行，大多数偏静脉窦侧，结的上端可达界沟与右心耳嵴交界处，下端可达下腔静脉口。但有关大鼠SAN位置的研究结果相去甚远，有研究认为大鼠SAN绝大多数位于界嵴腔静脉窦侧心外膜下，少数位于界嵴处或偏右心耳侧。也有研究认为，新生SD大鼠SAN位于上腔静脉与右心房交界处以上的上腔静脉近侧段壁内，呈马蹄形。而有关SAN的定位方法描述，如①在上腔静脉旁的心外膜下，心肌细胞分布疏松，染色较淡，胶原纤维和结缔组织成分较多；②距SAN中央区不远处有较多的神经节细胞、神经纤维和脂肪组织，由此从心外膜向内膜比较容易找到结中央区；③有结动脉，不一定都位于SAN的中央。而关于心脏SAN的切取方法，目前研究认为通过大体和体视显微镜确定其部位有技术上的困难，只有通过连续切片才能成功地进行研究，人及大多数哺乳类动物的SAN位置大致位于上腔静脉与右心耳交界处以下，窦房结的长轴与界沟平行，大多数偏静脉窦侧，窦房结的上端可达界沟与右心耳嵴交界处，下端可达下腔静脉口。以上各种研究从定位、取材的角度讲都不够准确。由于现有技术无法较为精确地确定成年大鼠SAN的位置,实验中对大鼠SAN取材定位不明确；心脏SAN的切取过程中，常常需要切片近千张，工作量庞大。因此建立大鼠SAN的准确定位并清晰显示的方法对SAN基础研究和临床相关疾病的诊治均具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是建立一种方法，能够对成年大鼠SAN准确定位并清晰地显示出，使实践中可准确切取成年大鼠SAN，而且该方法应该简单、快速。本发明需要解决的技术问题是对成年大鼠窦房结的定位和取材，本发明进行了如下研究I、宏观定位、精确取材方法；2、连续切片肉眼精确定位方法。本发明的技术方案是
一种对成年大鼠窦房结的定位和取材方法，包括宏观定位和精确取材步骤，其特征是，所述宏观定位是将大鼠窦房结定位于上腔静脉近心端壁内并延伸至右心房与上腔静脉交界区，并用在体缝线打结法标记右上腔静脉；所述精确取材是在宏观定位的基础上，沿上腔静脉远端取下大鼠心脏。所述用在体缝线打结法标记右上腔静脉是在大鼠胸腔内寻找右侧上腔静脉，用O号缝线在静脉远心端打结做标记；所述沿上腔静脉远端取下大鼠心脏是沿上腔静脉远端、离断其它与心脏相连的根部大血管，取下完整心脏；然后剪下右心房及与之相连的上腔静脉近心段，分离并去除上腔静脉周围的结缔组织。所述精确取材还包括对取材的窦房结进行固定，方法是先进行组织修剪，修剪的标准是以上腔静脉与右心房交界区为中心，在向上向下各1.5mm处横断上腔静脉与右心房；然后用滤纸包裹取好的组织入10%中性缓冲福尔马林固定；将固定后的组织脱水后用石蜡包埋。所述包埋方向为上腔静脉远端向下、静脉壁立埋。 上述精确取材还包括通过连续切片定位窦房结的步骤，方法是用切片机对石蜡包埋的组织连续切片，切片过程中同时用肉眼观察窦房结在上腔静脉壁的位置和形态，以定位窦房结。所述切片方向为自上腔静脉断端至心房，切片厚3μπι;所述观察窦房结在上腔静脉壁的位置和形态为，当静脉壁局部开始增宽，并且增宽处静脉壁上出现明显动脉管腔时，表明是窦房结开始出现的部位。具体操作步骤如下I、宏观定位大鼠胸腔内寻找右侧上腔静脉，用O号缝线在静脉远心端打结做标记。2、取材沿上腔静脉远端、离断其它与心脏相连的根部大血管，取下完整心脏；剪下右心房及与之相连的上腔静脉近心段，分离并去除上腔静脉周围的结缔组织；3、固定固定前先进行组织修剪，修剪的标准是以上腔静脉与右心房交界区为中心，在向上向下各I. 5mm处横断上腔静脉与右心房；然后用滤纸包裹取好的组织(防止组织折叠卷曲)入10%中性缓冲福尔马林固定；将固定后的组织脱水后用石蜡包埋，包埋方向为上腔静脉远端向下、静脉壁立埋。所述连续切片肉眼定位方法是用切片机对上述石蜡包埋的组织连续切片，切片方向为自上腔静脉断端至心房，切片厚3 μ m，切片过程中同时用肉眼观察切片中上腔静脉壁的形态，当静脉壁局部开始增宽，并且增宽处静脉壁上出现明显动脉管腔时，表明是SAN开始出现的部位。本文中所述的“上腔静脉”亦可称为“前腔静脉”。本发明用以下方法分别确认了上述方法对成年大鼠窦房结是精确定位并取材的I、大鼠SAN组织染色HE染色和Masson三色染色同时进行。对上述切片进行快速HE染色，通过光镜观察证实含有SAN组织。2、大鼠SAN组织电镜标本制作将大鼠SAN组织半薄切片与甲苯胺蓝快速染色定位；经大鼠SAN组织电镜标本精确定位和染色证实是大鼠SAN组织。本发明在进行SAN取材时保留上腔静脉的近心段。因为发现成年大鼠SAN位于上腔静脉近心端壁内并延伸至右心房与上腔静脉交界区；在宏观定位的基础上，采用在体缝线打结法标记右上腔静脉的方法可以准确取到成年大鼠的SAN组织。在体缝线打结法确保了对上腔静脉取材的准确性和SAN组织的完整性、缩短了取材时间，有助于成年大鼠SAN准确取材；SAN精确取材方法准确、可靠，可以增加SAN取材的精确程度，减少取材部位，减少了病理技术人员的工作量和切片等耗材的用量。本发明提供了一种成年大鼠SAN精确取材及快速定位的方法，连续切片和肉眼定位相结合,并通过HE和Masson染色进行SAN组织形态学观察；通过半薄切片定位和进一步超薄切片进行超微结构观察。对正确判断实验结果、确定准确的电镜取材部位和分离传导 细胞进行体外培养等均有重要意义。本发明将现有的病理技术系统化，建立了对大鼠SAN进行在体定位、精确取材及连续切片时肉眼定位的方法，本方法主要优点是操作简单、省力、快速、结果精确；本发明采用在体缝线打结法标记右上腔静脉、SAN精确取材的方法。在体缝线打结法确保了对上腔静脉取材的准确性和SAN组织的完整性、缩短了取材时间、增加SAN取材的精确程度，减少取材部位，减少了病理技术人员的工作量和切片等耗材的用量。
图I是成年大鼠心脏右侧面观，示右上腔静脉打结标记部位。图2在体成年大鼠心脏右侧面观，示SAN位置。图3成年大鼠右上腔静脉横切面，Λ示静脉壁局部开始增宽处(石蜡切片肉眼观察)。图4成年大鼠右上腔静脉横切面，静脉壁局部增宽处常为SAN开始出现的部位，▲7]\ SAN 动脉(HEscalebar=50 μ m)。图5成年大鼠SAN组织连续切片，★示SAN组织(HE scale bar=50 μ m)0图6成年大鼠SAN组织,示SAN组织结构(HE scale bar=50 μ m)。图7 成年大鼠 SAN 组织，示 SAN 动脉(HE scale bar=50 μ m)。图8成年大鼠SAN组织，示SAN内的P细胞和T细胞(HE scale bar=50ym)。图9成年大鼠SAN组织,示SAN周围的神经节和神经纤维(HE scalebar=50 μ m)。图10成年大鼠SAN组织，★示大鼠SAN组织(Masson染色scale bar=50ym)。图11成年大鼠SAN组织，示SAN内胶原纤维网架和细胞成分(Masson染色scalebar=50μ m)。图12成年大鼠SAN组织，示SAN动脉壁丰富的胶原纤维(Masson染色scalebar=50μ m)。图13成年大鼠SAN组织半薄切片，示SAN组织精确定位结果(甲苯胺蓝染色scalebar=25μ m)。图14成年大鼠SAN内的P细胞，示细胞核圆形或椭圆形，细胞器少，分布不规则，多靠近细胞周边，胞质清亮(TEM scale bar=500nm)。图15成年大鼠SAN内的P细胞，示P细胞膜上小凹结构(▲) (TEMscalebar=500nm)o图16成年大鼠SAN内的T细胞，示细胞器较多，肌原纤维肌节明显，Z线清楚，细胞核与肌原纤维间有线粒体群(TEM scale bar=500nm)。
具体实施例方式I材料和方法I. I实验动物二级Wistar雄性大鼠20只，鼠龄10周，体重250±20g，由军事医学科学院实验动物中心提供并统一喂养。采用标准实验室饲料，自由进食、水，室内温度为21 23°C，相对 湿度60%。1. 2大鼠SAN光镜取材和固定采用缝线打结标记右上腔静脉、大鼠SAN精确取材方法。首先以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(50mg/kg)，解剖胸腔，暴露心脏，在体原位寻找大鼠右侧上(前)腔静脉，用O号缝线在静脉远心端打结做标记(见图I)(原因离体新鲜静脉壁组织非常薄，周围结缔组织很丰富，离体后静脉壁塌陷，与周围结缔组织混杂在一起，难以分辨，导致取材时间延长；而且剔除结缔组织时，容易误伤静脉壁)。然后沿上(前)腔静脉远端、其它与心脏相连的大血管根部离断血管，取下完整心脏，以锐利剪刀剪下右心房及与之相连的上(前)腔静脉，分离并去除上腔静脉周围的结缔组织，最后对取下组织进行进一步修剪，以上(前)腔静脉与右心房交界区为中心，在向上向下各I. 5mm处横断上腔静脉与右心房，以滤纸包裹取好的组织(防止组织折叠卷曲)入10%中性缓冲福尔马林固定。固定后的组织经常规脱水、石蜡包埋(包埋方向上腔静脉远端向下、静脉壁立埋)。I. 3大鼠SAN组织连续切片定位方法采用肉眼观察初步定位和HE染色精确定位法。用LEICARM2255切片机对组织进行连续切片(方向为自上腔静脉断端至心房)，切片厚3 μ m。切片过程中可用肉眼观察切片上的上腔静脉壁的形态，当静脉壁局部开始增宽，并且增宽处静脉壁上出现明显动脉管腔时，此部位一般是SAN开始出现的部位，对切片进行快速HE染色，光镜观察以证实是否含有SAN组织，以备收集阳性组织切片。1. 4大鼠SAN组织染色方法 将含有SAN组织的阳性切片中的每相邻2张为一组，一张进行HE染色、一张进行Masson三色染色，以观察SAN组织形态。I. 4. IHE 染色方法切片经二甲苯(I、II、III)脱蜡，各15min，然后经无水乙醇(I、11)、95%乙醇(I、
II)和90%乙醇各5min，经80%、70%、50%乙醇和蒸馏水各2min，然后经苏木精染色lmin，1%盐酸酒精分色数秒，自来水冲洗反蓝Imin后，用蒸馏水稍洗，经伊红染液10s，蒸馏水冲洗，再经50%、70%、80%和90%乙醇各2min,经95%乙醇(KU、III)、无水乙醇(I、II )各2min，最后经二甲苯(I、II、III)透明处理各lOmin，中性树胶封片，光镜下观察SAN形态结构。I. 4. 2Masson 三色染色法
石腊切片按常规方法脱腊至水,经Regaud苏木素液染5min ；95%乙醇洗2次；在苦味酸乙醇液中分色，流水冲洗；再经丽春红酸性品红染色5min，用蒸馏水稍洗；经1%磷钥酸溶液处理5min，不经水洗，直接用醋酸苯胺蓝复染5min，再经1%冰醋酸处理lmin，然后经95%乙醇、无水乙醇脱水多次，二甲苯透明，用中性树胶封片，于光镜下观察SAN形态结构。I. 5大鼠SAN组织电镜标本制作方法I. 5. I大鼠SAN组织电镜取材方法以1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，解剖胸腔，暴露心脏，寻找到右侧上(前)腔静并用O号缝线在静脉远心端打结做标记。沿上(前)腔静脉远端、其它与心脏相连的大血管根部离断血管，取下完整心脏，立即置于4°C预冷的生理盐水中冲洗残留血液，然后入预冷4°C戊二醛中固定lmin，以锐利剪刀剪下右心房及与之相连的上(前)腔静脉，分离并去除上腔静脉周围的结缔组织，以上腔静脉-右心耳交界区为中心，以锐利剪刀自中心点向上、向下各Imm处横断静脉壁和心房。沿静脉壁长轴纵行剖开组织，在体视学显微镜下 展开，沿静脉纵轴平分成3-4块长方形组织块(ImmX O. 5mmX 2mm)。I. 5. 2大鼠SAN组织电镜固定与包埋方法采用静脉壁定向包埋的方法。①前固定3%戊二醛、0.07mol/LPBS液(ρΗ7·4，下同)4 °C固定2h。②漂洗4°C O. 07mol/LPBS、0. 19mol/L蔗糖缓冲液反复漂洗。③后固定4°C 1%锇酸、O. 24mol/LPBS液固定。④漂洗4°C O. 07mol/LPBS、0. 19mol/L蔗糖缓冲液漂洗15min。⑤脱水4°C条件下，分别经50%乙醇IOmiη>70%乙醇10min、90%乙醇10min、90%乙醇与90%丙酮(I I)混合液10min、90%丙酮10min、100%丙酮15min逐步脱水，最后在室温下100%丙酮15min。⑥浸透室温下经100%丙酮与包埋剂I : I溶液浸透30min，然后入纯包埋剂浸透过夜。⑦包埋沿静脉壁纵轴方向对组织块进行纵向包埋，分别经37°C (12h)、45°C (12h)、60°C (12h)
壞人
口 OI. 5. 3大鼠SAN组织半薄切片与甲苯胺蓝快速染色方法在显微镜下，用刀片修去多余的包埋介质，暴露出组织。取包埋块固定于超薄切片机上，连续切取I μ m半薄切片，将切片转移至滴有蒸馏水滴的载玻片上，在烤片机上烤干。取下带有余温的切片，迅速滴加05%甲苯胺蓝染液(PBS配制)，室温下染色lmin，蒸馏水冲洗后，立即光镜下观察，确定是否含有SAN及其在切片上的确切位置。I. 5. 4大鼠SAN组织电镜标本精确定位和染色方法在体视显微镜下，根据光镜下确定的SAN位置进行修块，然后制作厚度为60nm超薄切片。超薄切片分别经乙酸铀染液避光染色lOmin，柠檬酸铅染色IOmin后，飞利浦透射电镜进行超微结构观察。2 结果2. I大鼠SAN宏观定位结果成年大鼠SAN位于上(前)腔静脉与右心房交界区及交界区以上的上(前)腔静脉壁内，呈马蹄形(见图2)。2. 2大鼠SAN组织连续切片观察初步定位及显微镜下验证结果切片过程中肉眼观察所切下的上腔静脉壁的形态，当静脉壁局部开始增宽时(见图3)，此部位即是SAN开始出现的部位，对该切片进行HE染色，光镜观察以验证是否含有SAN组织(见图4)。镜下观察连续切片，可见到上腔静脉与右心房交界区附近不同的部位的窦房结组织(见图5)。图中，A示上腔静脉与右心房交界区以上，上腔静脉壁内的SAN ;B示上腔静脉与右心耳嵴交界区部位的SAN ；C示上腔静脉与右心房交界区部位的SAN ；D示上腔静脉与右心房交界区以下，可见SAN边缘。 2. 3大鼠SAN组织学特点2. 3. IHE 染色结果SAN内的细胞成分呈浅红色，心肌细胞和血管壁平滑肌细胞呈红色。SAN区染色浅淡，细胞排列稀疏，与周围的心房肌或血管壁平滑肌易于区分。大鼠SAN外形呈马蹄形，由位于内侧壁上的内侧部和位于外侧壁的外侧部以及位于腹侧壁上的连接内、外侧部的腹侧部组成(见图6)。
SAN所在部位，内侧达血管内皮下，外侧达血管外膜下，几乎占据静脉壁全层。在SAN内还可见到I 3条不等的动脉，即SAN动脉贯穿结内各部，多偏居于结的一侧(见图7)。SAN主要包括三种细胞成分起搏(P)细胞(pacemaker cell)、过渡(T)细胞(transistivecell)和少量心房肌细胞。细胞染色与细胞内肌原纤维含量有关，位于SAN边缘的普通心房肌细胞胞浆染色最深，T细胞染色介于心房肌和P细胞之间，P细胞染色最浅。细胞间质主要由纤维和基质等结缔组织(见图8)。P细胞多位于结的内侧膨大区，散在分布或3-5个成群，较心房肌细胞小，细胞界限欠清，细胞多呈圆形、椭圆形、梭形或多边形。细胞核相对较大，呈圆形、椭圆形，位于细胞中央，核染色较淡，偶见双核。由于胞浆内胞质丰富而细胞器相对较少，故使胞浆清亮发空，染色浅淡(见图8)。T细胞又称过渡细胞，由于其大小、形态、细胞内部结构介于P细胞与心房肌细胞之间，故名。细胞多呈长圆柱形、梭形，比心房肌细胞短而窄。细胞内肌原纤维等较P细胞多，可见完整肌节(见图8)。SAN除以上3种细胞外，结内还含有一些纤维细胞和成纤维细胞及较多的胶原纤维。在SAN外周还可见到较多神经节和神经纤维分布(见图9)。2. 3. 2Masson三色染色结果SAN内的胶原纤维染成绿色，细胞成分呈淡红色，SAN周围心肌细胞呈红色。大鼠SAN结构疏松，细胞排列稀疏，与临近的血管壁平滑肌易于区分(见图10)。其内部胶原纤维含量较多，以绿色的胶原纤维构成网架，细胞成分就分布在这些网架结构的间隙中(见图
11)。SAN动脉管壁较厚，其内含丰富的胶原纤维，构成管壁支架，与周围组织内的胶原纤维相互连接(见图12)。2. 4大鼠SAN组织半薄切片定位及超微结构特点2. 4. I半薄切片甲苯胺蓝快速染色定位结果通过甲苯胺蓝快速染色，可将细胞核染成深蓝色，细胞浆呈灰蓝色，包埋介质不着色。大鼠SAN位于上(前)腔静脉壁内，结构较疏松，较周围静脉壁平滑肌染色浅淡(见图13)。根据半薄切片染色结果，对半薄切片进行精确定位。2. 4. 2成年大鼠SAN超微结构特点(I)P细胞超微结构特点
电镜下P细胞多为梭形或卵圆形，单个散在或3-5成群分布。与普通心肌细胞相t匕，体积较小，但胞核相对较大，呈圆形或卵圆形。胞质清亮，细胞器少，分布不规则，多靠近细胞周边，肌丝束少或无，基本上见不到完整的肌节。线粒体较少，大小不等，多呈散在分布(见图14)。P细胞膜表面欠光滑，有许多小凹(见图15)，小凹呈椭圆形，与细胞表面垂直，分布欠规律，其存在增大了细胞表面积，但其功能目前尚不清楚。(2) T细胞超微结构特点电镜下，T细胞为梭形或长圆柱形，大小和形态结构均介于P细胞与普通心肌细胞之间，胞质丰富，粗、细肌丝规则排列， 形成典型的肌节，肌原纤维增多，线粒体丰富，形态多样，与肌原纤维相间排列(见图16)。
权利要求
1.一种对成年大鼠窦房结的定位和取材方法，包括宏观定位和精确取材步骤，其特征是，所述宏观定位是将大鼠窦房结定位于上腔静脉近心端壁内并延伸至右心房与上腔静脉交界区，并用在体缝线打结法标记右上腔静脉；所述精确取材是在宏观定位的基础上，沿上腔静脉远端取下大鼠心脏。
2.权利要求I所述的方法，所述用在体缝线打结法标记右上腔静脉是在大鼠胸腔内寻找右侧上腔静脉，用O号缝线在静脉远心端打结做标记；所述沿上腔静脉远端取下大鼠心脏是沿上腔静脉远端、离断其它与心脏相连的根部大血管，取下完整心脏；然后剪下右心房及与之相连的上腔静脉近心段，分离 并去除上腔静脉周围的结缔组织。
3.权利要求I所述的方法，所述精确取材还包括对取材的窦房结进行固定，方法是先进行组织修剪，修剪的标准是以上腔静脉与右心房交界区为中心，在向上向下各I. 5mm处横断上腔静脉与右心房；然后用滤纸包裹取好的组织入10%中性缓冲福尔马林固定；将固定后的组织脱水后用石蜡包埋。
4.权利要求3所述的方法，所述包埋方向为上腔静脉远端向下、静脉壁立埋。
5.权利要求3或4所述的方法，还包括通过连续切片定位窦房结的步骤，方法是用切片机对石蜡包埋的组织连续切片，切片过程中同时用肉眼观察窦房结在上腔静脉壁的位置和形态，以定位窦房结。
6.权利要求5所述的方法，所述切片方向为自上腔静脉断端至心房，切片厚3μ m ;所述观察窦房结在上腔静脉壁的位置和形态为，当静脉壁局部开始增宽，并且增宽处静脉壁上出现明显动脉管腔时，表明是窦房结开始出现的部位。
全文摘要
本发明涉及对成年大鼠窦房结快速定位及精确取材的方法，大鼠窦房结宏观定位于上腔静脉近心端壁内并延伸至右心房与上腔静脉交界区，采用在体缝线打结法标记右上腔静脉后，沿上腔静脉远端取下大鼠心脏。本发明还涉及对成年大鼠窦房结连续切片肉眼精确定位方法。对取材的窦房结进行固定后连续切片，切片过程中同时用肉眼观察窦房结在上腔静脉壁的位置和形态，以精确定位窦房结。
文档编号A61D1/00GK102961197SQ20121047771
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者彭瑞云, 刘燕青, 高亚兵, 董霁, 姚斌伟, 张静, 赵黎 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所