专利名称：玉米抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物蛋白质领域，具体而言，本发明涉及能赋予植物(尤其是玉米)除草剂抗性(耐受性)的蛋白及其在植物育种中的应用。
背景技术：
农田中杂草是影响农作物产量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力资源和成本很高，而且不便于农业集约化生产，严重制约了农作物种植向高产、优质和低成本方向的发展进程。因此，除草剂就运应而生，其使用为解决农田草害、促进栽培方式的革新及增产中起了很大的作用。常见的除草剂，包括有磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类等除草剂，目前已经大面积商业推广使用。然而，由于这些除草剂通常也能杀死农作物本身，因此对一般不具有除草剂抗性(耐受性)的农作物而言，除草剂的使用在时间和空间上受到了极大限制，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂。为此，人们研究开发具有除草剂抗性(耐受性)的植物(农作物)，这样可以在种植期间使用除草剂，杀死杂草，但不影响植物本身的生长，由此拓宽了除草剂的使用范围。尽管当前有不少文献报道在某些基因上进行突变再导入野生型植物成为转基因植物，可以给植物带来除草剂抗性，但是实验多针对拟南芥等遗传背景比较清楚的模式植物，但是对于实际种植的农作物，尤其是经过大量前期转基因和/或非转基因育种获得的具有良好性状(同时遗传背景复杂)的农作物来说，往往情况很不乐观，如我们发现，在体外和/或拟南芥导入测试具有除草剂抗性的突变基因，导入玉米等后却发生大量发生了回复丧失除草剂抗性的情况，有些虽然保留了除草剂抗性，但是玉米生长发育不正常而根本无法实践中应用，这很可能是由于玉米中大量基因协同作用的结果。所以，对于复杂遗传背景的植物(如玉米，尤其是改良过的玉米 )，具有除草剂抗性的植物及其真实能起决定性的物质(如蛋白、基因等)目前还没有理论来定向设计出，只能依赖于科研人员艰苦实践而获得，尤其是依赖长期筛选，并且凭借一些运气才能获得。本发明人正是长期而艰苦的研究实践，凭借运气偶然地在玉米自交系京21突变植株中发现了一系列(突变)蛋白，其能够在除草剂存在的条件下基本保持原有蛋白的正常植物生理功能，从而使得玉米(尤其是京21)具有除草剂抗性(耐受性)。本发明人还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，如玉米等。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的使植物具有除草剂抗性的蛋白质。另外，本发明还提供了编码这些蛋白质的核酸以及基因工程中间体(如，表达盒、载体和细胞等)，获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用，并且提供了判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。
具体而言，在第一方面，本发明提供了 ALS突变蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2或4所示。该蛋白质能使植物(如玉米，尤其是京21)具有除草剂抗性。在本文中，ALS就是乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)的简称,其酶分类编号为EC4, 1.3.18。乙酰乳酸合成酶是支链氨基酸合成中的一个关键酶，如在缬氨酸和亮氨酸的合成中催化丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在异亮氨酸的合成中催化丙酮酸与丁酮酸生成2-乙醛基-2-羟基丁酸。本发明第一方面的蛋白质是经过大量筛选从本发明人突变的玉米植株(如，京21)中发现的，能使相应植株具有除草剂抗性。目前，还没有报道表明，在来自玉米的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或4所示的突变蛋白，会使得相应植物(尤其是玉米)具有除草剂抗性，更无法预测在保持除草剂抗性的同时，还能保持正常的生长情况。在本文中，京21，又称京21号，是由中国农业科学院作物科学研究所玉米研究中心开发的玉米自交品系，其具有株型紧凑、抗病性好、抗倒伏以及配合力强等性状特点。本发明人发现该品系可以在高浓度咪草烟的种子浸泡实验中被筛选出抗咪草烟突变植株。公众可以通过商业渠道获取京21，例如可以从中国农业科学院作物科学研究所玉米研究中心购买。除了本发明具体实施方式
所述的突变植株筛选和扩增方法之外，在蛋白质序列已知的情况下，本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入表达载体，就可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质，这些方法记载于《分子克隆实验指南》(北京:科学出版社，2002年)等文献中。通过转基因技术，编码这些蛋白质的基因可以导入植物中，优选导入玉米中，例如导入(野生型)京21中，从而赋予植物抗除草剂性倉泛。目前，以抑制ALS为靶位的除草剂包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸卩密唳类等除草剂(Peter Babczinski, Thomas Zelinsk1.Mode of action herbicidalALS—inhibitors on acetolactate synthase from green plant cell cultures, yeast,and Escherichia col1.Pesticide science, 1991，31:305-323;郑培忠，沈健英.乙酸乳酸合成酶抑制剂的种类及其耐药性研究进展.杂草科学，2009，2:4-8)。因此，在本文中，除草剂抗性指的是对包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类在内的除草剂具有耐受性。优选在本发明中，除草剂是咪唑啉酮类除草剂，如在本发明的具体实施方式
中，除草剂是咪草烟(其化学名称为(RS) 5-乙基-2- (4-异丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)烟酸，CAS号为81335-77-5)。即优选在本发明中，除草剂抗性是咪唑啉酮类除草剂抗性，更优选是咪草烟抗性。在第二方面，本发明提供了核酸，其编码本发明第一方面的蛋白质。在本文中，核酸可以是DNA，也可以是RNA，优选是DNA。在知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本发明第一方面的蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。优选本发明第二方面的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或3所示。在第三方面，本发明提供了表达盒(cassette)，其包含本发明第二方面的核酸。本发明第三方面的表达盒优选在5’ -3’ 的转录方向上包含启动子区、本发明第二方面的核酸和转录和翻译的终止区。本发明第三方面的表达盒优选适合在植物中表达本发明第二方面的核酸。示例性的启动子包括来自CaMV35S启动子或者稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米矮缩I基因或烟草花叶病毒(TMV) Q元件的启动子；示例性的转录和翻译的终止区包括转录终止元件或多聚腺苷酸化信号等。本发明第三方面的表达盒还可以包括，在细菌中复制所需的复制起点(例如，来自PBR322或P15Aori的ORI区)，土壤杆菌T-DNA转移所需要的元件(例如，T-DNA的左边界和/或右边界)，从而方便从细菌往植物中的转化过程。另外，本发明第三方面表达盒还可以包含增强子、内含子、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等，例如来自TMV、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)或苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列等作为增强子，又如可以包括来自Adhl、bronzel、肌动蛋白I或肌动蛋白2的内含子。在第四方面，本发明提供了载体，其包含本发明第二方面的核酸。在本文中，载体是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。根据所应用的目的不同，载体可以分为克隆载体、表达载体和转化载体，指的是所使用的目的分别针对克隆并验证基因、表达相应基因和将相应基因转化。本发明中可用的载体包括但不限于:在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。本发明第四方面的载体是转化载体，尤其是植物转化载体，特别是适合农杆菌转化植物的载体。这些载体很多已经商品化了。在第五方面，本发明提供了细胞，其包含本发明第二方面的核酸。细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。在本文中，植物细胞指的是来自植物的细胞(可以包括细胞群，但优选是单个细胞)，但是这些细胞不能仅仅借助光合作用而以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来发育成存活的单个植株。植物细胞可以是必须使用有机物(如某些植物激素)才能发育的植物细胞或细胞群，也可以是完全无发育成植株能力的植物细胞或细胞群，通俗地说，即死亡的植物细胞或细胞群，如干燥粉碎过的市售小麦面等。本发明的第二方面的核酸可被插入转化进细胞中的任何载体中。优选的细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存核酸、或是用于转化植物细胞的细菌细胞，例如农杆菌、大肠杆菌，包括根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌等。另外优选的细胞是植物细胞，优选是玉米细胞，更优选是京21细胞，所述植物细胞中包含的本发明第二方面的核酸可以是通过转基因技术导入植物细胞的，包括导入到植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中，也可以是通过突变技术(如本发明具体实施方式
所述的技术)使得本发明第二方面的核酸存在于植物细胞中的。 在第六方面，本发明提供了植物，其包含本发明第二方面的核酸，和/或其表达本发明第一方面的蛋白质。由于引入了本发明第二方面的核酸和本发明第一方面的蛋白质，本发明第六方面的植物具有除草剂抗性。在本文中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物就能合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的单个植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品种、植株、植物事件、植物后代、植物种子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通过转基因技术产生的植物后代、与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代。本发明第六方面的植物可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。示例性的植物包括小麦、水稻、玉米、黑麦、燕麦、大麦、大豆、马铃薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西红柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、烟草、或拟南芥等。在本发明的具体实施方式
中，优选本发明第六方面的植物是玉米，更优选是京21。当然，如在本发明的具体实施方式
中，拟南芥也是可选的植物品种。在第七方面，本发明提供了本发明前述各方面在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用。在获得具有除草剂抗性的植物过程中，可以应用到本发明前述各方面。本发明第七方面所提供的包括，本发明第一方面的蛋白质在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第二方面的核酸在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第三方面的表达盒在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第四方面的载体在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第五方面的细胞在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第六方面的植物在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用。优选在本发明的第七方面中，除草剂是咪唑啉酮类除草剂，优选是咪草烟。在本发明的具体实施方式
中，优选本发明第七方面中获得的具有除草剂抗性的植物是玉米，更优选是京21。当然，如在本发明的具体实施方式
中，拟南芥也是可选的植物品种。在本文中，获得包括制备、培育、生产或以其他方式产生得到，包括通过转基因育种方式获得，如将本发明第二方面的核酸转化入植物后使之表达本发明第一方面的蛋白质；也包括通过非转基因育种方式获得，如通过杂交、回交、自交或无性繁殖本发明第六方面的植物并分选出仍旧包含本发明第二 方面的核酸并表达本发明第一方面的蛋白质的植物。因此，本发明的第七方面提供的应用包括，在获得具有除草剂抗性的转基因植物过程中的应用和在获得具有除草剂抗性的非转基因植物过程中的应用。在第一个独立的方面，本发明提供了(野生型)京21在获得具有除草剂抗性的植物(如，玉米)中的应用，优选是在获得包含本发明第二方面的核酸和/或表达本发明第一方面的蛋白质的具有除草剂抗性的玉米中的应用。京21本身具有优良的性状，但是更重要的是，本发明人发现，对它的种子用除草剂(如，咪唑啉酮类除草剂，优选是咪草烟)进行诱变，能够获得具有除草剂抗性的玉米。在第八方面，本发明提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法，其包括如下步骤:(I)使植物包含本发明第二方面的核酸；和/或，(2)使植物表达本发明第一方面的蛋白质。优选在本发明第八方面的方法中，植物是玉米，更优选是京21。当然，如在本发明的具体实施方式
中，拟南芥也是可选的植物品种。可以采用前述或者本领域技术人员能获知的转基因和非转基因方法，使植物包含本发明第二方面的核酸，或者使植物表达本发明第一方面的蛋白质。实施本发明第八方面的方法，能够获得本发明第六方面的植物。优选在本发明的第八方面中，可以采用的步骤包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖步骤。这些步骤本身对于转基因或非转基因育种领域的技术人员来说，都是可以获知并实施的。在第九方面，本发明提供了鉴定本发明第六方面的植物或者本发明第八方面的方法获得的植物的方法，其包括如下步骤:(I)测定所述植物是否包含本发明第二方面的核酸；和/或，(2)测定所述植物是否表达本发明第一方面的蛋白质。通过该方法，可以判断植物是否属于本发明的植物，即是否属于本发明第六方面的植物，或者是否属于本发明第八方面的方法获得的植物。测定的步骤可以通过常规的核酸检测和/或蛋白质检测方法来进行，只需要能够检测出蛋白质或其编码核酸带有如SEQID NO:2或4所示的突变蛋白或其相应核酸突变的方法都纳入本发明。示例性的方法包括蛋白质测序、核酸测序、聚合酶链式反应(PCR)检测、探针杂交检测等。本发明取得的有益效果在于获得可替代现有技术的使植物具有除草剂抗性的蛋白质、核酸、表达盒、载体、细胞、植物、获得具有除草剂抗性的植物的应用和方法、以及鉴定本发明的植物的方法，并且可以通过转基因或非转基因方法获得具有除草剂抗性的植物品种，尤其是能继承京21号优良特性的玉米品种。
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本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的了。
图1显示了抗咪唑啉酮类除草剂的玉米突变植株。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。例如，具体步骤可参见:《Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3rdedition)》(Sambrook, J., Russell, David ff.,2001, Cold Spring Harbor),《Plant Propagation by Tissue Culture》(EdwinF.George, Michael A.Hall, Geert-JanDe Klerk, 2008, Springer)。实施例1从京21号突变植株中提取抗咪唑啉酮类除草剂的蛋白突变体播种各品种/品系玉米，其中包括将玉米自交系京21 (可购自中国农业科学院作物科学研究所玉米研究中心)播种，播种前，将各种玉米种子用咪唑啉酮类除草剂咪草烟((RS) 5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)烟酸，CAS号81335-77-5)水剂(浓度为0.5%，购自山东先达化工有限公司)浸泡18小时，浙干水分后播种于试验田，10天后观察玉米种子萌发情况。经过大量实验筛选，终于偶然发现，其中有绿色秧苗持续生长(图1 )，保留并繁殖这些绿色秧苗，确认其为抗咪唑啉酮类除草剂的京21号突变植株2株，这些植株能够正常生长发育，其余玉米均死亡。分别取各京21号突变植株的叶片，连同野生型的京21号植株叶片，分别提取它们的基因组DNA，委托北京三博远志生物技术有限公司进行测序并进行序列比较，发现:突变植株I相对于野生型京21号，在乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的第518位点发生突变，由C变为T，导致相应编码蛋白的第173位由丙氨酸变为缬氨酸，即该突变植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；突变植株2相对于野生型京21号，在ALS基因的第1626位点发生突变，由G变为T，导致相应编码蛋白的第542位由色氨酸变为半胱氨酸，即该突变植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。实施例2蛋白突变体的抗咪唑啉酮类除草剂的离体活性测定参照Fan ZJ 等的方法(Specific activity determination of acetolactatesynthase from maize (Zea mays L.).参见 Han WN 等编 The Proceedings of thel8thAsia-Pacific Weed Science Society Conference.515-522.May28-June2,2001.Beijing:Standards Press of China.),提取上述京21号的野生型和各突变植株的ALS酶,并测定相应酶活性被咪唑啉酮类除草剂抑制的比率。过程简而言之，分别取各植株苗5g切碎后，加入 IOmL pH7 的 50mmoI/LK2HPO4-KH2PO4 缓冲液(其中含 lmmol/L 丙酮酸钠，0.5mmol/L MgCl2,0.5mmol/L TPP, 10 u mol/L FAD),用石英砂研磨粉碎后用8层纱布过滤,滤液于4°C、20000rpm离心30分钟。取上清液，加入硫酸铵使之达到50%饱和度，然后0°C放置2小时后，于4°C、20000rpm离心30分钟。弃上清液，将沉淀溶解于5mL pH7的50mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液(其中含20mmol/L丙酮酸钠，0.5mmol/L MgCl2),分别得各植株的ALS酶液。将0.1mL0.5%咪草烟水剂(对照用水替代)、0.5mL酶反应液(其中含24mmol/L丙酮酸钠，0.6mmol/LMgCl2，lmmol/L TPP, 20 u mol/L FAD,50mmol/L K2HPO4-KH2PO4, pH7)和 0.4mLALS酶液混合，与35°C避光静置反应I小时，然后加入0.lmL3mol/L硫酸终止反应，于60°C放置15分钟脱羧。然后加入显色剂(0.5ml0.5% (w/w)肌酸和0.5ml5% (w/w) a -萘酹的混合溶液(溶于2.5mol/L的NaOH溶液))于60°C放置15分钟显色，测定525nm处的吸光度。将加入对照的野生型京21号的ALS酶活性分别记为100%，计算咪唑啉酮类除草剂对京21号的野生型和各突变ALS酶的活性的影响。结果如下表所示，京21号的各突变ALS酶都基本保持了野生型ALS酶的活性，而且在存在咪唑啉酮类除草剂的情况下，野生型ALS酶的活性都有十分显著的下降，而各突变ALS酶却都保持了原有酶活性，表明突变ALS酶能够带来抗咪唑啉酮类除草剂的性能。咪唑啉酮类除草剂对京21号的野生型和突变ALS酶活性的影响表
权利要求
1.ALS突变蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2或4所示。
2.权利要求1所述的蛋白质，其中除草剂是咪唑啉酮类除草剂，优选是咪草烟。
3.权利要求1或2所述的蛋白质，其来自玉米，尤其是京21。
4.核酸，其编码权利要求f3之任一所述的蛋白质，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO:I或3所示。
5.表达盒、载体或细胞，其包含权利要求4所述的核酸。
6.权利要求f3之任一所述的蛋白质、权利要求4所述的核酸、权利要求5所述的表达盒、载体或细胞、包含权利要求4所述的核酸的植物、表达权利要求f 3之任一所述的蛋白质的植物、或者京21在获得具有除草剂抗性的植物中的应用，优选其中除草剂是咪唑啉酮类除草剂，优选是咪草烟。
7.获得具有除草剂抗性的植物的方法，其包括如下步骤: (1)使植物包含权利要求4所述的核酸；或， (2)使植物表达权利要求f3之任一所述的蛋白质。
8.权利要求7所述的方法，其包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖步骤。
9.权利要求6或7所述的应用或方法，其中所述植物是玉米。
10.鉴定植物的方法，其中植物是包含权利要求4所述的核酸的玉米、表达权利要求广3之任一所述的蛋白质的玉米、或者权利要求7、8或9所述的方法获得的植物(如，玉米)，其包括如下步骤: (1)测定所述植物是否包含权利要求4所述的核酸；或， (2)测定所述植物是否表达权利要求f3之任一所述的蛋白质。
全文摘要
本发明提供了使植物具有除草剂抗性的ALS蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO2或4所示。另外，本发明还提供了相应的核酸、表达盒、载体、细胞、植物、获得具有除草剂抗性的植物的应用和方法、以及鉴定本发明的植物的方法。
文档编号A01H1/02GK103103176SQ20131004238
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月1日 优先权日2012年11月22日
发明者黄拔严, 石久英 申请人:北京兴博雅生物技术有限公司