巴西橡胶树的多倍体的生产方法
【专利摘要】本发明的目的为提供一种对育种新品种非常有用的有效生产巴西橡胶树的多倍体的方法。该方法的特征在于对发根的巴西橡胶树(三叶橡胶树)的种子进行秋水仙素处理。在本发明中，种子优选在发根后发芽前采集。秋水仙素处理优选通过使种子与秋水仙素浓度为400至800ppm的秋水仙素溶液相接触来进行。
【专利说明】巴西橡胶树的多倍体的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及巴西橡胶树(para rubber trees)的多倍体的有效生产方法。
【背景技术】
[0002]天然橡胶为弹性聚合物，其作为橡胶制品的主原料大量广泛地用于各种应用。天然橡胶通过收集由产胶乳植物如橡胶树分泌的胶乳，并使胶乳进行期望的处理来生产。因此，橡胶树，特别是巴西橡胶树(三叶橡胶树(Hevea brasiliensis)),主要在如泰国、马来西亚和印度尼西亚等热带国家商业化种植。
[0003]近年来随着遗传工程领域的发展，已变得可通过插入优选的外源基因来改变天然存在植物的特性。同样在天然橡胶生产领域，已对生产具有期望特性的植物的方法进行了研究，所述植物例如通过遗传改变产胶乳植物的能够产生较高质量胶乳的植物或能够产生大量胶乳的植物。尽管特别优选的方法的实例包括通过遗传重组的分子育种，但必须经过包括再分化和基因插入以获得遗传重组植物的过程。
[0004]主要用于将基因插入植物的方法的实例包括包含通过用农杆菌属物种(一种植物病原体)感染植物细胞来插入基因的方法(农杆菌法)，和包含用基因枪(particle gun)将基因负载的金颗粒射入植物细胞的方法(基因枪法)(参见，例如专利文献I)。
[0005]根据农杆菌法，已存在几种生产巴西橡胶树转化株的成功实例。例如，已公开了通过使用农杆菌属细菌的载体将期望的基因插入源自另一株巴西橡胶树的愈伤组织并由该植物组织再生植物来生产转化的巴西橡胶树的方法(参见，例如专利文献2)。另外，已报道由源自巴西橡胶树的株被(integument)的愈伤组织使用农杆菌法获得转化株(参见,例如非专利文献I)。
`[0006]然而，产胶乳植物如巴西橡胶树具有例如与其它类型植物相比，插入基因的困难较大和基因插入效率极弱的问题。同样在前述实例中，尽管已对通过调整在转染愈伤组织时所用的农杆菌的细菌浓度而对增加基因插入效率进行了研究，但还未获得足够的基因插入效率水平。
[0007]另外，还存在其中可通过增加个体的染色体数改变特性的情况。通常，体细胞为具有生存所需的两组染色体的二倍体，而生殖细胞为具有一组染色体的单倍体。一般来说，具有三组以上的染色体的个体(即，三倍体以上的个体)称作多倍体。在植物中，多倍体倾向于具有比二倍体大的果实等组织，并且还倾向于不形成种子。
[0008]在该方式中，为了获得具有新特性且不引入外源基因的植物新品种，已在植物选择育种的领域中常规进行多倍体育种。例如，其中染色体数加倍的多倍体可通过在秋水仙素溶液中浸溃种子或其它植物组织来生产。由于秋水仙素抑制了细胞分裂期间纺锤体的形成，细胞分裂在用秋水仙素处理的植物中受到抑制。另一方面，由于染色体分离受到抑制而形成了其中染色体数加倍的细胞。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献[0011]专利文献1:日本未审专利申请，第一次公布2005-130815号
[0012]专利文献2:日本专利公布3289021号
[0013]非专利文献
[0014]非专利文献I = Blanc 等，Plant Cell Report, 2006, Vol.24, pp.724-733
【发明内容】
[0015]发明要解决的问题
[0016]尽管多倍体育种在生产具有更期望特性的有用植物新品种方面是重要的，但秋水仙素处理的条件根据植物类型变化很大。因此，必须通过针对各种类型的植物进行重复试错(repeated trial and error)来确定优选的处理条件,并且还未建立在巴西橡胶树中生产有效的多倍体的方法。
[0017]根据前述观点，本发明涉及在巴西橡胶树中有效生产对新品种育种极其有用的多倍体的方法。
[0018]用于解决问题的方案
[0019]作为进行深入研究以解决前述问题的结果，本发明的发明人发现，通过对巴西橡胶树的种子在其已发根后进行秋水仙素处理，可以以比过去高的机率获得多倍体，从而导致本发明的完成。
[0020]即，本发明以下述方式构成。
[0021](1) 一种巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其包括:秋水仙素处理步骤，其中对已经发根的巴西橡胶树(三叶橡胶树)的种子进行秋水仙素处理。
[0022](2)根据上述(I)所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其包括:发根步骤，其中在所述秋水仙素处理步骤之前，通过将所述巴西橡胶树的种子在15°C至25°C下用水含浸来使其发根。
[0023](3)根据上述(I)所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中进行所述秋水仙素处理步骤的所述种子为已发根但还未发芽的种子。
[0024](4)根据上述(I)所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中所述秋水仙素处理步骤为其中将所述种子与秋水仙素浓度为400ppm至800ppm的秋水仙素溶液接触的步骤。
[0025](5)根据上述(4)所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中所述秋水仙素处理步骤为其中将所述种子与所述秋水仙素溶液接触40小时至90小时的步骤。
[0026](6)根据上述(5)所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中所述秋水仙素处理步骤为其中所述种子与秋水仙素浓度为600ppm至800ppm的秋水仙素溶液接触60小时至80小时的步骤。
[0027](7)根据上述(I)至(6)任一项所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中使所述种子在所述秋水仙素处理步骤后发芽和生长。
[0028]发明的效果
[0029]可通过使用本发明的巴西橡胶树的多倍体的生产方法极其有效地生产多倍体。特别地，本发明使得成熟多倍体通过使得用秋水仙素处理的种子以与二倍体种子相同的方式生长而容易地获得。【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为示出实施例1中通过流式细胞术分析二倍体的结果的图。
[0031]图2为示出实施例1中通过流式细胞术分析四倍体的结果的图。
[0032]图3为示出实施例1中通过流式细胞术分析嵌合体的结果的图。
【具体实施方式】
[0033]秋水仙素处理典型地通过不仅处理种子，而且还处理组织如苗(shoots)或叶，以及脱分化处理获得的愈伤组织来进行。例如，在对组织如植物的苗(plant shoot)进行秋水仙素处理的情况下，多倍体植物可通过从组织分离多倍体细胞并使其发根等来再生。另外，在用秋水仙素处理愈伤组织的情况下，多倍体植物可类似地通过常规方法由愈伤组织再生。然而，由来自愈伤组织或来自植物的一部分的组织的植物的再生涉及复杂过程，并且由于其需要适合的植物激素等，因而还是昂贵的。相反，在用秋水仙素处理种子的情况下，多倍体植物可通过以与未处理种子相同的方式培养种子来容易地获得。
[0034]然而，几乎没有多倍体仅通过将巴西橡胶树的种子浸溃在秋水仙素溶液中而获得。本发明的发明人认为，由于巴西橡胶树的种子被硬皮覆盖，秋水仙素不能充分地浸透种子内，从而阻止对巴西橡胶树的种子有效地进行秋水仙素处理。因此，当种皮的一部分被切开时，尽管秋水仙素能够充分地浸透种子内，但种子不能发芽且不能获得多倍体。
[0035]本发明的巴西橡胶树的多倍体的生产方法(还称作〃多倍体生产方法〃)的特征在于对发根后的种子进行秋水仙素处理。作为对发根后的种子进行秋水仙素处理的结果，发现秋水仙素处理可对种子有效进行而不损害种子发芽或生长，并且多倍体植物可通过以与未处理种子相同的方式培养处理的种子来容易地获得。尽管通过在发根后用秋水仙素处理种子而能够有效获得多倍体(其中染色体数为处理前种子的二倍)的理由并不清楚，但推测秋水仙素能够通过根已从硬皮突出的种子的那些部分有效地浸透入种子内。
[0036]对本发明的多倍体生产方法中进行秋水仙素处理的种子没有特别限定，条件是它们已经发根，或者换言之，能够目视确认在其外部有根。在本发明中，发根后的早期的种子如发芽前的种子是更优选的。通过在生长早期对种子进行秋水仙素处理，可获得其中构成植物的几乎所有细胞为多倍体的植物。
[0037]对用于使种子发根的方法没有特别限定，并且可使用在使种子发根时常用的任何方法。例如，可通过使种子在20°C至30°C下在充分浸有水的支持体(support)如一片纱布或组织上静置几天至两周而使种子发根。种子还可包裹在浸有水的支持体中。在本发明中，通过在15°C至25°C下将巴西橡胶树的种子用水含浸而使其发根。尽管对用水含浸种子的持续时间没有特别限定，条件是其为使种子发根的充分的持续时间即可，但是种子优选在其发根后发芽前进行随后的秋水仙素处理。
[0038]对进行本发明的多倍体生产方法中秋水仙素处理的种子没有特别限定，条件是它们是巴西橡胶树的种子即可，并且可为自然存在的二倍体巴西橡胶树的种子，其中已通过基因重组技术等删除基因的一部分的变体，或合并外源基因等的基因重组体。另外，种子可为多倍体如三倍体或四倍体。例如，可获得其中通过对三倍体巴西橡胶树种子进行本发明的多倍体生产方法而使染色体数增加六倍的巴西橡胶树。[0039]通过使种子在它们已发根后与秋水仙素溶液接触来进行秋水仙素处理。对用于使种子与秋水仙素溶液接触的方法没有特别限定，并且种子可浸溃于秋水仙素溶液中，种子可静置于浸有秋水仙素溶液的支持体如一片纱布上，或者种子可包裹在该支持体中。此外，在使用浸有秋水仙素溶液的支持体的情况下，种子的根部分优选与秋水仙素溶液接触。
[0040]对秋水仙素处理期间的温度没有特别限定，条件是温度不损害随后的种子生长即可。另外，秋水仙素处理可在控温环境中或在如未提供有任何特定的温度控制的温室等的环境中进行。在本发明中，秋水仙素处理可在例如0°c至35°C和优选20°C至30°C的温度下进行。为了方便起见，秋水仙素处理还可优选在室温下进行。
[0041]鉴于如用于进行秋水仙素处理的方法和温度以及处理时间等因素，可适当地确定秋水仙素溶液中秋水仙素的浓度。在秋水仙素浓度过低的情况下，秋水仙素不能充分浸透种子内，并且染色体不能加倍。另一方面，在秋水仙素浓度过高的情况下，存在发生畸形的风险。在本发明中，接触种子的秋水仙素溶液中的秋水仙素的浓度优选400ppm至800ppm，更优选 600ppm 至 800ppm。
[0042]鉴于如用于进行秋水仙素处理的方法和温度以及秋水仙素溶液中秋水仙素的浓度等因素，可适当地确定使种子接触秋水仙素溶液的时间量(处理时间)。在处理时间过短的情况下，秋水仙素不能充分浸透种子内且染色体不能加倍。另一方面，在处理时间过长的情况下，存在发生畸形的风险。在本发明中，室温下使种子接触秋水仙素溶液的时间量优选40小时至90小时，更优选60小时至80小时。
[0043]在本发明的多倍体生产方法中，秋水仙素处理优选通过以下来进行:在20°C至30°C的控温环境下或在非控制环境下在浓度为400ppm至800ppm、优选600ppm至800ppm和更优选600ppm的秋水仙素溶液中浸溃发根的种子40小时至90小时、优选60小时至80小时和更优选72小时。
[0044]秋水仙素处 理后，用蒸馏水等洗涤种子以除去残留的秋水仙素，随后以与未处理种子相同的方式根据常规方法培养。例如，在通过使种子在20°C至30°C下在充分浸有水的支持体(substrate)如一片纱布或组织上静置几天而发芽后，通过将种子移植入培养介质，随后在提供充分水的同时培养，从而使多倍体生长。
[0045]例如，四倍体巴西橡胶树可通过对二倍体巴西橡胶树种子进行本发明的多倍体生产方法来生产。三倍体巴西橡胶树可通过培育这些四倍体并将它们与二倍体杂交来生产。
[0046]实施例
[0047]尽管下面通过阐明其实施例来提供本发明的更详细的解释，但本发明不限于下述实施例。
[0048][实施例1]
[0049]室温(约20°C至30°C )下将天然存在的二倍体巴西橡胶树的种子放置在浸有水的一片纱布上几天至一周，并使其发根。将已目视确认发根但还未发芽的这些种子浸溃在秋水仙素浓度为200ppm至800ppm的秋水仙素溶液中2天至5天。随后,在用蒸懼水洗漆后将种子移植至种植机(planter)中。
[0050]从生长的植物采集三片叶子，并通过流式细胞术确认染色体数(倍数性)，并将植物确认为二倍体、四倍体或包含二倍体细胞和四倍体细胞的混合物的嵌合体。结果示于图1至3和表1中。[0051][表1]
[0052]
【权利要求】
1.一种巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其包括: 秋水仙素处理步骤，其中对已经发根的巴西橡胶树(三叶橡胶树)的种子进行秋水仙素处理。
2.根据权利要求1所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其进一步包括: 发根步骤，其中在所述秋水仙素处理步骤之前，通过将所述巴西橡胶树的种子在15°C至25°C下用水含浸来使其发根。
3.根据权利要求1所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中进行所述秋水仙素处理步骤的所述种子为已发根但还未发芽的种子 。
4.根据权利要求1所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中所述秋水仙素处理步骤为其中将所述种子与秋水仙素浓度为400ppm至800ppm的秋水仙素溶液接触的步骤。
5.根据权利要求4所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中所述秋水仙素处理步骤为其中将所述种子与所述秋水仙素溶液接触40小时至90小时的步骤。
6.根据权利要求5所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中所述秋水仙素处理步骤为其中所述种子与秋水仙素浓度为600ppm至800ppm的秋水仙素溶液接触60小时至80小时的步骤。
7.根据权利要求1所述的巴西橡胶树的多倍体的生产方法，其中使所述种子在所述秋水仙素处理步骤后发芽和生长。
【文档编号】A01H1/08GK103607883SQ201280027970
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年6月8日 优先权日:2011年6月10日
【发明者】渡边训江 申请人:株式会社普利司通