专利名称：一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于石斛人工栽培技术领域，具体涉及一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法。
背景技术：
铁皮石斛种苗生产中，一般以果实(种子)作为外植体进行快速繁殖。但该方法繁育的种苗，母体性状受限，性状差异大，品种杂，变异大，容易退化，品质难以保证，优良种性难以保持。而以茎尖或茎段作为繁殖材料，进行组培无性快繁时，虽然可以得到目标性选择强，性状一致，品质一致，纯度高的种苗，但存在着外植体基数小，不易消毒，原球茎分化慢，繁殖周期长，增殖倍数低，无菌体系建立难等技术问题，因此在实际生产中应用不多。
发明内容
本发明的主要目的是提供了一种不仅能保持母体的优良性状，还能实现快速繁殖的铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法。本发明所采取的技术方案是一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下步骤a、外植体准备将外植体整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去35 45% ；然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗后，取无菌滤纸吸去外植体表面水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；b、腋芽及原球茎诱导将所述茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中1/2MS+0. 5 1. 0mg/L6 -BA+0. 2 O. 5mg/LNAA+ 马铃薯汁 10g/L+ 香蕉汁 10g/L+ 琼脂 5g/L+蔗糖20g/L+活性炭O. 5g/L，PH值为5. 2 5. 6 ;其中培养温度为22 28°C，光照强度为1600 2000Lux，光照时间为8小时/天，培养30 40天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，
茎部产生大量原球茎；C、增殖培养将所述芽丛转接到下列增殖培养基中1/2MS+0. 2 O. 5mg/L6-BA+0.1 O. 2mg/L NAA+ 马铃薯汁 5g/L+ 香蕉汁 10g/L+ 活性炭 O. 5g/L+ 琼脂 5g/L+ 蔗糖20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2 3cm的种苗；将所述原球茎转接到下列增殖培养基中l/2MS+0.1 O. 2mg/L6-BA+0. 2 O. 4mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭O. 5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2 3cm的种苗；其中，培养温度为22 28°C，光照强度为2000 2500Lux，光照时间为8小时/天；d、生根壮苗培养将上述种苗转接到下列生根壮苗培养基中l/2MS+0. 2
O.4mg/Ll-BA+0. 2 O. 6mg/L NAA+ 马铃薯汁 5g/L+ 香蕉汁 15g/L+ 活性炭 O. 5g/L+ 琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5. 2 5. 6 ;其中，培养室的温度为22 28°C，培养90天后出瓶移栽即可。
作为优选，所述步骤a中的外植体选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好、抗病强的单株莖干。作为优选，所述步骤a中鲜条内的水份脱去40%。作为优选，所述步骤a中升汞溶液的重量百分比浓度为O. 1%。作为优选，所述步骤a中无菌水冲洗的次数为6次。作为优选，所述步骤b中诱导培养基的PH值为5. 4。作为优选，所述步骤d中生根壮苗培养基的PH值为5. 4。作为优选，所述步骤d中培养90天中前60天的光照强度为2000 2500Lux，光照时间为8小时/天；后30天的光照强度为3500 4000Lux，光照时间为14小时/天。本发明的有益效果在于(I)采用本发明繁殖方法，能很好地解决铁皮石斛无性繁殖中外植体灭菌不充分，污染率高，无菌培养无法进行，原球茎分化慢，分化少，繁殖周期长，生产成本高等技术难度；(2)相比现有方法，本发明繁殖方法能实现快速繁殖，其繁殖周期能减少60天以上；(3)采用发明繁殖方法，所得到的种苗遗传性状稳定，变异小，能较好地保持母本特征、特性，其品种纯正；(4)采用本发明繁殖方法，由于对外植体灭菌彻底，为建立良好的无菌体系提供了基础，从而保证了种苗的质量；(5)本发明繁殖方法，可在实际生产中进行广泛应用，从而为铁皮石斛种植产业的发展提供了保障，具有较好的经济效益和社会效益。
具体实施例方式为使本领域技术 人员详细了解本发明的生产工艺和技术效果，下面以具体的生产实例来进一步介绍本发明的应用和技术效果。实施例一选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好和抗病强的单株茎干作为外植体，整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去40% ;然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用重量百分比浓度为O. 1%的升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗6次后，取无菌滤纸吸去外植体表面的水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；将茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中l/2MS+0. 5mg/L6-BA+0. 2mg/L NAA+马铃薯汁10g/L+香蕉汁10g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L+活性炭O. 5g/L，PH值为5. 4 ;其诱导培养时的培养温度为22°C，光照强度为1600LUX，光照时间为8小时/天，培养时间为40天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎；将芽丛转接到下列增殖培养基中l/2MS+0. 2mg/L6-BA+0. lmg/L NAA+ 马铃薯汁 5g/L+ 香蕉汁 10g/L+ 活性炭 O. 5g/L+ 琼脂 5g/L+ 鹿糖 20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2 3cm的种苗；将原球茎转接到下列增殖培养基中l/2MS+0. lmg/L6-BA+0. 4mg/LNAA+ 马铃薯汁 5g/L+ 香蕉汁 10g/L+ 活性炭 O. 5g/L+ 琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2 3cm的种苗；其中，芽丛和原球茎增殖时的培养温度为22°C，光照强度为2000LUX，光照时间为8小时/天；然后将种苗转接到下列生根壮苗培养基中l/2MS+0. 3mg/Ll-BA+0. 4mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁15g/L+活性炭O. 5g/L+琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5. 4 ;其生根壮苗时的培养温度为25°C，培养90天后出瓶移栽即可，其中前60天培养的光照强度为2000LUX，光照时间为8小时/天，后30天培养的光照强度为3500LUX，光照时间为14小时/天。
实施例二 选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好和抗病强的单株茎干作为外植体，整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去35% ;然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用重量百分比浓度为O. 1%的升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗6次后，取无菌滤纸吸去外植体表面水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；将茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中1/2MS+1. 0mg/L6-BA+0. 5mg/L NAA+马铃薯汁10g/L+香蕉汁10g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L+活性炭O. 5g/L，PH值为5. 6 ;其诱导培养时的培养温度为28°C，光照强度为2000LUX，光照时间为8小时/天，培养时间为30天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎；将芽丛转接到下列增殖培养基中l/2MS+0. 5mg/L6-BA+0. 2mg/L NAA+ 马铃薯汁 5g/L+ 香蕉汁 10g/L+ 活性炭 O. 5g/L+ 琼脂 5g/L+ 蔗糖 20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2 3cm的种苗；将原球茎转接到下列增殖培养基中l/2MS+0. 2mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA+ 马铃薯汁 5gL+ 香蕉汁 10g/L+ 活性炭 O. 5g/L+ 琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2 3cm的种苗；其中，芽丛和原球茎增殖时的培养温度为28°C，光照强度为2500LUX，光照时间为8小时/天；然后将种苗转接到下列生根壮苗培养基中l/2MS+0. 2mg/Ll-BA+0. 6mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁15g/L+活性炭O. 5g/L+琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5. 6 ;其生根壮苗时的培养温度为25°C，培养90天后出瓶移栽即可，其中前60天培养的光照强度为2200LUX，光照时间为8小时/天，后30天培养的光照强度为3800LUX，光照时间为14小时/天。实施例三选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好和抗病强的单株茎干作为外植体，整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去45% ;然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用重量百分比浓度为O. 1%的升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗6次后，取无菌滤纸吸去外植体表面水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；将茎段切去两端，接种到下列诱导培养基 中l/2MS+0. 8mg/L6-BA+0. 2mg/L NAA+马铃薯汁10g/L+香蕉汁10g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L+活性炭0. 5g/L，PH值为5. 2 ;其诱导培养时的培养温度为25°C，光照强度为ISOOLux，光照时间为8小时/天，培养时间为35天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎；将芽丛转接到下列增殖培养基中l/2MS+0. 8mg/L6-BA+0. 3mg/L NAA+ 马铃薯汁 5g/L+ 香蕉汁 10g/L+ 活性炭 0. 5g/L+ 琼脂 5g/L+ 蔗糖 20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2 3cm的种苗；将原球茎转接到下列增殖培养基中l/2MS+0. lmg/L6-BA+0. 3mg/LNAA+ 马铃薯汁 5gL+ 香蕉汁 10g/L+ 活性炭 0. 5g/L+ 琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2 3cm的种苗；其中，芽丛和原球茎增殖时的培养温度为26°C，光照强度为2300LUX，光照时间为8小时/天；然后将种苗转接到下列生根壮苗培养基中l/2MS+0. 3mg/Ll-BA+0. 4mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁15g/L+活性炭0. 5g/L+琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5. 6 ;其生根壮苗时的培养温度为25°C，培养90天后出瓶移栽即可，其中前60天培养的光照强度为2500LUX，光照时间为8小时/天，后30天培养的光照强度为4000LUX，光照时间为14小时/天。
权利要求
1.一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下步骤 a、外植体准备将外植体整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去35 45%;然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗后，取无菌滤纸吸去外植体表面水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段； b、腋芽及原球茎诱导将所述茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中l/2MS+0.5 1. 0mg/L6-BA+0. 2 O. 5mg/L NAA+ 马铃薯汁 10g/L+ 香蕉汁 10g/L+ 琼脂 5g/L+ 蔗糖 20g/L+活性炭O. 5g/L，PH值为5. 2 5. 6 ;其中培养温度为22 28°C，光照强度为1600 2000Lux,光照时间为8小时/天，培养30 40天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎； C、增殖培养将所述芽丛转接到下列增殖培养基中l/2MS+0. 2 O. 5mg/L6-BA+0.1 O. 2mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭O. 5g/L+琼脂5g/L+鹿糖20g/L,反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2 3cm的种苗；将所述原球茎转接到下列增殖培养基中l/2MS+0.1 O. 2mg/L6-BA+0. 2 O. 4mg/LNAA+ 马铃薯汁 5g/L+ 香蕉汁 10g/L+ 活性炭O.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2 3cm的种苗；其中，培养温度为22 28°C，光照强度为2000 2500Lux，光照时间为8小时/天； d、生根壮苗培养将上述种苗转接到下列生根壮苗培养基中l/2MS+0. 2 O. 4mg/L1-BA+0. 2 O. 6mg/L NAA+ 马铃薯汁 5g/L+ 香蕉汁 15g/L+ 活性炭 O. 5g/L+ 琼脂 25g/L+ 蔗糖25g/L，PH值为5. 2 5. 6 ;其中，培养室的温度为22 28V，培养90天后出瓶移栽即可。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于所述步骤a中的外植体选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好、抗病强的单株茎干。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于所述步骤a中鲜条内的水份脱去40%。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于所述步骤a中升汞溶液的重量百分比浓度为O. 1%。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于所述步骤a中无菌水冲洗的次数为6次。
6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于所述步骤b中诱导培养基的PH值为5. 4。
7.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于所述步骤d中生根壮苗培养基的PH值为5. 4。
8.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于所述步骤d中培养90天中前60天的光照强度为2000 2500Lux，光照时间为8小时/天；后30天的光照强度为3500 4000Lux，光照时间为14小时/天。
全文摘要
本发明涉及一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，属于石斛人工栽培技术领域。其方法包括以下步骤外植体准备、腋芽及原球茎诱导、增殖培养和生根壮苗培养。本发明的有益效果是能很好地解决铁皮石斛无性繁殖中外植体灭菌不充分，污染率高，无菌培养无法进行，原球茎分化慢，分化少，繁殖周期长，生产成本高等技术难度，相比现有方法，能实现快速繁殖，其繁殖周期能减少60天以上。另其种苗遗传性状稳定，变异小，能较好地保持母本特征、特性，其品种纯正，从而为铁皮石斛种植产业的发展提供了优质的种苗保证，具有较好的经济效益和社会效益。
文档编号A01H4/00GK103053425SQ20131002327
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者杨宝明, 李永平, 权恒 申请人:杨宝明